La proteina endoteliale lipasi è promettente biomarcatore urinario per la diagnosi di cancro gastrico

La proteina lipasi endoteliale è biomarcatore urinario promettente per la diagnosi di cancro gastrico
Abstract
sfondo
cancro gastrico è uno dei tumori maligni più comuni nel mondo. Trovare biomarker diagnostici efficaci nelle urine o nel siero rappresenterebbe la soluzione più ideale per individuare il cancro gastrico durante l'esame fisico annuale. Questo studio è stato quello di valutare il potenziale di endoteliale lipasi (EL) come biomarker urinario per la diagnosi di cancro gastrico.
Metodi
I livelli di espressione di EL è stata misurata utilizzando Western blotting e gli esperimenti di colorazione immunoistochimica su (tessuto, siero, e urine) campioni di pazienti affetti da cancro gastrico rispetto
persone sane. Abbiamo anche controllato i livelli di EL nei campioni di urina di altri tipi di cancro (polmone, colon e del retto tumori) e lesioni benigne (gastrite e leiomioma gastrico) per controllare se EL era specifico per il cancro gastrico.
Risultato
Abbiamo osservato una netta separazione tra i livelli di espressione EL nei campioni di urine di 90 pazienti affetti da cancro gastrico e di 57 volontari sani. E 'stato di circa 9,9 volte diminuzione media dei livelli di espressione EL nei campioni di urina di cancro gastrico rispetto ai controlli sani (P
< 0,0001), raggiungendo un valore AUC 0,967 per il ROC (receiver operating characteristic) della curva, a dimostrazione è estremamente preciso come marcatore diagnostico per il cancro gastrico. È interessante notare che i livelli di espressione di EL in campioni di tessuto e di siero non erano quasi come discriminante come nei campioni di urina (P = 0,90
e P
= 0,79). In esperimenti di immunoistochimica, espressione positiva della proteina EL è stata trovata nel 67% (8/12) dei gastrica adiacenti noncancerous e nel 58% (7/12) dei campioni di cancro gastrico. Non vi era alcuna significativa statistica nei livelli di espressione di questa proteina tra il cancro gastrico e le corrispondenti tessuti non tumorali (p = 0,67)
.
Conclusioni
Il EL urinaria come estremamente preciso biomarker cancro gastrico che è potenzialmente . applicabili alla proiezione generale, con elevata sensibilità e specificità
diapositive virtuali
la slitta virtuale (s) per questo articolo può essere trovato qui: http:... //www diagnosticpathol gia diagnomx eu /vs /4527331618757552
Parole
endoteliale lipasi biomarker del cancro gastrico Diagnosi Sfondo
cancro gastrico è uno dei tumori maligni più comuni nel mondo, che rappresenta la terza causa di morte per cancro negli uomini e la quinta principale causa nelle donne [1]. Circa due terzi dei casi di cancro gastrico si verificano nei paesi meno sviluppati, che sono quasi tre volte pro capite più elevato che nei paesi sviluppati, come i paesi europei e Nord America [2]. cancro gastrico ha alti tassi di mortalità dal momento che non ha sintomi clinici evidenti nella fase iniziale. Gli studi suggeriscono che, se è stato rilevato e asportato in fase precoce il tumore, il tasso medio di sopravvivenza a 5 anni è relativamente alto [3, 4]. Pertanto, la diagnosi precoce e il trattamento rappresentano una chiave per migliorare la prognosi dei pazienti affetti da cancro gastrico.
