Curcumin forbedrer ekspression af SCF /c-kit gennem svækkende oxidativ stress og NF-KB-aktivering i gastriske væv af diabetisk gastroparese rats

Curcumin forbedrer ekspression af SCF /c-kit gennem svækkende oxidativ stress og NF-KB-aktivering i gastriske væv af diabetisk gastroparese, rotter
Abstrakt
Baggrund
Diabetes mellitus er forbundet med mange slags komplikationer. Nylige undersøgelser har vist, at oxidativt stress og inflammatoriske reaktioner har kritiske roller i patogenesen af ​​diabetisk gastroparese. Curcumin er kendt for at have antioxiderende og antiinflammatoriske egenskaber. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi virkningen af ​​curcumin på diabetisk gastrisk motilitet i et Sprague Dawley rotte model af type 1 diabetes mellitus. Salg Metoder
SD-hanrotter blev inddelt i en kontrolgruppe, en kontrolgruppe, der modtager curcumin, en diabetiker gruppe, og en diabetiker gruppe, der fik curcumin. Diabetes blev induceret ved intraperitoneal injektion af streptozotocin. Curcumin (150 mg /kg) blev givet intragastrisk i 6 uger, og blodsukkerniveauer og kropsvægte blev målt. Maverne blev udskåret for analyse af mavetømning rater, og niveauer af oxidativ stress. NF-KB, I-KB, og stamcellefaktor (SCF) /c-kit-proteinniveauer blev vurderet ved Western blot-analyse, mens apoptose af interstitielle celler af Cajal (ICCs) blev vurderet ved TUNEL-farvning.
Resultater
Curcumin-behandlede diabetiske rotter viste signifikant forbedrede gastrisk udtømning satser [(59,4 ± 7,5)%] i forhold til diabetiske rotter [(44,3 ± 5,7)%], samt nedsat mængde MDA [21,4 ± 1,8 (nmol /mg) vs
27,9 ± 2,1 (nmol /mg)], og øget SOD-aktivitet [126,2 ± 8,8 (enheder /mg) vs
107,9 ± 7,5 (enheder /mg)]. På den anden side, det mavetømning niveauet i kontrolgruppen var ikke signifikant forskellig fra den i kontrolgruppen modtager curcumin behandling. Desuden viste curcumin-behandlede diabetiske rotter signifikant forøgede niveauer af SCF /c-kit-protein i maven væv, inhiberede I-KB nedbrydning og NF-KB-aktivering, og reduceret ICC apoptose indeks [(26,2 ± 4,1)% versus
(47,5 ± 6,2)%], sammenlignet med den diabetiske gruppe.
Konklusion
Curcumin behandling forbedret gastrisk tømning ved at blokere produktionen af ​​oxidativ stress, afskaffelse NF-KB-signaltransduktion og forbedre ekspression af SCF /c-kit i rotter med diabetisk gastroparese.
Nøgleord
Curcumin diabetisk gastroparese Oxidativ stress NF-KB-stamcelle faktor /c-kit interstitielle celler af Cajal Introduktion
diabetisk gastroparese er en sygdom i fordøjelseskanalen, defineret som forsinket tømning af en fast måltid, og ses i 30-50% af patienter med type 1 eller type 2 diabetes mellitus [1]. Patienter ofte tilstedeværende øvre gastrointestinale symptomer, såsom tidlig mæthed, vægttab, abdominal oppustethed, mavesmerter, kvalme, opkastning forekommer hyppigt, og nedsat glykæmisk kontrol, og sygdommen alvorligt påvirker patienternes livskvalitet.
