Curcumin verbessert die Expression von SCF /c-kit durch oxidativen Stress zu dämpfen und NF-kappaB Aktivierung im Magengewebe von diabetischen gastroparesis rats

Curcumin verbessert die Expression von SCF /c-kit durch oxidativen Stress zu dämpfen und NF-kappaB Aktivierung im Magengewebe von diabetischen gastroparesis Ratten
Zusammenfassung
Hintergrund
Diabetes mellitus ist mit vielen Arten von Komplikationen verbunden. Jüngste Studien haben gezeigt, dass oxidativer Stress und entzündliche Reaktionen in der Pathogenese von diabetischer Gastroparese kritische Rollen gezeigt. Curcumin ist bekannt, Antioxidationsmittel zu haben und entzündungshemmende Eigenschaften. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Wirkung von Curcumin auf die diabetische Motilität des Magens in einem Modell Sprague Dawley Ratten von Typ-1-Diabetes mellitus.
Methoden
Männliche SD-Ratten in eine Kontrollgruppe eingeteilt, eine Kontrollgruppe Curcumin, Diabetiker-Gruppe und eine diabetische Gruppe mit Curcumin. Diabetes wurde durch intraperitoneale Injektion von Streptozotocin induziert. Curcumin (150 mg /kg) wurde intragastrisch für 6 Wochen verabreicht, und der Blutzuckerspiegel und das Körpergewicht wurden gemessen. Mägen wurden zur Analyse der Magenentleerung Raten ausgeschnitten, und Niveaus von oxidativem Stress. NF-kappaB, I-kappaB und Stammzellfaktor (SCF) /c-kit-Proteinspiegel durch Western-Blot-Analyse untersucht wurden, während die Apoptose der interstitiellen Cajal-Zellen (ICCs) durch TUNEL-Färbung beurteilt.
Ergebnisse
Curcumin-behandelten diabetischen Ratten zeigten deutlich verbesserte Raten Magenentleerung [(59,4 ± 7,5)%] im Vergleich zu diabetischen Ratten [(44,3 ± 5,7)%] sowie verringerte Mengen an MDA [21,4 ± 1,8 (nmol /mg) vs
27,9 ± 2,1 (nmol /mg)], und erhöhte SOD-Aktivität [126,2 ± 8,8 (Einheiten /mg) vs
107,9 ± 7,5 (Einheiten /mg)]. Auf der anderen Seite war die Magenentleerung Ebene in der Kontrollgruppe nicht signifikant verschieden von derjenigen in der Kontrollgruppe Curcumin Behandlung. Darüber hinaus Curcumin-behandelten diabetischen Ratten signifikant erhöhte Konzentrationen von SCF /c-kit Protein im Magen Gewebe zeigte, gehemmt I-kappaB-Abbau und NF-kappaB-Aktivierung und reduziert ICC Apoptose-Index [(26,2 ± 4,1)% vs
(47,5 ± 6,2)%], verglichen mit der diabetischen Gruppe.
Fazit
Curcumin Behandlung Magenentleerung verbessert, indem die Produktion von oxidativem Stress zu blockieren, die Abschaffung der NF-kappaB Signalübertragung und der Steigerung der Expression von SCF /c-kit in Ratten, die mit diabetischer Gastroparese.
Schlüsselwörter Curcumin Diabetic Stress gastroparesis Oxidative NF-kappaB Zellfaktor /c-kit interstitielle Cajal-Zellen Einleitung
diabetische Gastroparese ist eine Erkrankung des Verdauungstraktes, definiert als verzögerte Entleerung Stamm eine feste Mahlzeit und wird in 30-50% der Patienten mit Typ-1- oder Typ-2-Diabetes mellitus [1] gesehen. Die Patienten häufig vorhanden oberen Magen-Darm-Symptome, wie frühes Sättigungsgefühl, Gewichtsverlust, Blähungen, Bauchschmerzen, Übelkeit, Erbrechen treten häufig, und die glykämische Kontrolle beeinträchtigt, und die Krankheit wirkt sich ernsthaft Patienten Lebensqualität.
