La curcumina migliora espressione di SCF /c-kit attraverso attenuare lo stress ossidativo e l'attivazione di NF-kB nei tessuti gastrici di diabetica curcumina gastroparesi rats

migliora espressione di SCF /c-kit attraverso attenuare lo stress ossidativo e l'attivazione di NF-kB nei tessuti gastrici di ratti gastroparesi diabetica
Abstract
sfondo diabete mellito è associata a molti tipi di complicazioni. Recenti studi hanno dimostrato che lo stress ossidativo e reazioni infiammatorie hanno ruoli critici nella patogenesi della gastroparesi diabetica. La curcumina è noto per avere proprietà antiossidanti e anti-infiammatori. In questo studio, abbiamo studiato l'effetto della curcumina sulla diabetica motilità gastrica in un modello di ratto Sprague Dawley di tipo 1 diabete mellito.
Metodi
ratti maschi SD sono stati divisi in un gruppo di controllo, un gruppo di controllo che riceve la curcumina, un gruppo diabetico, e un gruppo diabetico ricezione curcumina. Il diabete è stato indotto da un'iniezione intraperitoneale di streptozotocina. La curcumina (150 mg /kg) è stato dato intragastricamente per 6 settimane, ed i livelli di glucosio nel sangue e del peso corporeo sono stati misurati. Stomaci sono stati asportati per l'analisi dei tassi di svuotamento gastrico, e livelli di stress ossidativo. NF-kB, I-kB, e fattore delle cellule staminali (SCF) /livelli di proteina c-kit sono stati valutati mediante analisi di Western Blot, mentre l'apoptosi delle cellule interstiziali di Cajal (ICC) è stata valutata mediante TUNEL.
Risultati
ratti diabetici curcumina-trattati hanno mostrato significativamente migliorato i tassi di svuotamento gastrico [(59,4 ± 7,5)%] rispetto ai ratti diabetici [(44,3 ± 5,7)%], così come diminuzione dei livelli di MDA [21.4 ± 1.8 (nmol /mg) vs
27.9 ± 2.1 (nmol /mg)], e una maggiore attività SOD [126.2 ± 8.8 (unità /mg) vs
107,9 ± 7.5 (unità /mg)]. D'altra parte, il livello di svuotamento gastrico del gruppo di controllo non era significativamente differente da quella del gruppo di controllo riceve un trattamento di curcumina. Inoltre, ratti diabetici trattati con curcumina ha mostrato in modo significativo aumento dei livelli di proteina SCF /c-kit nei tessuti dello stomaco, inibita la degradazione I-kB e l'attivazione di NF-kB, e ha ridotto l'indice CPI apoptosi [(26,2 ± 4,1)% vs
(47,5 ± 6,2)%], rispetto al gruppo diabetico.
Conclusione
trattamento curcumina migliora lo svuotamento gastrico, bloccando la produzione di stress ossidativo, l'abolizione del segnale NF-kB trasduzione e migliorare l'espressione di SCF /c-kit in ratti con gastroparesi diabetica.
Parole
curcumina lo stress ossidativo diabetico gastroparesi NF-kB fattore delle cellule staminali /c-kit cellule interstiziali di Cajal Introduzione
gastroparesi diabetica è una malattia del tratto digestivo, definita come ritardato svuotamento un pasto solido, ed è visto nel 30-50% dei pazienti con tipo 1 o tipo 2 diabete mellito [1]. I pazienti spesso presentano sintomi del tratto gastrointestinale superiore, come la sazietà precoce, perdita di peso, gonfiore addominale, disturbi addominali, nausea, vomito si verificano di frequente, e compromissione del controllo glicemico, e la malattia colpisce gravemente la qualità della vita dei pazienti.