Anche se grandi quantità di sforzo è stato messo nello sviluppo della tecnologia per facilitare la diagnosi mediante gastroscopia e l'analisi immunoistochimica, la natura invasiva di queste procedure rende impraticabile per lo screening su larga scala per il cancro gastrico. biomarker diagnostici efficaci nelle urine o nel siero rappresenterebbero la soluzione più ideale al problema, che permette di test per il cancro gastrico attraverso esami del sangue o delle urine durante gli esami fisici annuali. Diversi marcatori sierici diagnostici sono stati proposti per il cancro gastrico, ad esempio [5] MG7-Ag, antigene carcinoembrionario (CEA), MUC1 e MUC5AC [6]. Lo stato della tecnica è che praticamente tutti loro soffrono piuttosto basse sensibilità e specificità nella diagnosi del cancro, e quindi non sono stati ampiamente utilizzati clinicamente [7]. Rispetto ai tessuti e siero, raccolta delle urine è relativamente più facile e meno invasiva. Essa può essere più adatto per lo screening su larga scala per il rilevamento del cancro [8]. Utilizzando analisi proteomica comparative, un certo numero di potenziali biomarcatori urinari sono stati proposti e ben collaudato per altri tipi di tumori, come il cistatina B e clusterina per il cancro della vescica [9, 10], carbonica IX anidrasi e catepsina D per il carcinoma renale [11, 12], e Adam-12 per il cancro al seno [13]. Per il cancro gastrico, sono stati segnalati diversi biomarcatori, come pepsinogeno I, prostaglandina E2, e solubile c-erbB-2 [14-16]. La capacità diagnostica attuale per il cancro gastrico è ancora essere accuratamente valutato, in quanto non sono stati ampiamente utilizzati nella diagnostica clinica. Pertanto, non vi è chiaramente un bisogno urgente per l'identificazione e la validazione di marcatori diagnostici innovativi e affidabili per lo screening del cancro gastrico.
Abbiamo già realizzato uno studio di biologia del sistema per identificare potenziali biomarcatori candidati per la diagnosi di cancro gastrico. In questo studio, abbiamo analizzato i dati di espressione genica di 80 coppie di tessuti di cancro gastrico e tessuti non tumorali adiacenti raccolti da pazienti affetti da cancro gastrico utilizzando chip microarray, e identificato centinaia di geni differenzialmente espressi nel tumore rispetto
tessuti di controllo [17 ]. Abbiamo poi allenati una macchina Support Vector (SVM) classificatore base per prevedere quali di questi geni espressi in modo differenziale possono avere le loro proteine ​​escreto nelle urine. Tra la proteina escretore previsto, abbiamo trovato EL mostra alto potere discriminante in termini di espressione in campioni di urine di pazienti affetti da cancro gastrico rispetto
persone sane [18].
Qui estendiamo il nostro precedente studio con l'obiettivo di (a) ulteriori confermare che EL ha elevato potere discriminante tra i campioni di urine di pazienti affetti da cancro gastrico e persone sane nel corso di un insieme più ampio di campioni, e (b) dimostrare che EL è altamente specifico per il cancro gastrico, confrontando le sue abbondanze nei campioni di urina di cancro gastrico con altri tipi di tumore tipi e lesioni benigne.
Metodi
raccolta del campione
Tutti i campioni sono stati raccolti in tre ospedali di Jilin University Norman Bethune Medical college, Changchun, in Cina e presso l'Ospedale Cancer affiliato con Xinjiang Medical University, Urumqi, Cina. I tessuti di cancro gastrico e dei tessuti non tumorali corrispondenti sono stati asportati chirurgicamente da pazienti affetti da cancro gastrico. I campioni di urina casuale di cattura del siero e la mattina sono stati ottenuti dai pazienti affetti da cancro prima dell'intervento chirurgico. Questi campioni sono stati raccolti campioni, nel periodo da marzo 2011 al settembre 