Gastroparesis wird zunehmend als bedeutendes Gesundheitsproblem anerkannt. Obwohl gastroparesis weltweit viele Diabetiker betroffen sind, sind nicht nur die Behandlungsmöglichkeiten sehr begrenzt sind, sondern auch die Behandlungen, die zur Behandlung des diabetischen Gastropathie verfügbar sind, sind häufig unwirksam. Dazu gehören medizinische Therapie, Magen-elektrische Stimulation, chirurgische Therapie und Ernährung zu unterstützen. Medikamente für gastroparesis umfassen Metoclopramid, Domperidon, Cisaprid und Erythromycin. Während diese Mittel zur Behandlung von Gastroparese verwendet wurden, haben sie berichtet von nur beschränkter Wirksamkeit zu sein, und viele Patienten können sie nicht wegen ihrer Nebenwirkungen vertragen. Bei diabetischen Patienten mit refraktärer gastroparesis, hochfrequente elektrische Stimulation des Magens durch eine permanent implantierte System signifikant oberen Verdauungstrakt Symptome verbessert und stellt eine alternative chirurgische Therapie für die Patienten. Chirurgische Eingriffe, wie Gastrektomie und antrectomy sind die letzte Option für die Behandlung, ist umstritten und in der Notwendigkeit mehr Studie [2]. Bei Patienten mit schwerer gastroparesis aber normale Dünndarm-Motilität, kann Jejunostomie Sondenernährung eingesetzt werden. Während diese Ernährungsunterstützung bietet, ist es nicht gastroparesis heilen [3]. Diabetische gastroparesis wird am besten allgemein medizinisch behandelt und nur Patienten mit schweren diabetischen gastroparesis, die nicht auf die medizinische Therapie reagieren sollten andere Therapien unterziehen. Somit Drogen zu finden, die diabetische Gastroparese Wirksamkeit zeigen, ist notwendig, bei der Behandlung.
Diabetischer Gastroparese ist im Zusammenhang mit einem Verlust der interstitiellen Cajal-Zellen (ICCs) sowohl bei Menschen und Tieren Modell [4]. ICCs kann in Gewebe durch Markierung mit Antiseren an das Rezeptor-Tyrosin-kinase-Kit identifiziert werden, ein Protein, exprimiert auf ICCs. Kit und sein Ligand Stammzellfaktor (SCF) sind auch wichtige Überlebensfaktoren für ICCs [5]. Die erhöhten oxidativen Stress im Zusammenhang mit Diabetes kann bei Mäusen zu einem Verlust oder Beschädigung von ICCs führen, während oxidativem Stress führt zu beschädigen und den Verlust von ICC-Netzwerke und die Entwicklung verzögerte Magenentleerung [6]. Diabetes führt zu einer erhöhten oxidativen Stress und eine wichtige Rolle in der Pathogenese der diabetischen Komplikationen [7]. Überproduktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führt zu oxidativen Schäden, einschließlich Lipidperoxidation, Proteinoxidation, und DNA-Schäden, die zum Zelltod führen kann. Weiterhin sind ROS bekannt als sekundäre Botenstoffe wirken Transkriptionsfaktoren wie nuclear factor kappa B (NF &kgr; B) zu aktivieren. ROS erzeugt bei Stress im Magengewebe kann die Aktivierung des NF-kappaB Signalkaskade auslösen; Magenentleerung in diabetischen Ratten tatsächlich ist im Zusammenhang mit der Aktivierung von NF- &kgr; B-vermittelten Entzündung.
Curcumin (1,7-Bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl) -1, 6-Heptadien-3,5- dion) ist die wichtigste aktive Komponente von Kurkuma aus der Pflanze Curcuma longa L. isoliert Curcumin ein multifunktionales Molekül mit signifikanten regulatorischen Wirkungen auf Krebs ist [8], Entzündung [9] und diabetischen bedingten Krankheiten wie diabetische Retinopathie [10], diabetische Nephropathie [11] und Diabetes kognitiver Dysfunktion [12]. Curcumin ist ein wirksamer Fänger von reaktiven Sauerstoff und Stickstoff Spezies wie Hydroxylradikale und Stickstoffdioxid Radikale [13]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Curcumin Aktivierung von NF- &kgr; B proinflammatorischen Signalwege [14] inhibiert. Inzwischen regulieren NF &kgr; B-Transkriptionsfaktoren eine Reihe von wichtigen physiologischen Prozessen, einschließlich Entzündungs- und Immunreaktionen, Zellwachstum und Überleben, so Hemmung der NF &kgr; B-Signalisierung eine gangbare Strategie zur Krankheitstherapie dar [15]. Allerdings gab es sehr wenig Forschung über das Potenzial für Curcumin diabetische Gastroparese zu behandeln, oder auf seine pharmakologischen Mechanismus.