Gastroparesi è sempre più riconosciuto come un importante problema di salute. Anche se gastroparesi colpisce molti diabetici in tutto il mondo, non solo sono le opzioni di trattamento molto limitata, ma anche i trattamenti che sono disponibili per gastropatia diabetica sono spesso inefficaci. Questi includono la terapia medica, stimolazione elettrica gastrica, terapia chirurgica, e il supporto nutrizionale. Farmaci per gastroparesi comprendono metoclopramide, domperidone, cisapride, ed eritromicina. Mentre questi agenti sono stati utilizzati per il trattamento di gastroparesi, sono stati segnalati per essere solo limitata efficacia, e molti pazienti non possono tollerare a causa dei loro effetti collaterali. In pazienti diabetici con gastroparesi refrattaria, ad alta frequenza di stimolazione elettrica gastrica da un sistema impiantato permanentemente migliorato significativamente i sintomi del tratto digerente superiore e rappresenta una terapia chirurgica alternativa a pazienti. Le procedure chirurgiche, come la gastrectomia e antrectomia sono l'ultima opzione per il trattamento, essere controverso e ha bisogno di più di studio [2]. Nei pazienti con gastroparesi grave ma normale piccola motilità intestinale, digiunostomia tubo di alimentazione può essere applicata. Mentre questo fornisce supporto nutrizionale, non cura gastroparesi [3]. gastroparesi diabetica è generalmente meglio trattata medico, e solo i pazienti con grave gastroparesi diabetica che non hanno risposto alla terapia medica deve essere sottoposto ad altre terapie. Così, trovando farmaci che mostrano l'efficacia nel trattamento di gastroparesi diabetica è necessario.
Gastroparesi diabetica è associata con una perdita di cellule interstiziali di Cajal (ICC) sia nell'uomo e negli animali modello [4]. ICC possono essere identificati nei tessuti mediante l'etichettatura con antisieri al kit recettore tirosina chinasi, una proteina espressa su ICC. Kit e il suo fattore di cellule staminali ligando (SCF) sono anche importanti fattori di sopravvivenza per ICC [5]. L'aumento dello stress ossidativo associato con il diabete può portare alla perdita o il danneggiamento di ICC nei topi, mentre lo stress ossidativo porta a danni e perdite delle reti ICC e lo sviluppo di ritardato svuotamento gastrico [6]. Il diabete in aumento dello stress ossidativo e ha un ruolo importante nella patogenesi delle complicanze diabetiche [7]. La sovrapproduzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) si traduce in un danno ossidativo, tra cui la perossidazione lipidica, l'ossidazione delle proteine, e danno al DNA, che può portare alla morte delle cellule. Inoltre, ROS sono noti per agire come secondi messaggeri per attivare fattori di trascrizione, come fattore nucleare kappa B (NF-kB). ROS generato durante lo stress nel tessuto gastrico può innescare l'attivazione della cascata di segnalazione NF-kB; infatti, lo svuotamento gastrico nei ratti diabetici è associata con l'attivazione di infiammazione NF-kB-mediata.
curcumina (1,7-bis- (4-idrossi-3-metossifenil) -1, 6-eptadiene-3,5- dione) è il principale componente attivo di curcuma isolata dalla pianta curcuma longa L. curcumina è una molecola multifunzionale con effetti regolatori significativi sul cancro [8], infiammazione [9] e malattie diabetici correlati come la retinopatia diabetica [10], diabetica nefropatia [11], e il diabete disfunzione cognitiva [12]. La curcumina è un scavenger potente di specie di ossigeno e di azoto reattivo, come i radicali idrossile e radicali di biossido di azoto [13]. Diversi studi hanno dimostrato che la curcumina inibisce attivazione di NF-kB vie di segnalazione pro-infiammatorio [14]. Nel frattempo, i fattori di trascrizione NF-kB regolano una serie di importanti processi fisiologici, tra cui l'infiammazione e la risposta immunitaria, la crescita e la sopravvivenza cellulare, così l'inibizione della segnalazione NF-kB rappresenta una strategia praticabile per la terapia della malattia [15]. Tuttavia, non vi è stata pochissima ricerca sul potenziale di curcumina per il trattamento di gastroparesi diabetica, o sul suo meccanismo farmacologico.
L'obiettivo di questo studio era di determinare se, in un Sprague Dawley (SD) modello murino di diabete di tipo 1 mellito, di mezza dosaggio [16] la curcumina potrebbe proteggere ICC in ratti diabetici con svuotamento gastrico ritardato, riducendo lo stress ossidativo e inibendo l'attivazione di NF-kB, aumentando SCF /espressione Kit, e normalizzando il ritardo nella svuotamento gastrico.
Materiali e metodi
topi sperimentali e induzione di diabete
ratti maschi SD (8 settimane di età) sono stati allevati nel Centro sperimentale animali, Zhejiang cinese Medical University, (Hangzhou, Cina), dove una specifica priva di agenti patogeni (SPF) laboratorio-level è stato autorizzato dal governo provinciale dello Zhejiang. Tutti i ratti sono stati alloggiati in condizioni di umidità controllata (50-60%). Essi sono stati mantenuti in luce controllata (12 h ciclo giorno /notte), con libero accesso all'acqua e roditori chow. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in coerenza con la licenza dal Zhejiang Science and Technology Office (Hangzhou, Cina) e con l'approvazione del comitato etico degli animali di Zhejiang Chinese Medical University. Tutti gli esperimenti conformi alle linee guida per la condotta etica nella cura e l'uso di animali. Ogni sforzo è stato fatto per ridurre al minimo lo stress per gli animali.