Gastroparese er i stigende grad at være anerkendt som et væsentligt sundhedsproblem. Selvom gastroparese påvirker mange diabetikere verden over, ikke kun er de behandlingsmuligheder meget begrænset, men også de behandlinger, der er tilgængelige for diabetisk gastropathy ofte ineffektive. Disse omfatter medicinsk terapi, gastrisk elektrisk stimulation, kirurgisk terapi, og ernæringsmæssig støtte. Medicin til gastroparese indbefatter metoclopramid, domperidon, cisaprid, og erythromycin. Selv om disse midler er blevet anvendt til behandling af gastroparese, er de blevet rapporteret at være af begrænset effektivitet, og mange patienter kan ikke tåle dem på grund af deres bivirkninger. Hos diabetespatienter med refraktær gastroparese, højfrekvente gastrisk elektrisk stimulation af et permanent implanterede system væsentligt forbedret øvre symptomer fordøjelseskanalen og repræsenterer en alternativ kirurgisk behandling for patienterne. Kirurgiske procedurer, såsom gastrektomi og antrektomi er den sidste mulighed for behandling, at være kontroversiel og har behov for mere undersøgelse [2]. Hos patienter med svær gastroparese men normal lille tarm motilitet kan jejunostomisonde fodring anvendes. Mens dette tilvejebringer ernæringsmæssig støtte, betyder det ikke helbrede gastroparese [3]. Diabetisk gastroparese er generelt bedst behandles medicinsk, og kun patienter med svær diabetisk gastroparese, der har undladt at reagere på medicinsk behandling bør underkastes andre behandlinger. Således er det nødvendigt at finde lægemidler, der viser virkning ved behandling af diabetisk gastroparese.
Diabetisk gastroparese er forbundet med et tab af interstitielle celler af Cajal (ICCs) i både mennesker og dyremodeller [4]. ICCs kan identificeres i væv ved mærkning med antisera til receptoren tyrosinkinase-kit, et protein udtrykt på ICC'er. Kit og dens ligand stamcellefaktor (SCF) er også vigtige overlevelsesfaktorer for ICC'er [5]. Den øgede oxidative stress i forbindelse med diabetes kan føre til tab af eller skade på ICCs i mus, mens oxidativ stress fører til skade og tab af ICC-net og udvikling af forsinket gastrisk tømning [6]. Diabetes resulterer i forøget oxidativt stress og har en vigtig rolle i patogenesen af ​​diabetiske komplikationer [7]. Overproduktion af reaktive oxygenarter (ROS) resulterer i oxidativ beskadigelse, herunder lipidperoxidation, protein oxidation, og DNA-beskadigelse, som kan føre til celledød. Desuden er ROS kendt for at virke som anden messengers at aktivere transkriptionsfaktorer, såsom nuklear faktor kappa B (NF-KB). ROS genereres under stress i gastrisk væv kan udløse aktivering af NF-KB signalering kaskade; Faktisk er gastrisk tømning hos diabetiske rotter associeret med aktivering af NF-KB-medieret inflammation.
Curcumin (1,7-bis- (4-hydroxy-3-methoxyphenyl) -1, 6-heptadien-3,5- dion) er den vigtigste aktive bestanddel af gurkemeje isoleret fra planten Curcuma longa L. Curcumin er et multifunktionelt molekyle med betydelige regulatoriske virkninger på cancer [8], inflammation [9] og diabetiske sygdomme, såsom diabetisk retinopati [10], diabetisk nefropati [11], og diabetes kognitiv dysfunktion [12]. Curcumin er en potent scavenger af reaktive oxygen og nitrogenforbindelser, såsom hydroxylradikaler og nitrogendioxid radikaler [13]. Flere undersøgelser har vist, at curcumin hæmmer aktiveringen af ​​NF-KB proinflammatoriske signaleringsveje [14]. I mellemtiden, NF-KB transkriptionsfaktorer regulere en række vigtige fysiologiske processer, herunder inflammation og immunresponser, cellevækst og overlevelse, så inhibering af NF-KB-signalering repræsenterer en levedygtig strategi for sygdom terapi [15]. Imidlertid har der været meget lidt forskning på potentialet for curcumin til at behandle diabetisk gastroparese, eller på dets farmakologiske mekanisme.
Målet med denne undersøgelse var at bestemme, hvorvidt, i en Sprague Dawley (SD) rotte model af type 1-diabetes mellitus, middle-dosis [16] curcumin kunne beskytte ICCs i diabetiske rotter med forsinket gastrisk tømning ved at reducere oxidativ stress og hæmme NF-KB-aktivering, øget SCF /Kit udtryk, og normalisere forsinkelse i mavesækkens tømning.
Materialer og metoder
Eksperimentelle rotter og induktion af diabetes
SD-hanrotter (8 uger gamle) blev avlet i centrum af forsøgsdyr, Zhejiang Chinese Medical University, (Hangzhou, Kina), hvor en SPF-(SPF) -level laboratorium er blevet godkendt af Zhejiang provins regering. Alle rotter blev holdt under betingelser med kontrolleret fugtighed (50-60%). De blev holdt under kontrollerede lys (12 timer dag /nat cyklus) med fri adgang til vand og gnaver chow. Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med licens fra Zhejiang-provinsen Videnskab og Teknologi kontor (Hangzhou, Kina) og med godkendelse fra dyreetik udvalg Zhejiang Chinese Medical University. Alle eksperimenter var i overensstemmelse med retningslinjer for etisk adfærd i pasning og anvendelse af dyr. Alle bestræbelser var at minimere stress for dyrene.