2012. Un totale di 90 casi di cancro gastrico (67males e 23 femmine; fascia di età: 31-85 anni) e 57 volontari sani (30 maschi e 27 femmine; fascia di età : sono stati studiati 29-76 anni). I casi di cancro gastrico sono stati diagnosticati da istologica analisi come tipo intestinale e diffusa secondo la classificazione Lauren. Inoltre, campioni di urine sono stati ottenuti da 9 pazienti Cancro ai polmoni, 10 pazienti affetti da cancro del colon, i malati di cancro del retto 10, 2 pazienti gastrite, e 2 pazienti leiomioma gastrici, che vengono utilizzati per controllare se EL è specifico per il cancro gastrico. I seguenti criteri sono stati utilizzati per la raccolta del campione: i pazienti (i) tumorali non avrebbero dovuto iniziare qualsiasi trattamento sul loro cancro; e (ii) volontari nel gruppo di controllo non deve avere alcuna malattia sistemica grave in passato. Un modulo di consenso informato scritto è stato firmato da tutti i partecipanti dopo che sono stati informati circa lo scopo dello studio, che è stato approvato dai comitati etici di ricerca presso l'Università di Jilin College of Medicine e Xinjiang Medical University, rispettivamente. La tabella 1 riassume le informazioni dei volontari sani e pazienti coinvolti in questo study.Table 1 Le informazioni di volontari sani e pazienti coinvolti in questo studio
Caratteristiche
tessuto
Siero

urina
12
12
90
L'età media del cancro gastrico
(range)
60 (42-76)
63 (84-39)
60 (31-85)
genere
Maschio
6 7
67
femminile
posizione 6
5
23
Tumor
Cardia
3
2
39
Body
5
6
26
Antrum
3
4
16
Diffuse
1
0
9
Operation
Gastrectomia totale 4
5
29
subtotale gastrectomia Pagina 8 7
61
Lauren classificazione
intestinale
5 Pagina 4
39
Diffuse 7
8
51
tipo Istologia
alta o moderata
5
5
43
scadente o indifferenziata 7 7
47
tumorali fasi
Ι e ΙΙ Pagina 2 4
31
ΙΙΙ e ΙV 10
8
59
profondità dell'invasione
T1 e T2
5
9
30
T3 e T4
7 3
60
nodo stato
N0 3
3
29
N1 e N2
9
9
61
Metastasi stato
M0
5
10
71
M1
7 2
19
cancro del polmone -
-
9
L'età media (range)
46 (42- 57)
cancro del colon -
- 10
L'età media (range)
53 (46-65)
del retto -
-
9
L'età media (range)
62 (47-78)
sano
12
12
57
L'età media (range)
60 (42 -76)
54 (41-72)
47 (29-76)
/infiammazione cronica
Gastrite - Francia - 2
L'età media (range)
56 (43-69)
alla gastrite leiomioma 2
L'età media (range) -
-
56 (51-62)
Western blotting analisi
I tessuti sono stati macinati in polvere in azoto liquido e poi lisate in tampone di estrazione di proteine ​​[0,5 mol /L Tris · Cl (pH 7,4), 150 mmol /L di NaCl, 0,1 mmol /L etilendiammina tetra aceticacid (EDTA) (pH 7,0) , 1 mmol /L phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), 2,5 mg /mL aprotinina, 1 mmol /L ditiotreitolo (DTT), 1% Triton X-100, 1% desossicolato di sodio (SDS)]. Tutti i reagenti sono stati acquistati da Beyotime (Beyotime, Shanghai, Cina). I campioni di siero e delle urine sono stati conservati in presenza di inibitore della proteasi (Roche, Basilea, Svizzera) contenitori sterili e centrifugati (1.000 × g per 10 minuti a 4 ° C) per rimuovere i componenti cellulari. I supernatanti sono stati raccolti e conservati a -80 ° C (stoccaggio più lungo per 6 mesi). 2 ml campioni di urina sono stati dializzati contro acqua distillata attraverso una membrana filtrante (Dinguo, Pechino, Cina) di 8 kDa cutoff a 4 ° C e poi liofilizzati a -20 ° C. campioni di urina liofilizzati sono stati risospesi in 10 mM di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (pH 7,5). concentrazioni di proteine ​​sono stati misurati utilizzando il BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Shanghai, Cina). livelli di creatinina urinaria sono stati quantizzati con il metodo picrato alcalino (reazione di Jaffe), con creatinina un test di routine semi-autoanalyser (Vital Micro 300, Paesi Bassi).