Ratti a digiuno per 12 h sono stati sottoposti ad una singola iniezione intraperitoneale di streptozotocina (STZ), 50 mg /kg, appena sciolti in 100 mM tampone citrato di sodio a pH 4,5. Pari età ratti normali ricevuto solo tampone citrato. Lo sviluppo di diabete è stata confermata dal digiuno i livelli di glucosio nel sangue (glicemia a digiuno) utilizzando un kit di reagenti (Roche, Shanghai, Cina). I ratti con livelli FBG superiori a 11,1 mm (200 mg /dl) a 72 ore dopo l'iniezione STZ stati considerati ratti diabetici. Una volta che i ratti sono diventati diabetici, i loro livelli di glucosio sono stati misurati tutti i giorni. Gli esperimenti iniziati 8 settimane dopo lo sviluppo del diabete di permettere di sviluppare gastroparesi.
Disegno sperimentale
Otto settimane dopo lo sviluppo di diabete, gli animali sono stati divisi in quattro gruppi, vale a dire le normali topi di controllo di sesso maschile (gruppo I), maschio diabetico ratti (Gruppo II), ratti curcumina-integrato diabetici maschi (gruppo III), e ratti di controllo maschi curcumina-integrato (Gruppo IV). Ratti dei gruppi III e IV (n = 10 ciascuno) sono stati trattati giornalmente con curcumina (150 mg /kg; I.G.) per 6 settimane. La curcumina (purezza > 95%) da Fusong County Natural Biotechnology Company Ltd. (Jilin, Cina), è stato sospeso in 0,5% w soluzione /v di sodio carbossimetilcellulosa (CMC-Na). I ratti nei gruppi I e II (n = 10 ciascuno) hanno ricevuto solo lo 0,5% soluzione CMC-Na. Dopo il trattamento per 6 settimane, gli animali sono stati sacrificati sotto anestesia etil etere, sangue è stato prelevato dalla vena femorale sanguinamento e il siero è stato separato. Stomaci sono stati rapidamente rimossi, e campioni di tessuto prelevati da animali sono stati conservati a -80 ° C fino preparate per saggi biochimici. Lo svuotamento gastrico, stress ossidativo, l'attivazione di NF-kB, ICC e l'espressione SCF /Kit di stomaco sono stati studiati alla fine della sesta settimana di trattamento (14 a settimana di diabete).
gastrici studi di svuotamento
Il metodo standard per la preparazione di un pasto fenolo indicatore rosso è stato impiegato come precedentemente descritto [17]. Lo svuotamento gastrico è stato determinato utilizzando una modifica di una procedura precedentemente riportato [18]. I ratti sono stati autorizzati libero accesso all'acqua fino a 3 ore prima della somministrazione sonda gastrica di curcumina. Una soluzione di 0,1% (w /v) di rosso fenolo in carbossimetilcellulosa di sodio acquoso (1,5% w /v) è stato usato come un pasto test. Curcumina stato dato 1 h prima della somministrazione orale del pasto test. Venti minuti dopo la somministrazione del pasto test, i ratti sono stati sacrificati. Gli stomaci sono stati poi esposti per laparotomia e rimossi. Ratti trattati con veicolo (soluzione fisiologica, soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%, 0,2 mL) sono stati sacrificati immediatamente dopo la somministrazione orale del pasto di prova e fenolo rosso contenuto nello stomaco è stato considerato come standard (100%). Gli stomaci rimossi sono stati incisi in 40 mL di soluzione di NaOH (0,1 N) ei contenuti sono stati sciolti. Un'aliquota di 1 mL di soluzione di lavaggio è stato aggiunto al 2 mL di acido tricloroacetico (7.5% w /v) per precipitare le proteine. Dopo centrifugazione (2500 g ×
) per 20 minuti, 1 ml del supernatante è stato aggiunto 1 ml di NaOH (1 N) per sviluppare la massima intensità del colore. L'assorbanza a 558 nm della soluzione è stata poi misurata mediante uno spettrofotometro (U-1080, Hitachi Ltd., Tokyo, Giappone). Lo svuotamento gastrico è stato calcolato secondo la seguente formula: svuotamento gastrico %
=
1
-
X
/
Y
×
100 | ,
dove X è l'assorbanza di rosso fenolo rimanendo nello stomaco 20 minuti dopo la somministrazione di fenolo rosso e Y è l'assorbanza media del rosso fenolo recuperato dallo stomaco dei topi di controllo immediatamente dopo la somministrazione di fenolo rosso.