Das Ziel dieser Studie war es, ob bestimmen, in einer Sprague Dawley (SD) Ratten-Modell von Typ-1-Diabetes mellitus, mittleren Dosis [16] Curcumin könnte durch Reduktion von oxidativem Stress und die Hemmung von NF-kappaB-Aktivierung, die Erhöhung SCF /Kit Ausdruck, und die Normalisierung der Verzögerung bei der Magenentleerung.
Materialien und Methoden bei diabetischen Ratten mit einer verzögerten Magenentleerung ICCs schützen
Experimentelle Ratten und Induktion von Diabetes
Männliche SD-Ratten (8 Wochen alt) wurden in der Mitte der Versuchstiere gezüchtet, Zhejiang Chinese Medical University, (Hangzhou, China), wo eine spezifische pathogenfreie (SPF) -Level-Labor wurde von der Zhejiang Provinz-Regierung autorisiert. Alle Ratten wurden unter Bedingungen kontrollierter Feuchtigkeit (50-60%) untergebracht. Sie wurden unter kontrollierten Licht (12 h Tag /Nacht-Zyklus) mit freiem Zugang zu Wasser und Nagerfutter gehalten. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Lizenz von der Provinz Zhejiang Science and Technology Office (Hangzhou, China) und mit Genehmigung aus dem Tierethikkommission der Zhejiang Chinese Medical University durchgeführt. Alle Versuche entsprachen Leitlinien für ethisches Verhalten in der Pflege und Verwendung von Tieren. Es wurde alles unternommen Stress für die Tiere zu minimieren.
Ratten fasteten 12 Stunden lang auf eine einzelne intraperitoneale Injektion von Streptozotocin (STZ) unterzogen wurden, 50 mg /kg, frisch in 100 mM Puffer Natriumcitrat bei pH 4,5 gelöst. Altersangepassten normalen Ratten erhielten nur Citratpuffer. Entwicklung von Diabetes wurde durch Nüchternblutzucker (FBG) -Spiegel unter Verwendung eines Reagens-Kits (Roche, Shanghai, China) bestätigt. Ratten mit FBG Stufen höher als 11,1 mM (200 mg /dl) bei 72 h nach der STZ-Injektion wurden als diabetische Ratten sein. Nachdem die Ratten Diabetiker wurde, wurden ihre Zuckerspiegel täglich gemessen. Experimente begonnen 8 Wochen nach der Entwicklung von Diabetes zu entwickeln gastroparesis zu ermöglichen.
Experimentelles Design
Acht Wochen nach der Entwicklung von Diabetes, Tiere in vier Gruppen eingeteilt, dh die normale Steuerung männlichen Ratten (Gruppe I), diabetische männlich Ratten (Gruppe II), Curcumin-ergänzt diabetischen männlichen Ratten (Gruppe III) und Curcumin ergänzten Steuer männlichen Ratten (Gruppe IV). (; I.g. 150 mg /kg) für 6 Wochen Ratten in den Gruppen III und IV (n = 10 pro Stück) wurden täglich mit Curcumin behandelt. Curcumin (Reinheit > 95%) von Fusong County Natur Biotechnology Company Ltd. (Jilin, China), wurde in 0,5% w /v Natriumcarboxymethylcellulose (CMC-Na) Lösung suspendiert. Ratten in Gruppe I und II (n = 10 each) erhielt 0,5% CMC-Na-Lösung nur. Nach einer Behandlung von 6 Wochen wurden die Tiere unter Anästhesie Ethylether getötet, Blut wurde durch Oberschenkelvene Blutungen und Serum gesammelt wurde abgetrennt. Mägen wurden schnell entfernt, und Gewebeproben von Tieren gesammelt wurden bei -80 ° C gelagert, bis sie für biochemische Assays verarbeitet. Magenentleerung, oxidativer Stress, NF-kappaB-Aktivierung, ICCs und SCF /Kit Ausdruck in Mägen wurden auch am Ende der sechsten Woche der Behandlung untersucht (14 th Woche von Diabetes).