Western Blot è stato utilizzato per misurare i livelli di espressione di EL. 20 ug di proteine ​​totali sono state usate nell'esperimento. Tutti i campioni sono stati separati usando 4-15% SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories Inc., USA) e trasferite su una membrana di PVDF (Bio-Rad Laboratories Inc., USA). La membrana è stata incubata in una soluzione di latte blocco 5% per 2 ore a temperatura ambiente. La membrana è stata incubata con un anticorpo primario EL policlonale di capra anti-umano (1: 400; Santa Cruz Biotechnologies, USA) a temperatura ambiente per 1 ora, che è stato lavato tre volte per 5 minuti in tampone fosfato salino (PBS) e poi reagito con un anticorpo di coniglio anti-capra secondario (1: 5000; Beyotime, Shanghai, Cina). Per i tessuti, l'anticorpo β-actina (1: 1000; Santa Cruz Biotechnologies, USA) è stato recubated per garantire la parità di carico. Alla fine, la membrana è stata completamente ricoperto con una quantità uguale di enhancer e soluzione di perossido da un ECL inclusa Kit (Beyotime, Shanghai, Cina) per 1 minuto, quindi tutte le membrane sono state esposte al film. La densità della band è stata quantificata mediante Gel System Image (Tanon, Shanghai, Cina). L'importo fisso pari a 1 ng purificata EL standard (R & S sistemi, Inc., USA) è stato utilizzato come controllo positivo per la calibrazione. Con considerazione le variazioni di produzione di urina e l'escrezione, densitometria di EL dalle urine è stato espresso rispetto alle concentrazioni di creatinina urinaria.
Immunoistochimica
Per misurare i livelli di espressione di EL nel cancro rispetto
adiacenti tessuti non tumorali di controllo, entrambi i tipi dei tessuti sono stati fissati per 12-16 ore a 4% para-formaldeide (pH 7,0), inclusi in paraffina e tagliate in 4 sezioni micron di spessore. Inoltre vetrini sono stati cotti a 60 ° C per 30 minuti. Paraffina è stata rimossa utilizzando xilene per 30 minuti, e le sezioni sono state reidratate attraverso una serie di soluzioni alcoliche prima del trattamento con acido citrico 1 mM, pH 6,0, a 100 ° C per 5 minuti e 1% H 2O 2 per 30 minuti. Dopo essere stati lavati con acqua distillata, le sezioni sono state incubate a temperatura ambiente con 5% siero suino in PBS per 30 minuti e EL anticorpo (1: 400; Santa Cruz Biotecnologie, USA) diluiti in PBS a 4 ° C, lavate tre volte per 5 minuti in PBS. Gli anticorpi legati sono state visualizzate con il colore del reagente diaminobenzidina (Bios, Pechino, Cina). Le sezioni sono state contrastate con ematossilina di Mayer. Due patologi senza la conoscenza dello stato clinico del paziente valutate tutte le sezioni colorate indipendente. Le cellule sono state contate ad alto ingrandimento, in ciascun caso (× 400), e la percentuale di cellule colorazione positiva è stata calcolata. La percentuale di cellule che presentano espressione EL è stato classificato come segue: 0 = meno del 10%; 1 = 11% -50%; 2 = 51% -75%; 3 = oltre il 75%. L'intensità della colorazione è stato classificato dalla intensità relativa come segue: 0 = negativo; 1 = debole; 2 = intermedio; 3 = forte colorazione. I punteggi proporzione e l'intensità sono stati poi moltiplicato per avere un indice di punteggio totale. Per analisi statistiche, punteggi inferiori a 2 sono stati considerati negativi, e decine di 2 o superiore sono stati considerati positivi.
Analisi statistica
Il test chi-quadrato e rank test di Wilcoxon firmato sono stati usati per analizzare i livelli di espressione di EL in il cancro associato e campioni di tessuto non tumorali. Per analizzare la differenza dei livelli di espressione EL nei campioni di siero e delle urine tra i malati di cancro gastrico ed i controlli sani, rispettivamente, è stato utilizzato il test di Mann-Whitney. Il test del chi-quadrato è stato impiegato per valutare la relazione tra i livelli di espressione urinari EL e variabili clinico-patologiche. La potenza esigenti livelli di espressione di EL nell'urina tra campioni dal gruppo di cancro e di controllo è stata esaminata usando l'curva ROC (ROC) e l'area sotto la curva ROC (AUC). Tutti i test sono stati due coda e un P