Determinazione della MDA e livelli di SOD nel muscolo liscio di gastrico
gli stomaci sono stati asportati, pesato, e subito congelato a -70 ° C. tessuto congelato da ogni ratto è stata omogeneizzata in tampone fosfato ghiacciato (KCl 140 mM, fosfato 20 mM, pH 7,4) e centrifugato a 3000 xg per 10 min
. Il contenuto di malonaldeide (MDA), un indice per la perossidazione lipidica, è stato determinato con il metodo dell'acido tiobarbiturico (TBA) con leggera modifica [19]. In breve, 100 ml di tessuto omogenato è stato mescolato con 200 ml di soluzione di lavoro contenente 0,37% TBA. La miscela è stata incubata a 100 ° C per 15 minuti e successivamente raffreddata. Per estrarre MDA, è stato aggiunto 375 ml di N-butanolo, seguita da vortex vigorosamente per 10 s. Dopo centrifugazione, lo strato N-butanolo superiore fu trasferito in un tubo di vetro. L'assorbanza della fase butanolo è stata misurata a 532 nm. contenuto MDA è espresso come proteina nmol /mg. Per la misurazione di attività SOD, 20 ml di omogenato di tessuto sono stati mescolati con 200 ml di soluzione di reazione contenenti nitroblue tetrazolio cloruro (NBT, 750 mM), e incubate per 20 min a 37 ° C. L'assorbanza a 560 nm è stata misurata. L'attività enzimatica è espressa in unità /g di proteine ​​e 1 unità di enzima è stata definita come la quantità di enzima necessaria per inibire la riduzione di NBT del 50% misura
. semiquantitativa RT-PCR di SCF e c-kit
L' prossimale dello stomaco (40-50 mg) è stato raccolto, e la mucosa è stata rimossa dalla dissezione. Il tessuto è stato omogeneizzato meccanicamente in condizioni RNase-libere e dissociata con Tripure isolamento reagente (Roche, Svizzera) in ghiaccio per 5 minuti, e l'RNA totale è stato estratto secondo le istruzioni del produttore. RNA totale è stato quantificato spettrofotometricamente a 260 e 280 nm, con il rapporto A260 /A280 varia dal 1,8 a 2.0. integrità dell'RNA è stata verificata mediante elettroforesi su gel di agarosio, seguito da colorazione con etidio bromuro, e l'RNA è stato utilizzato per la trascrizione inversa immediato o conservato a -80 ° C in acqua RNase-free. Due fasi di reazione a catena della trascrittasi inversa-polimerasi (RT-PCR) è stata eseguita utilizzando l'asso-α- kit Revertra prima sintesi filamento cDNA (Tiangen Biotech, Pechino, Cina) e 2 × Taq PCR master mix (Tiangen Biotech), secondo le istruzioni del produttore. Un importo fisso di RNA (0,5 mg) è stato trascritto inverso. deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato (GAPDH) è stato selezionato come standard interno. Tutti i primer PCR sono stati progettati e sintetizzati da Biosune (Shanghai, Cina). Le sequenze primer e lunghezze dei prodotti di PCR sono i seguenti: GAPDH, in avanti: 5 '- GACAACTITG-GCATCGTGGA-3 ', invertire: 5 '- ATGCAGGGATGATGT-TCTGG-3 ' , 150 bp; SCF, in avanti: 5 '- GGA CTT CAT GGT GGC ATC TG-3 ', invertire: 5 '- GCC CTT GTA AGA CTT GAC TG-3 ', 285 bp; e c-kit, in avanti: 5 '- GTG GTT AAA GGA AAC GCT CG-3 ', invertire: 5 '- CAT ACA TTT CAG CAG GTG CG-3 ', 400 bp. Le condizioni di reazione sono stati ottimizzati per ciascuno dei geni variando la temperatura di ricottura (58 ° C per GAPDH, 58 ° C per SCF, e 62 ° C per c-kit) e diverso numero di cicli di PCR [20]. I prodotti PCR sono stati separati su gel di agarosio 2% a 100 V per 30 minuti. immagini gel sono state visualizzate sul monitor display a cristalli liquidi di un sistema Photodoc-Ite ultravioletta transilluminazione dotato di una fotocamera CCD (Bio-Rad Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e conservati per analisi intensità. I relativi livelli di mRNA dei geni selezionati sono stati calcolati come rapporto di espressione GAPDH.