Magenentleerung Studien
Das Standardverfahren zur Herstellung eines Phenol roten Marker Mahlzeit vorbereitet wurde zuvor [17], wie beschrieben eingesetzt. Magenentleerung wurde unter Verwendung einer Modifizierung eines früher berichteten Verfahren bestimmt [18]. Die Ratten hatten freien Zugang zu Wasser, bis 3 h vor der Schlundsonde Verabreichung von Curcumin erlaubt. Eine Lösung von 0,1% (w /v) Phenolrot in wässriger Natriumcarboxymethylcellulose (1,5% w /v) wurde als Testmahlzeit verwendet. Curcumin wurde 1 h vor der oralen Verabreichung der Testmahlzeit gegeben. Zwanzig Minuten nach der Verabreichung der Testmahlzeit wurden die Ratten getötet. Die Mägen wurden dann durch Laparotomie freigelegt und entfernt. Ratten, die mit dem Vehikel behandelt (Kochsalzlösung, 0,9% Natriumchloridlösung, 0,2 ml) wurden unmittelbar nach der oralen Verabreichung der Testmahlzeit und den Phenolrot-Gehalt im Magen geopfert wurde als Standard (100%) betrachtet. Die entnommenen Mägen wurden in 40 ml NaOH-Lösung (0,1 N) eingeschnitten und der Inhalt wurde aufgelöst. Ein 1 ml-Aliquot der Waschlösungen wurde auf 2 ml Trichloressigsäure (7,5% w /v) hinzugefügten Proteine ​​auszufällen. Nach Zentrifugation (2500 × g
) für 20 min, 1 ml des Überstandes wurden zu 1 ml NaOH (1 N) die maximale Intensität der Farbe zu entwickeln. Die Extinktion bei 558 nm der Lösung wurde dann gemessen unter Verwendung eines Spektrophotometers (U-1080, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan). Die Magenentleerung wurde berechnet nach der folgenden Formel: Magenentleerung %
=
1 | -
X
/Y
×
100

wobei X die Absorption von Phenolrot restlichen im Magen 20 Minuten nach der Verabreichung von Phenolrot ist und Y ist die mittlere Absorption von Phenolrot erholte sich von den Mägen der Kontrollmäuse unmittelbar nach Phenolrot Verabreichung.
Bestimmung von MDA und SOD Ebenen in der glatten Muskulatur der Magenantrum
Die Mägen herausgeschnitten wurden, gewogen und sofort bei -70 ° C eingefroren. Gefrorenes Gewebe von jeder Ratte wurde in eiskaltem Phosphat-Puffer (140 mM KCl, 20 mM Phosphat, pH 7,4) und zentrifugiert bei 3000 × g für 10 min
homogenisiert. Der Gehalt an Malondialdehyd (MDA), ein Index für die Lipidperoxidation wurde unter Verwendung des Thiobarbitursäure (TBA) -Verfahren mit einer leichten Modifikation [19] bestimmt. Kurz gesagt, wurde TBA mit 200 &mgr; l Arbeitslösung, enthaltend 0,37% 100 ul Gewebehomogenat gemischt. Das Gemisch wurde 15 min bei 100 ° C inkubiert und anschließend abgekühlt. Zu extrahieren MDA wurde 375 &mgr; l n-Butanol gegeben, gefolgt von kräftigem Vortexen für 10 s. Nach Zentrifugation wurde die obere n-Butanol-Schicht auf ein Glasröhrchen überführt. Die Extinktion der Butanol-Phase wurde bei 532 nm gemessen. MDA-Gehalt wird als nmol /mg Protein ausgedrückt. Für die Messung der SOD-Aktivität wurden 20 &mgr; l Gewebehomogenat mit 200 ul Reaktionslösung gemischt Nitroblautetrazoliumchlorid enthält (NBT, 750 uM), und für 20 min bei 37 ° C inkubiert. Die Extinktion bei 560 nm wurde gemessen. Die Enzymaktivität wird als Einheiten /g Protein und 1 Einheit Enzym exprimiert wurde als die Menge an Enzym definiert, die erforderlich die Reduktion von NBT um 50% zu hemmen.