Rotter fastede i 12 timer blev udsat for en enkelt intraperitoneal injektion af streptozotocin (STZ), 50 mg /kg, frisk opløst i 100 mM natriumcitrat ved pH 4,5. Aldersmatchede normale rotter modtog kun citratbuffer. Udvikling af diabetes blev bekræftet ved at faste blodsukker (FBG) niveauer ved anvendelse af en reagens-kit (Roche, Shanghai, Kina). Rotter med FBG-niveauer højere end 11,1 mM (200 mg /dl) ved 72 timer efter STZ injektion blev betragtet som diabetiske rotter. Når rotterne blev diabetiske, blev deres blodsukkerniveau målt dagligt. Eksperimenter blev påbegyndt 8 uger efter udviklingen af ​​diabetes at tillade gastroparese at udvikle sig.
Forsøgsdesign
Otte uger efter udviklingen af ​​diabetes blev dyr inddelt i fire grupper, kontrol hanrotter dvs. normale (Gruppe I), diabetisk mandlige rotter (gruppe II), curcumin-suppleret diabetiske hanrotter (Gruppe III) og curcumin-suppleret rotter kontrol mandlige (gruppe IV). Rotter i gruppe III og IV (n = 10 hver) blev behandlet dagligt med curcumin (150 mg /kg; i.g.) i 6 uger. Curcumin (renhed > 95%) ud fra Fusong County Natural Biotechnology Company Ltd (Jilin, Kina), blev suspenderet i 0,5% w /v natriumcarboxymethylcellulose (CMC-Na) opløsning. Rotter i gruppe I og II (n = 10 hver) fik 0,5% CMC-Na-opløsning alene. Efter behandling i 6 uger blev dyrene aflivet under ethylether anæstesi blev blod opsamlet ved femorale vene blødning og serum blev separeret. Maver blev hurtigt fjernet, og vævsprøver udtaget af dyr blev opbevaret ved -80 ° C indtil forarbejdet til biokemiske analyser. Ventrikeltømning, oxidativ stress, NF-KB-aktivering, ICCs og SCF /Kit udtryk i maver blev også undersøgt i slutningen af ​​den sjette uge af behandlingen (14 th uge af diabetes).
Ventrikeltømning undersøgelser
Den standard metode til fremstilling af en phenol rød markør måltid blev ansat som tidligere [17] beskrevet. Mavetømning blev bestemt under anvendelse af en modifikation af en tidligere rapporteret procedure [18]. Rotter havde fri adgang til vand indtil 3 timer før tvangsfodring af curcumin. En opløsning af 0,1% (vægt /volumen) phenol rød i vandig natriumcarboxymethylcellulose (1,5% vægt /volumen) blev anvendt som et testmåltid. Curcumin blev givet 1 time før den orale indgivelse af prøvemåltidet. Tyve minutter efter indgivelsen af ​​testmåltid blev rotterne aflivet. Maverne blev derefter eksponeret ved laparotomi og fjernes. Rotter behandlet med vehikel (saltvand, 0,9% natriumchloridopløsning, 0,2 ml) blev aflivet umiddelbart efter oral administration af testen måltid og phenolrødt indhold i maven blev betragtet som standarden (100%). De fjernede maver blev indskåret i 40 ml NaOH-opløsning (0,1 N), og indholdet blev opløst. En 1-ml aliquot af vaskeopløsningerne blev tilsat til 2 ml trichloreddikesyre (7,5% vægt /volumen) for at udfælde proteiner. Efter centrifugering (2500 x g
) i 20 min, blev 1 ml af supernatanten tilsat til 1 ml NaOH (1 N) at udvikle den maksimale intensitet af farver. Absorbansen ved 558 nm af opløsningen blev derefter målt under anvendelse af et spektrofotometer (U-1080, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan). Ventrikeltømning blev beregnet efter følgende formel: ventrikeltømning %
=
1
-
X
/
Y
×
100
,
hvor X er absorbansen af ​​phenolrødt tilbage i maven 20 min efter phenolrødt administration og Y er den gennemsnitlige absorbans af phenolrødt udvundet fra maver af kontrolmus umiddelbart efter phenolrødt administration.