Livelli di SCF, c-Kit, IκB e NF-kB valutati mediante analisi di Western Blot
circa 50 mg di tessuto è stata presa dalla nei pressi di stomaco prossimale. I tessuti sono stati tagliati in piccoli pezzi di circa 0,25 centimetri 3, omogeneizzati, e dissociato in radio-immunoprecipitazione tampone di lisi (Hushang Biotecnologie, Shanghai, Cina), contenente 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP-40, desossicolato di sodio 0,5%, 1% sodio dodecil solfato, 1 mM PMSF, orthovanadate di sodio, fluoruro di sodio, acido etilendiamminotetraacetico, e leupeptina a 4 ° C per 30 minuti. Gli omogenati sono stati centrifugati a 12 000 × g
per 5 minuti a 4 ° C, ei surnatanti sono stati raccolti e utilizzati come proteine ​​totali. Uguali quantità di proteine ​​sono stati elettroforesi mediante SDS-PAGE in 10% o 15% gel di poliacrilammide. Le proteine ​​sono state trasferite su membrane di nitrocellulosa (Hushang Biotechnology) di semisecco assorbente. Le membrane sono state bloccate con tampone tris salina 0,1% Tween 20 (TBST) contenente 5% di latte per 60 minuti a temperatura ambiente, quindi immuno-cancellati con anticorpi primari opportunamente diluiti a 4 ° C durante la notte. Dopo aver lavato tre volte con TBST, le macchie sono state incubate con anticorpo secondario HRP-coniugato per 60 minuti a temperatura ambiente. Poi, i complessi sono stati visualizzati utilizzando un sistema di imaging iChemi XR (WD9431A, Bomeike Biotecnologie, Cina) con i reagenti chemiluminescenza (Tigsun Biological Science Tecnologia, Tianjin, Cina). Semi-quantificazione è stata effettuata utilizzando Quantity One software, versione 4.6.2 (Bio-Rad). I seguenti anticorpi sono stati utilizzati: anti-SCF, 1: 200, c-kit, 1: 200, anti-IκB e anti-NF-kB p65 e GAPDH, 1:. 500 (Hushang Biotecnologie, Shanghai, Cina) La quantificazione di NF-kB -DNA vincolante da elettroforetico saggio mobility shift
estratti nucleari sono stati preparati da lisati di stomaco, come descritto in precedenza [21]. attivazione di NF-kB è stato determinato mediante un test elettroforetico mobility shift (EMSA), e la traslocazione nucleare di NF-kB è stato valutato come descritto in precedenza (GS009, Beyotime Istituto di Biotecnologie, Shanghai, Cina) [22]. Per NF-kB vincolante reazioni, 5 mg di estratto proteico nucleare è stata incubata a temperatura ambiente per 20 minuti con tampone di reazione contenente 20 mM HEPES, pH 7.9, 50 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% glicerolo, 200 mg /ml BSA, e 2 mg di poli (dl-dC). Poi, 32P-marcato oligonucleotide a doppio filamento (1 ng ≥1 × 105 cpm) contenente la sequenza consenso di legame di NF-kB (5 '- GGCAACCTGGGGACTCTCCCTTT-3 ') è stato aggiunto alla miscela di reazione per ulteriori 10 min a temperatura ambiente. I prodotti di reazione sono stati frazionati su un non-gel denaturante di poliacrilammide al 6% per 60 min a 350 V, che è stato poi essiccato e sottoposto ad autoradiografia a -70 ° C per una notte. Per saggi di competizione, eccesso oligonucleotide (100 volte eccesso molare) concorrente è stato pre-incubati con estratti nucleari per 20 min a temperatura ambiente. Un mutante oligonucleotide NF-kB (5 '- GGCAACTGCTCACTCTCCCTTT-3 ') è stato utilizzato per l'analisi della concorrenza. I segnali sono stati analizzati densitometricamente.