-value < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software statistico GraphPad Prism 5
. Risultati
livelli di espressione EL nelle urine
Per l'analisi semi-quantitativa di proteine ​​nelle urine, abbiamo usato relativi livelli di espressione EL rispetto a quella del creatinina urinaria in ogni campione di normalizzare EL espressione in diversi campioni di urina. Abbiamo osservato una netta separazione tra i livelli di espressione EL nei campioni di urine di 90 pazienti di cancro gastrico (1.39 ± 0.68) e di 57 volontari sani (0,14 ± 0,32). Abbiamo osservato una diminuzione media di circa 9,9 volte dei livelli di proteina EL nei campioni di urina di pazienti affetti da cancro gastrico rispetto ai controlli sani (P
< 0,0001). I risultati possono essere visti nella Figura 1A e figura 2A. Abbiamo tracciato la curva ROC per la precisione la classificazione secondo i livelli di espressione EL in tutti questi campioni di urine, per fornire una visione d'insieme del potere di discernimento della proteina. Si noti che la AUC fornisce un indice ampiamente accettato per misurare la qualità del classificatore sottostante con AUC = 1.0 rappresenta perfetta classificazione e AUC = 0,5 rappresenta nessuna separazione. EL ha raggiunto un valore AUC a 0,967 con l'intervallo di confidenza del 95% (CI) essendo [0,942-0,993], indicando che EL urinaria può servire come un promettente biomarker cancro gastrico a scopo diagnostico (Figura 2B). Figura 1 Un rappresentante analisi Western Blot di abbondanza di proteine ​​EL. corsia Controllo positivo (+) conteneva il prodotto standard EL commerciale, che è stato utilizzato per normalizzare la risposta del segnale in tutti i gel. (A), L'abbondanza di EL proteine ​​su campioni di urina; (B), EL abbondanza su campioni di tessuto di cancro e corrispondenza dei campioni tumorali di pazienti affetti da cancro gastrico con nessun trattamento. Il β-actina serve come un controllo di carico interno per stimare i livelli relativi di proteine ​​di abbondanza; (C), EL abbondanza di proteine ​​nei campioni di siero.
Figura 2 urinaria EL abbondanze di proteine ​​nei pazienti affetti da cancro gastrico rispetto ai controlli sani. Ogni punto di dati è un individuo. (A), EL abbondanza in campioni di pazienti affetti da cancro gastrico significativamente inferiore a quello in campioni provenienti da controlli sani; (B), curve ROC di proteine ​​urinarie EL. Il valore AUC era 0,967.
Notiamo che la band EL in Western Blot era assente nei campioni di urina di 71 dei 90 pazienti affetti da cancro gastrico e tutti i 57 volontari sani hanno la band EL nei loro campioni di urina. Utilizzando assenza /presenza della banda EL come cutoff nel chiamare una persona avente cancro allo stomaco o meno, i dati dà luogo ad una sensibilità chiamando al 79% [95% CI, 0,690-0,867] e specificità del 100% [95% CI, 0,937-1,000].
Abbiamo poi esaminato i livelli di espressione EL in campioni di urina dei pazienti affetti da cancro gastrico e il suo rapporto con i vari fattori clinico-patologici, cioè genere, differenziazione istologia, stadio del tumore, l'invasione, e lo stato di metastasi. Non ci sono significative relazioni statistiche tra i livelli di espressione EL e qualsiasi di questi fattori possono essere rilevati. La correlazione tra i livelli di espressione urinari EL e dei fattori clinico-patologici sono presentati nella Tabella 2 Correlazione tra 2.Table urinario EL espressione e clinico-patologici caratteristiche
clinicopatologico (n)
EL assente (%)

EL presente (%)
P
n = 71
n = 19
genere
Maschio, (67)
51 (72)
16 (84)
0,27
femminile, (23)
20 (28) Pagina 3 (16)
tipo istologico
alta o moderata, (43)
31 (44)
12 (63)
0,13
scadente o indifferenziata, (47)
40 (56) Pagina 7 ( 37)
Lauren classificazione
intestinale, (39)
29 (41)
10 (53)
0,36
diffusa, (51)
42 (59)
9 (47)
stadi tumorali
Ι e ΙΙ, (31)
22 (31)
9 (47)
0,18
ΙΙΙ e ΙV, (59)
49 (69)
10 (53)
profondità dell'invasione
T1 e T2, (30)