Bestemmelse af MDA og SOD-niveauer i den glatte muskulatur af gastrisk antrum
maverne blev udskåret, vejet og straks frosset ved -70 ° C. Frosset væv fra hver rotte blev homogeniseret i iskold phosphatpuffer (KCI 140 mM, phosphat 20 mM, pH 7,4) og centrifugeret ved 3000 x g
i 10 min. Indholdet af malonaldehyd (MDA), et indeks for lipidperoxidation blev bestemt under anvendelse af thiobarbitursyre (TBA) metoden med let modifikation [19]. Kort beskrevet blev 100 pi vævshomogenat blandet med 200 pi arbejde opløsning indeholdende 0,37% TBA. Blandingen blev inkuberet ved 100 ° C i 15 minutter og derefter afkølet. For at ekstrahere MDA blev 375 pi N-butanol tilsat efterfulgt af vortexbehandling kraftigt i 10 s. Efter centrifugering blev den øvre n-butanol lag overført til et glasrør. Absorbansen af ​​den butanol fase blev målt ved 532 nm. MDA-indhold udtrykkes som nmol /mg protein. Til måling af SOD-aktivitet, blev 20 pi af vævshomogenat blandet med 200 pi reaktionsopløsning indeholdende nitroblåt tetrazoliumchlorid (NBT, 750 uM), og inkuberet i 20 minutter ved 37 ° C. Absorbansen ved 560 nm blev målt. Enzymaktivitet er udtrykt som enheder /g protein og 1 enhed enzym blev defineret som den mængde enzym, der kræves for at inhibere reduktionen af ​​NBT med 50%.
Semikvantitativ RT-PCR måling af SCF og c-kit
proximale mave (40-50 mg) blev høstet, og slimhinden blev fjernet ved dissektion. Vævet blev mekanisk homogeniseret under RNase-frie betingelser og dissocieret med TriPure isolation reagens (Roche, Schweiz) på is i 5 minutter, og totalt RNA blev ekstraheret ifølge producentens anvisninger. Total RNA blev kvantificeret spektrofotometrisk ved 260 og 280 nm, med A260 /A280-forhold i området fra 1.8 til 2,0. RNA integritet blev verificeret ved agarosegelelektroforese, efterfulgt af ethidiumbromidfarvning, og RNA blev anvendt til umiddelbar revers transkription eller opbevaret ved -80 ° C i RNase-frit vand. To-trins revers transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR) blev udført under anvendelse af Revertra ace-α- første streng cDNA syntesekit (Tiangen Biotech, Beijing, Kina) og 2 × Taq PCR Master Mix (Tiangen Biotech), ifølge producentens anvisninger. Et fast beløb på RNA (0,5 ug) var omvendt transskriberet. Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev valgt som en intern standard. Alle PCR-primere blev designet og syntetiseret ved Biosune (Shanghai, Kina). Primersekvenserne og længder af PCR-produkterne er som følger: GAPDH, fremad: 5 '- GACAACTITG-GCATCGTGGA-3 ', omvendt: 5 '- ATGCAGGGATGATGT-TCTGG-3 ' , 150 bp; SCF, frem: 5 '- GGA CTT CAT GGT GGC ATC TG-3 ', omvendt: 5 '- GCC CTT GTA AGA CTT GAC TG-3 ', 285 bp; og c-kit, frem: 5 '- GTG GTT AAA GGA AAC GCT CG-3 ', omvendt: 5 '- CAT ACA TTT CAG CAG GTG CG-3 ', 400 bp. Reaktionsbetingelser blev optimeret for hvert af generne ved at variere annealing temperatur (58 ° C i GAPDH, 58 ° C i SCF, og 62 ° C i c-kit) og forskellige antal PCR-cykler [20]. PCR-produkterne blev separeret på 2% agarosegeler ved 100 V i 30 minutter. Gelbilleder blev vist på LCD skærmen monitor af en ultraviolet gennemlysning PhotoDoc-Ite systemet udstyret med en CCD-kamera (Bio-Rad Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) og bevares for intensitet analyse. De relative mRNA-niveauer for de valgte gener blev beregnet som forholdet til GAPDH-ekspression. Salg Niveauer af SCF, c-Kit, IKB og NF-KB vurderet ved Western blot-analyse Om 50 mg væv blev taget fra nær proximale mave. Væv blev skåret i små stykker på ca. 0,25 cm 3, homogeniseret, og dissocieret i radio-immunpræcipitationsassay lysepuffer (Hushang Biotechnology, Shanghai, Kina), indeholdende 50 mM tris, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 1% natriumdodecylsulfat, 1 mM PMSF, natriumorthovanadat, natriumfluorid, ethylendiamintetraeddikesyre, og leupeptin ved 4 ° C i 30 minutter. Homogenater blev centrifugeret ved 12 000 x g