Doppio immunofluorohistochemistry con deossinucleotidil terminale nick saggio transferasi-mediata dUTP-biotina etichettatura end (TUNEL) e c-kit di colorazione a fluorescenza
immunoistochimica per c-kit (utilizzando l'anticorpo da Santa Cruz) e TUNEL colorazione sono stati eseguiti su sezioni 10 micron utilizzando una modifica del procedimento pubblicato dal fabbricante del kit TUNEL (TACS STDT, Trevigen Inc, Gaithersburg, MD). cellule TUNEL-positivi sono stati etichettati con fluoresceina (Ex 488, Em 505-550), le cellule c-kit-positivi sono stati etichettati con Cy3 (Ex 543, Em 560-615), e nuclei sono stati etichettati con DAPI (Ex 364, Em 385 -470). I campioni di tessuto sono stati incorporati in fluorescenza mezzo di montaggio e di indagine da microscopio confocale a scansione laser [23]. Circa 200 cellule sono state contate per campo, cinque campi sono stati esaminati per vetrino e cinque diapositive sono stati esaminati per gruppo. Le percentuali di TUNEL- e apoptosi delle cellule c-kit-positivi sono stati indicati come l'indice apoptotico (AI) (%). Analisi statistica

Tutti i dati sono presentati come media ± SD. Per confrontare i dati tra i gruppi di animali, analisi della varianza ad una via (ANOVA) e confronti Duncan sono stati impiegati. Tutti i test statistici sono stati effettuati utilizzando SPSS per Windows, versione 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Le differenze sono state considerate statisticamente significative a P
< 0.05
. Risultati
effetto della curcumina sul peso corporeo e della glicemia di ratti diabetici
livelli di glucosio nel plasma sono stati molto elevati nei ratti diabetici (Gruppo II) [(322 ± 41) mg /dl] rispetto a quelli in normali ratti di controllo (Gruppo I) [(98 ± 12) mg /dl]. C'è stato un netto calo nel corpo pesi di Gruppo II ratti [(298 ± 16) g] rispetto ai ratti del gruppo I di pari età [(449 ± 21) g]. Croniche ratti diabetici curcumina trattati (gruppo III) non hanno mostrato miglioramenti significativi nel peso corporeo e nessun calo dei livelli di glucosio nel plasma rispetto al gruppo II ratti [Gruppo III, il peso corporeo (324 ± 19) g e glucosio (302 ± 38) mg /DL] (Tabella 1) .table peso corporeo 1 glicemia e in quattro gruppi
gruppi
Gruppo I
gruppo II
Gruppo III

Il Gruppo IV
glucosio nel sangue (mg /dl)
98 ± 12
322 ± 41 *
302 ± 38 * #
100 ± 11
peso corporeo ( g)
449 ± 21
298 ± 16 *
324 ± 19 *
476 ± 27
gruppo I = normali ratti di controllo; Gruppo II = ratti di controllo diabetici; Gruppo III = diabetica + curcumina ratti trattati (150 mg /kg); Gruppo IV = normali + curcumina ratti trattati (150 mg /kg). I risultati sono presentati come media ± SD. * P
< 0,05 (rispetto al gruppo I), #P
> 0,05 (rispetto al gruppo II)
Effetto della curcumina su svuotamento gastrico
Lo svuotamento gastrico è stato significativamente ritardato nei ratti SD che avevano avuto il diabete per 8 settimane. . La quantità di svuotamento gastrico nel gruppo II era 44,3 ± 5,7%, che è stato significativamente inferiore a quella nel gruppo I [(76,2 ± 4,3)%, P
< 0.01], e diabetici ratti sottoposti a trattamento curcumina [(gruppo III) ,; (59,4 ± 7,5)%, P
< 0,05]. Tuttavia, nessuna differenza significativa è stata osservata tra il gruppo I e ratti Gruppo IV [(73,3 ± 5,2%), P
> 0,05] (Figura 1). Figura 1 Effetti della curcumina su svuotamento gastrico nei ratti diabetici. Gruppo I = normali ratti di controllo (n = 10); : Gruppo II ratti di controllo = diabetici (n = 10); : Gruppo III = diabetica + curcumina ratti trattati (n = 10); : Gruppo IV = normale + curcumina trattati ratti (n = 10). Tutti i valori sono espressi come media ± SD. * P
< 0,01 (rispetto al gruppo I), p #
< 0,05 (rispetto al gruppo II), Ap
>. 0,05 (rispetto al gruppo I)
trattamento curcumina diminuito formazione MDA, aumenta l'attività SOD