21 (30)
9 (47)
0,14
T3 e T4, (60)
50 (70)
10 (53)
nodo stato
Assente, (29)
23 (32)
6 (32)
0.95
Presente, (61)
48 (68)
13 (68)
stato Metastasi
M0 (71)
55 (77)
16 (84)
0.52
M1 (19)
16 (23) Pagina 3 (16)
Abbiamo inoltre verificato se EL è specifico per il cancro gastrico. Come uno sforzo iniziale, abbiamo esaminato i livelli di espressione EL in campioni di urina di altri tre tipi di cancro (polmone, colon e del retto tumori) e lesioni benigne (gastrite e leiomioma gastrico). Il test è stato fatto su campioni di urina di 9 cancro al polmone, 10 cancro del colon, del retto 10, 2 gastrite, e 2 pazienti leiomioma gastrici. Chiaramente possiamo vedere che 9 su 9, 9 su 10, 10 su 10, 2 su 2 e 2 su 2 campioni hanno la band EL nei campioni di urina di tumori polmonari, tumori del colon, del retto, gastrite e pazienti leiomioma gastrici, rispettivamente (Figura 3). Mentre questo risultato non garantisce che la mancanza di EL nelle urine è un indicatore di soli cancro gastrico, ciò suggerisce fortemente che EL è altamente specifico. test più grandi sarà fatto nel nostro studio di follow-up, che coinvolgerà molti più pazienti di altre malattie possibilmente correlati al cancro gastrico, come il cancro al pancreas e il cancro dell'esofago. Figura 3 abbondanze EL in campioni di urina di altri tipi di cancro e lesioni benigne. (A), nove campioni di tumore del polmone; (B), Dieci campioni di tumore del colon; (C), Dieci rettale cancro campioni; (D), due gastriti e due campioni leiomioma alla gastrite. (+) Il controllo positivo corsia.
Livelli di espressione EL in tessuti e sieri
Lo studio indica che la proteina EL è assente nei campioni di urina cancro gastrico. Considerando che l'urina contiene sia proteina secreta dal urothelium così come le proteine ​​dalla lisi al plasma o cellulare, abbiamo anche esaminato i livelli di espressione EL nel tessuto o nel siero dei pazienti affetti da cancro gastrico, al fine di dedurre le ragioni di questa assenza osservato. Western Blot è stata effettuata per misurare i livelli di espressione EL in campioni di tessuto di cancro e corrispondenti campioni tumorali di 12 pazienti affetti da cancro gastrico non trattati (Figura 1B). è stata osservata alcuna differenza significativa nei livelli di espressione di EL tra i campioni di tessuto di cancro gastrico ed i campioni tumorali corrispondenti (rank test firmato di Wilcoxon, P
= 0,90).
Negli esperimenti di colorazione immunoistochimica, abbiamo scoperto che i granuli marroni prevalentemente apparso nel citoplasma (Figura 4). espressione positiva della proteina EL è stato trovato nel 58% (7/12) di cancro gastrico e nel 67% (8/12) di campioni tumorali adiacenti gastrici (Tabella 3). Non c'era alcuna differenza nei livelli di espressione di questa proteina tra il cancro gastrico e le corrispondenti tessuti non tumorali (test chi-quadro, P = 0.67)
. Abbiamo inoltre esaminato ogni possibile relazione tra i livelli di espressione EL e potenzialmente rilevanti fattori clinico-patologici menzionati in precedenza. è stata rilevata alcuna relazione. I risultati sono presentati nella Tabella 4. Figura 4 L'analisi immunoistochimica di EL nei tessuti di cancro gastrico e la congruenza dei campioni non tumorali. I granuli marroni di EL prevalentemente apparso nel citoplasma. tessuti adiacenti non tumorali colorati con (A) (× 400). tessuti tumorali colorate con (B) (× 400).
Tabella 3 EL espressione nel carcinoma gastrico e noncance adiacente campioni Rous
n
L'espressione della proteina EL

P
negativo positivo

controllo Adiacente
12
4 (33%) Pagina 8 (67%)
0.67
cancro gastrico
12
5 (42%) Pagina 7 (58%)
Tabella 4 El espressione e clinico-patologici fattori nei tessuti di cancro gastrico
clinicopatologico
n
EL
P
negativo positivo

genere
Maschio
6 Pagina 2 4
0.56
femminile
6
3 3
Età (anno)
≤50 3
1 2
0.74 Hotel > 50

• caratteristiche clinico-patologiche e analisi prognostica della classificazione Lauren in adenocarcinoma gastrico in China
• MicroRNA-206 sopprime la crescita delle cellule del cancro gastrico e metastasi