i 5 minutter ved 4 ° C, og supernatanterne blev opsamlet og anvendt som total protein. Lige store mængder protein blev elektroforeret ved SDS-PAGE i 10% eller 15% polyacrylamidgeler. Proteiner blev overført til nitrocellulosemembraner (Hushang Biotechnology) ved halvtør blotting. Membraner blev blokeret med Tris-bufret saltvand 0,1% Tween 20 (TBST) indeholdende 5% mælk i 60 minutter ved stuetemperatur, og derefter immuno-blottet med passende fortyndet primære antistoffer ved 4 ° C natten over. Efter vask tre gange med TBST blev blottene inkuberet med HRP-konjugeret sekundært antistof i 60 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev komplekser visualiseret ved hjælp af en iChemi XR imaging system (WD9431A, Bomeike Biotechnology, Kina) med kemiluminescens reagenser (Tigsun Biological Science Technology, Tianjin, Kina). Semi-kvantificering blev udført ved anvendelse Mængde One-software, version, 4.6.2 (Bio-Rad). Følgende antistoffer blev anvendt: anti-SCF, 1: 200, c-kit, 1: 200, anti-IKB og anti-NF-KB p65 og GAPDH, 1:. 500 (Hushang Biotechnology, Shanghai, Kina)
kvantificering af NF-KB-DNA binding ved elektroforetisk mobility shift-assay
nukleare ekstrakter fremstillet fra mave lysater som tidligere [21] beskrevne. NF-KB-aktivering blev bestemt ved en elektroforetisk mobilitet (EMSA), og nuklear translokation af NF-KB blev vurderet som beskrevet tidligere (GS009, Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Kina) [22]. For NF-KB bindingsreaktioner blev 5 ug ekstrakt kerneprotein inkuberet ved stuetemperatur i 20 minutter med reaktionspuffer indeholdende 20 mM HEPES, pH 7,9, 50 mM KCI, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% glycerol, 200 ug /ml BSA og 2 ug poly (dl-dC). Derefter 32P-mærket dobbeltstrenget oligonukleotid (1 ng ≥1 × 105 cpm) indeholdende NF-KB bindende konsensussekvens (5 '- GGCAACCTGGGGACTCTCCCTTT-3 «) blev tilsat til reaktionsblandingen i yderligere 10 minutter ved stuetemperatur. Reaktionsprodukterne blev fraktioneret på en ikke-denaturerende 6% polyacrylamidgel i 60 minutter ved 350 V, som derefter blev tørret og underkastet autoradiografi ved -70 ° C natten over. For kompetitive assays, overskydende oligonukleotid (100-fold molært overskud) konkurrent blev præ-inkuberet med kerneekstrakter i 20 minutter ved stuetemperatur. En mutant NF-KB-oligonukleotid (5 '- GGCAACTGCTCACTCTCCCTTT-3 ') blev anvendt til konkurrerende analyse. Signaler blev densitometrisk analyseret.
Dobbelt immunofluorohistochemistry med terminal deoxynukleotidyltransferase-medieret dUTP-biotin nick endemærkning assay (TUNEL) og c-kit-farvning
Fluorescence immunhistokemi for c-kit (anvendelse af antistoffet fra Santa Cruz) og TUNEL farvning blev udført på 10-um snit under anvendelse af en modifikation af proceduren publiceret af producenten af ​​TUNEL-kit (TACS sTdT, Trevigen Inc, Gaithersburg, MD). TUNEL-positive celler blev mærket med fluorescein (Ex 488, Em 505-550), blev c-kit-positive celler mærket med Cy3 (Ex 543, Em 560-615), og kerner blev mærket med DAPI (Ex 364, Em 385 -470). Vævsprøver blev indlejret i Fluorescensmonteringsmedium og undersøgt ved konfokal laserscanningsmikroskopi [23]. Ca. 200 celler blev talt pr felt, fem felter blev undersøgt pr dias og fem dias blev undersøgt per gruppe. Procentdelene af TUNEL- og c-kit-positive apoptotiske celler blev betegnet som den apoptotiske indeks (AI) (%).