Abbiamo studiato lo stress ossidativo utilizzando diversi metodi, perché il glucosio stress ossidativo indotto è stata postulata per essere un meccanismo chiave di complicanze diabetiche croniche. ratti diabetici hanno mostrato un aumento livelli di MDA [Gruppo I 15,7 ± 1,7 (nmol /mg) vs
gruppo II 27.9 ± 2.1 (nmol /mg), P = 0,006
] e diminuzione dei livelli di SOD [Gruppo I 146.2 ± 9.3 ( U /mg) vs
gruppo II 107,9 ± 7.5 (U /mg), P = 0.008
], un marker molecolari di stress ossidativo (Figura 2). Sei settimane di trattamento curcumina riduce il grado di MDA upregulation [Gruppo III, 21,4 ± 1,8 (nmol /mg), P = 0.033
contro il gruppo I e P
= 0,004 vs Gruppo II], e migliorato la SOD verso il basso -il regolamento [Gruppo III 126,2 ± 8.8 (unità /mg), P = 0,036
contro il gruppo I e P
= 0,001 vs Gruppo II]. La curcumina notevolmente migliorato l'attività SOD e ridotti livelli di MDA in omogenati di stomaco. Inoltre, nessuna differenza significativa è stata notata tra il gruppo I e gli animali gruppo IV (P
> 0,05; Figura 2). Figura 2 Effetti di curcumina su MDA e SOD in ratti diabetici. I livelli di MDA è ridotto dopo trattati con curcumina, i livelli di SOD è stato aumentato dopo trattamento con curcumina. : Gruppo I = normali ratti di controllo (n = 10); : Gruppo II = ratti di controllo diabetici (n = 10); Gruppo III = diabetica + curcumina ratti trattati (n = 10); : Gruppo IV = normale + curcumina trattati ratti (n = 10). Tutti i valori sono espressi come media ± SD * p
. ≪ 0,01 (rispetto al gruppo I), p #
< 0,01 (rispetto al gruppo II), Ap
> 0,05 (rispetto al gruppo i).
curcumina accresce SCF e livelli di c-kit di proteine ​​
immagini rappresentative delle analisi RT-PCR di SCF nei tessuti dello stomaco dei ratti di ogni gruppo sono mostrati in Figure3A. Rispetto al gruppo I, la SCF era significativamente più bassa nel gruppo II [(0.44 ± 0.02) vs
(0,69 ± 0,03), P
= 0 .002], e un confronto tra i valori del gruppo III hanno rivelato che il livello di SCF nei ratti trattati con curcumina è stata superiore a quella nel gruppo II [(0,58 ± 0,04) vs
(0.44 ± 0.03) P
= 0 .003]. Tuttavia, non sono emerse differenze tra i gruppi I e IV [(0,69 ± 0,03) vs
(0.66 ± 0.03) P
= 0,56] (Figure3B). Occidentale blot (Figure4A, B) ha rivelato che il livello di SCF nei tessuti dello stomaco di ratti del gruppo II era significativamente più bassa rispetto a quelli nei ratti del gruppo I e III [rapporti di (0,33 ± 0,02) vs
(0.47 ± 0.03) e (0.41 ± 0.02), rispettivamente, P
< 0 .05)]. Tuttavia, nessuna differenza significativa è stata trovata tra il Gruppo IV e ratti Gruppo I [(0,45 ± 0,03) vs
(0.47 ± 0.03), P
> 0,05)], suggerendo che l'intervento curcumina potrebbe effettivamente ripristinare i livelli locali di proteine ​​SCF nei tessuti dello stomaco di ratti diabetici. Figura 3 Variazioni SCF /GAPDH e C-kit /GAPDH mediante analisi RT-PCR. (A) Immagini rappresentative della elettroforesi su gel di GAPDH, SCF, e c-kit nei ratti di ogni gruppo. livelli (B) Gruppo di espressione di mRNA relativo di SCF e c-kit, con prodotti quantificati dal rapporto di GAPDH. : Gruppo I = normali ratti di controllo (n = 10); : Gruppo II ratti di controllo = diabetici (n = 10); : Gruppo III = diabetica + curcumina ratti trattati (n = 10); : Gruppo IV = normale + curcumina trattati ratti (n = 10). Tutti i valori sono espressi come media ± SD. * P
< 0,01 (rispetto al gruppo I.), # p
< 0,05 (rispetto al gruppo II), Ap
>. 0,05 (rispetto al gruppo I)
Figura 4 Le variazioni di SCF /GAPDH e C-kit /GAPDH da analisi Western blot. (A) le immagini della band proteina Rappresentante di SCF, c-kit, e glyceraldehydes-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH). livelli (B) Gruppo di SCF relativa e della proteina c-kit espresso dal rapporto di GAPDH, rispettivamente. : Gruppo I = normali ratti di controllo (n = 10); : Gruppo II ratti di controllo = diabetici (n = 10); : Gruppo III = diabetica + curcumina ratti trattati (n = 10); : Gruppo IV = normale + curcumina trattati ratti (n = 10). Tutti i valori sono espressi come media ± SD. * P