Statistisk analyse
Alle data er præsenteret som middelværdi ± SD. At sammenligne data blandt grupper af dyr, envejs variansanalyse (envejs ANOVA) og Duncan sammenligninger blev anvendt. Alle statistiske tests blev udført under anvendelse af SPSS til Windows, version 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant ved P
< 0,05.
Resultater Salg Virkning af curcumin på kropsvægt og blodglucose hos diabetiske rotter Salg plasmaglucoseniveauer var stærkt forhøjet i diabetiske rotter (gruppe II) [(322 ± 41) mg /dl] sammenlignet med dem i normale kontrolrotter (gruppe i) [(98 ± 12) mg /dl]. Der var en markant nedgang i kropsvægt i gruppe II rotter [(298 ± 16) g] sammenlignet med samme alderskategori gruppe I rotter [(449 ± 21) g]. Kroniske curcumin-behandlede diabetiske rotter (Gruppe III) viste ingen signifikante forbedringer i kropsvægt og ingen nedgang i plasma glucose niveauer i forhold til gruppe II rotter [Gruppe III, legemsvægt (324 ± 19) g og glucose (302 ± 38) mg /DL] (tabel 1) .table 1 Blodglucoseniveau og kropsvægt i fire grupper
grupper
Gruppe i
Gruppe II
Gruppe III

Gruppe IV
Blodsukker (mg /dl)
98 ± 12
322 ± 41 *
302 ± 38 * #
100 ± 11
Kropsvægt ( g)
449 ± 21
298 ± 16 *
324 ± 19 *
476 ± 27
Gruppe I = normale rotter kontrol; Gruppe II = rotter diabetiske kontrol; Gruppe III = diabetisk + curcumin behandlede rotter (150 mg /kg); Gruppe IV = normal + curcumin behandlede rotter (150 mg /kg). Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SD. * P
< 0,05 (sammenlignet med gruppe I), #P
> 0,05 (sammenlignet med gruppe II)
Effekt af curcumin på gastrisk tømning
Gastrisk tømning blev betydeligt forsinket i SD-rotter, der havde haft diabetes i 8 uger. . Mængden af ​​gastrisk tømning i gruppe II var 44,3 ± 5,7%, hvilket var væsentligt lavere end i gruppe I [(76,2 ± 4,3)%, P
< 0,01], og diabetiske rotter undergår curcumin behandling [(Gruppe III) ,; (59,4 ± 7,5)%, P
< 0,05]. Imidlertid blev ingen signifikant forskel bemærket mellem gruppe I og gruppe IV rotter [(73,3 ± 5,2%), P
> 0,05] (Figure1). Figur 1 Virkninger af curcumin på mavetømning hos diabetiske rotter. Gruppe I = rotter normale kontrol (n = 10); : Gruppe II rotter = diabetiske kontrol (n = 10); : Gruppe III = diabetisk + curcumin behandlede rotter (n = 10); : Gruppe IV = normal + curcumin behandlede rotter (n = 10). Alle værdier er udtrykt som middelværdi ± SD. * P
< 0,01 (i forhold til gruppe I), # p
< 0,05 (i forhold til gruppe II), Ap
>. 0,05 (i forhold til gruppe I)
Curcumin behandling faldt MDA dannelse, øger SOD aktivitet
Vi undersøgte oxidativt stress ved hjælp af flere metoder, fordi glukose-induceret oxidativ stress er blevet postuleret at være en central mekanisme i kroniske diabetiske komplikationer. Diabetiske rotter udviste øget MDA niveauer [gruppe I 15,7 ± 1,7 (nmol /mg) vs
Gruppe II 27,9 ± 2,1 (nmol /mg), P
= 0,006] og faldt SOD niveauer [gruppe I 146,2 ± 9,3 ( U /mg) vs
Gruppe II 107,9 ± 7,5 (U /mg), P
= 0,008], en molekylær markør for oxidativt stress (Figur 2). Seks ugers curcumin behandling reducerede graden af ​​MDA opregulering [Gruppe III, 21,4 ± 1,8 (nmol /mg), P
= 0,033 versus gruppe I og P
= 0,004 versus gruppe II], og forbedret SOD ned -forordning [Gruppe III 126,2 ± 8,8 (enheder /mg), P
= 0,036 versus gruppe I og P
= 0,001 versus gruppe II]. Curcumin væsentligt forbedret SOD-aktivitet og reduceret MDA-niveauer i mave homogenater. Desuden blev ingen signifikant forskel bemærket mellem gruppe I og gruppe IV dyr (P
> 0,05; Figur 2). Figur 2 Virkninger af curcumin på MDA og SOD i diabetiske rotter. Niveauerne af MDA blev nedsat efter behandling med curcumin, blev niveauerne af SOD steg efter behandling med curcumin. : Gruppe I = rotter normale kontrol (n = 10); : Gruppe II = rotter diabeteskontrollen (n = 10); gruppe III = diabetisk + curcumin behandlede rotter (n = 10); : Gruppe IV = normal + curcumin behandlede rotter (n = 10). Alle værdier er udtrykt som middelværdi ± SD * p
. ≪ 0,01 (sammenlignet med gruppe I), # p
< 0,01 (sammenlignet med gruppe II), Ap
> 0,05 (sammenlignet med gruppe i).
Curcumin forøger SCF og c-kit-proteinniveauer
Repræsentative billeder af RT-PCR-analyse af SCF i maven væv af rotter i hver gruppe er vist i Figure3A. Sammenlignet med gruppe I, SCF var signifikant lavere i gruppe II [(0,44 ± 0,02) vs
(0,69 ± 0,03), P
= 0 .002], og en sammenligning af værdierne i gruppe III viste, at SCF niveau i curcumin-behandlede rotter var større end i gruppe II [(0,58 ± 0,04) vs
(0,44 ± 0,03) P
= 0 .003]. Imidlertid blev ingen forskelle mellem grupperne I og IV [(0,69 ± 0,03) vs
(0,66 ± 0,03) P
= 0,56] (Figure3B). Western blot-analyse (Figure4A, B) viste, at niveauet af SCF i mave væv fra gruppe II-rotter var signifikant lavere end dem i gruppe I og III-rotter [forhold mellem (0,33 ± 0,02) vs
(0,47 ± 0,03) og (0,41 ± 0,02), henholdsvis P
< 0 .05)]. Imidlertid blev ingen signifikant forskel mellem gruppe IV og gruppe I rotter [(0,45 ± 0,03) vs
(0,47 ± 0,03), P
> 0,05)], tyder på, at curcumin indgreb effektivt kunne genoprette lokale SCF protein niveauer i maven væv af diabetiske rotter. Figur 3 Ændringer i SCF /GAPDH og C-kit /GAPDH ved RT-PCR-analyse. (A) Repræsentative billeder af gelelektroforese af GAPDH, SCF, og c-kit i rotter i hver gruppe. (B) Gruppe niveauer af relativ mRNA udtryk for SCF og c-kit, med produkter kvantificeret ved forholdet til GAPDH. : Gruppe I = rotter normale kontrol (n = 10); : Gruppe II rotter = diabetiske kontrol (n = 10); : Gruppe III = diabetisk + curcumin behandlede rotter (n = 10); : Gruppe IV = normal + curcumin behandlede rotter (n = 10). Alle værdier er udtrykt som middelværdi ± SD. * P
< 0,01 (i forhold til Group I.), # p
< 0,05 (i forhold til gruppe II), Ap
>. 0,05 (i forhold til gruppe I)
figur 4 ændringer i SCF /GAPDH og C-kit /GAPDH ved Western blot-analyse. (A) repræsentant proteinbånd billeder af SCF, c-kit, og glyceraldehyder-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH). (B) Gruppe niveauer af relativ SCF og c-kit protein ved forholdet udtrykt til GAPDH henholdsvis. : Gruppe I = rotter normale kontrol (n = 10); : Gruppe II rotter = diabetiske kontrol (n = 10); : Gruppe III = diabetisk + curcumin behandlede rotter (n = 10); : Gruppe IV = normal + curcumin behandlede rotter (n = 10). Alle værdier er udtrykt som middelværdi ± SD. * P
< 0,01 (i forhold til gruppe I), # p
< 0,01 (i forhold til gruppe II), Ap
>. 0,05 (i forhold til gruppe I)
RT-PCR analysen viste, at ekspressionsniveauer for c-kit i maven væv var 0,78 ± 0,04, 0,37 ± 0,02, og 0,59 ± 0,03 for gruppe i, II og III, henholdsvis. C-kit-ekspressionsniveauer i gruppe II og III rotter var lavere end i gruppe I rotter. en sammenligning af gruppe II og III viste imidlertid, at c-kit-niveau i curcumin-behandlede rotter var større end i ikke-behandlede diabetiske rotter (P
< 0,05, Figure3B). Lignende resultater blev påvist ved Western blot-analyse (Figure4B). Niveauerne af c-kit protein (forhold mellem 0,45 ± 0,03, 0,21 ± 0,02 og 0,34 ± 0,02, henholdsvis for gruppe I, II og III) var meget større i gruppe III end i gruppe II (P
< 0 0,05, Figure4B), og niveauet i gruppe III var lavere end i gruppe i og IV. Begge analyser viste, at 6 ugers curcumin indgriben i væsentlig grad kan genoprette faldet i c-kit-niveauer i diabetiske rotter.