< 0,01 (rispetto al gruppo I), p #
< 0,01 (rispetto al gruppo II), Ap
>. 0,05 (rispetto al gruppo I)
RT-PCR analisi ha mostrato che i livelli di espressione di c-kit nei tessuti dello stomaco erano 0,78 ± 0,04, 0,37 ± 0,02 e 0,59 ± 0,03 per gruppi i, II e III, rispettivamente. I livelli di c-kit di espressione dei gruppi II e III ratti sono stati inferiori rispetto a quella nei ratti del gruppo I. Tuttavia, un confronto dei gruppi II e III rivelato che il livello di c-kit in ratti curcumina trattati era maggiore di quella in ratti diabetici non trattati (P ​​
< 0.05, Figure3B). risultati simili sono stati dimostrati attraverso l'analisi Western Blot (Figure4B). I livelli di proteina c-kit (rapporti di 0.45 ± 0.03, 0.21 ± 0.02 e 0.34 ± 0.02, rispettivamente, per gruppi I, II e III) sono stati molto maggiori nel gruppo III rispetto al gruppo II (P
< 0 .05, Figure4B), e il livello del gruppo III era inferiore a quello dei gruppi I e IV. Entrambe le analisi hanno indicato che 6 settimane di intervento curcumina potrebbe ripristinare in modo significativo la diminuzione dei livelli di c-kit in ratti diabetici.
Curcumina inibisce la I-kB degrado e NF-kB attivazione
rapporti indicano che una maggiore e cronica dello stress ossidativo può attivare o perturbare l'attività di NF-kB [24]. Abbiamo studiato se la curcumina potrebbe comportare l'attivazione della via di segnalazione NF-kB. Per fare questo, abbiamo misurato i livelli di NF-kB in presenza o assenza di curcumina per identificare se NF-kB è stato attivato. In primo luogo, abbiamo valutato i livelli della proteina di I-kB, a cui inattivato NF-kB si lega. Abbiamo trovato che il livello di I-kB in ratti gruppo I era superiore a quella nei ratti del gruppo II, mentre il livello nei ratti III gruppo era inferiore a quello in ratti Gruppo II (p < 0,01), ma superiore ai livelli I gruppi di ratti e IV (p < 0,05). Poi, abbiamo esaminato se la curcumina potrebbe bloccare NF-kB. Abbiamo scoperto che il diabete (II gruppo) ha portato ad un aumento dei livelli di NF-kB [Gruppo I 75,5 ± 7,7 (pg /ml) vs
gruppo II 102.8 ± 12.4 (pg /ml), P = 0.001
] , mentre il trattamento con curcumina [Gruppo III 91,3 ± 8,9 (pg /ml)] impedito questo effetto. Sulla base di questa constatazione, abbiamo suggerito che la curcumina inibisce l'attivazione di NF-kB [Gruppo IV 70,9 ± 8,1 (pg /ml), P = 0.026
] (Figure5). Abbiamo esaminato se la curcumina potrebbe bloccare di NF-kB traslocazione nel nucleo, perché traslocazione nucleare è riconosciuto come una reazione alla stimolazione delle cellule ROS e sembra correlare con l'attivazione trascrizionale NF-kB mediata. Per valutare questo, abbiamo misurato il livello di NF-kB nel nucleo dall'EMSA. Sviluppo di diabete indotto un aumento dei livelli di NF-kB nel nucleo, mentre il trattamento con curcumina impedito questo effetto (Figure6). Così, abbiamo suggerito che la curcumina sopprime non solo indirettamente l'attivazione del legame di NF-kB-DNA, ma che sopprime anche l'attivazione monte di I-kB. Figura 5 Effetto della curcumina sulla I-kB e NF-kB. (A) il grafico a barre è stato chiaro riflesso del livello di I-kB e NF-kB tra i quattro gruppi. (B) il livello di I-kB /GAPDH è stato ridotto nel gruppo II, ma è aumentato di curcumina. I: Gruppo I = normali ratti di controllo (n = 10); II: Gruppo II = ratti di controllo diabetici (n = 10); III: Gruppo III = diabetica + curcumina ratti trattati (n = 10); IV: Gruppo IV = normale + curcumina trattati ratti (n = 10). Tutti i valori sono espressi come media ± SD * p
. ≪ 0,01 (rispetto al gruppo I), p #
< 0,01 (rispetto al gruppo II), Ap
> 0,05 (rispetto al Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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