Curcumin hæmmer I-KB-nedbrydning og NF-KB-aktivering
Rapporter viser, at øget og kronisk oxidativ stress kan aktivere eller forstyrre NF-KB-aktivitet [24]. Vi undersøgte, om curcumin kan resultere i aktivering af NF-KB-signalering pathway. For at gøre dette, vi målte niveauerne af NF-KB i nærvær eller fravær af curcumin at identificere, om NF-KB blev aktiveret. Først, vi vurderet de proteinniveauer i I-KB, hvortil inaktiveret NF-KB binder. Vi fandt, at niveauet af I-KB i gruppe I rotter var højere end i gruppe II rotter, mens niveauet i gruppe III-rotter var lavere end i gruppe II rotter (p < 0,01), men højere end niveauerne i grupper I og IV rotter (p < 0,05). Derefter undersøgte vi, om curcumin kunne blokere NF-KB. Vi fandt, at diabetes (gruppe II) førte til en stigning i NF-KB-niveauer [gruppe I 75,5 ± 7,7 (pg /ml) versus
Gruppe II 102,8 ± 12,4 (pg /ml), P
= 0,001] , mens behandling med curcumin [Gruppe III 91,3 ± 8,9 (pg /ml)] forhindrede denne virkning. Baseret på dette fund, vi foreslog, at curcumin undertrykker aktiveringen af ​​NF-KB [Gruppe IV 70.9 ± 8,1 (pg /ml), P
= 0,026] (Figure5). Vi undersøgte, om curcumin kunne blokere NF-KB translokation ind i kernen, fordi nuklear translokation er anerkendt som en celle reaktion på ROS stimulering og synes at korrelere med NF-KB transkriptionel aktivering. For at vurdere dette, vi målte niveauet af NF-KB i kernen af ​​EMSA. Udvikling af diabetes inducerede en forøgelse af NF-KB-niveauer i kernen, mens behandling med curcumin forhindret denne effekt (Figure6). Vi foreslog således, at curcumin ikke kun indirekte undertrykker aktiveringen af ​​NF-KB-DNA binding, men at det også undertrykker aktivering opstrøms for I-KB. Figur 5 Virkning af curcumin på I-KB og NF-KB. (A) søjlediagrammet var klar afspejling af niveauet af I-KB og NF-KB blandt fire grupper. (B) omfanget af I-KB /GAPDH blev reduceret i gruppe II, men forøget med curcumin. I: Gruppe I = rotter normale kontrol (n = 10); II: Gruppe II = rotter diabetiske kontrol (n = 10); III: Gruppe III = diabetisk + curcumin behandlede rotter (n = 10); IV: Gruppe IV = normal + curcumin behandlede rotter (n = 10). Alle værdier er udtrykt som middelværdi ± SD * p
. ≪ 0,01 (sammenlignet med gruppe I), # p
< 0,01 (sammenlignet med gruppe II), Ap
> 0,05 (sammenlignet med Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Pancreaticogastrostomy i ren laparoskopisk pancreaticoduodenectomy-En roman pancreas-gastrisk anastomose teknik -
• Genekspressionsanalyse af en Helicobacter pylori-inficerede og høj-salt kost-behandlede mus gastrisk tumor model: identifikation af CD177 som en ny prognostisk faktor i patienter med gastrisk cancer