Semiquantitative RT-PCR-Messung der SCF und c-kit
The proximalen Magen (40-50 mg) wurde geerntet, und die Schleimhaut wurde durch Sezieren entfernt. Das Gewebe wurde mechanisch unter RNase-freien Bedingungen homogenisiert und dissoziierte mit Tripure Isolations Reagenz (Roche, Schweiz) auf Eis für 5 Minuten, und die Gesamt-RNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Gesamt-RNA wurde spektrophotometrisch bei 260 und 280 nm, mit dem A260 /A280 Verhältnis von 1,8 bis 2,0 reicht quantifiziert. RNA-Integrität wurde durch Agarose-Gelelektrophorese, gefolgt von Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen, und RNA wurde für die sofortige reverse Transkription oder gelagert bei -80 ° C in RNase-freiem Wasser verwendet. Zwei-Schritt-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) wurde durchgeführt unter Verwendung des Revertra ace-α- Erststrang-cDNA-Synthese-Kits (Tiangen Biotech, Beijing, China) und 2 × Taq-PCR-Master-Mix (Tiangen Biotech) nach Anweisungen des Herstellers. Eine feste Menge an RNA (0,5 ug) wurde revers transkribiert. Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) wurde als interner Standard ausgewählt. Alle PCR-Primer wurden entworfen und synthetisiert durch Biosune (Shanghai, China). Die Primer-Sequenzen und Längen der PCR-Produkte sind wie folgt: GAPDH, nach vorn: 5 '- GACAACTITG-GCATCGTGGA-3 ', Reverse: 5 '- ATGCAGGGATGATGT-TCTGG-3 ' 150 bp; SCF, nach vorn: 5 '- GGA CTT CAT GGT GGC ATC TG-3 ', Reverse: 5 '- GCC CTT GTA AGA CTT GAC TG-3 ', 285 bp; und c-kit, nach vorn: 5 '- GTG GTT AAA GGA AAC GCT CG-3 ', Reverse: 5 '- CAT ACA TTT CAG CAG GTG CG-3 ', 400 bp. Die Reaktionsbedingungen wurden für jedes der Gene optimiert durch Variation der Annealing-Temperatur (58 ° C für GAPDH, 58 ° C für SCF und 62 ° C für c-kit) und eine unterschiedliche Anzahl von PCR-Zyklen [20]. Die PCR-Produkte wurden für 30 Minuten bei 100 V auf einem 2% Agarose-Gelen aufgetrennt. Gel Bilder auf dem Flüssigkristallanzeigemonitor eines Ultraviolett-Durchleuchtungs PhotoDoc-Ite-System ausgestattet mit einer CCD-Kamera angezeigt wurden (Bio-Rad Gel Doc 2000, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) und für die Intensitätsanalyse aufbewahrt. Die relativen mRNA-Konzentrationen der ausgewählten Gene wurden als das Verhältnis zu GAPDH Ausdruck berechnet.
Levels von SCF, c-Kit, lkB und NF-kappaB durch Western-Blot-Analyse
Etwa 50 mg Gewebe beurteilt wurde aus dem genommen nahe dem proximalen Magen. Die Gewebe wurden geschnitten in kleine Stücke von etwa 0,25 cm 3, homogenisiert und distanzierte in Radio-Immunopräzipitation Lysepuffer (Hushang Biotechnologie, Shanghai, China), die 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% Natriumdesoxycholat, 1% Natriumdodecylsulfat, 1 mM PMSF, Natriumorthovanadat, Natriumfluorid, Ethylendiamintetraessigsäure und Leupeptin bei 4 ° C für 30 Minuten. Die Homogenate wurden für 5 Minuten bei 4 ° C, und die Überstände als Gesamtprotein gesammelt und verwendet, wurden bei 12 000 × g zentrifugiert
. Gleiche Mengen an Protein wurden durch SDS-PAGE in 10% oder 15% igen Polyacrylamidgelen elektrophoretisiert. Die Proteine ​​wurden auf Nitrocellulose-Membranen (Hushang Biotechnology) durch semidry Blotting übertragen. Membranen wurden mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung 0,1% Tween 20 (TBST) mit 5% Milch für 60 Minuten bei Raumtemperatur blockiert und dann mit in geeigneter Weise verdünnten primären Antikörpern bei 4 ° C über Nacht-immuno geblottet. Nach dreimaligem Waschen mit TBST wurden die Blots mit HRP-konjugiertem sekundärem Antikörper für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden die Komplexe visualisiert eine iChemi XR Imaging System (WD9431A, Bomeike Biotechnologie, China) mit Chemilumineszenz-Reagenzien (Tigsun Biological Science Technologie, Tianjin, China). Semi-Quantifizierung wurde mit Quantity One Software durchgeführt, Version 4.6.2 (Bio-Rad). Die folgenden Antikörper wurden verwendet: anti-SCF, 1: 200, c-kit, 1: 200, anti-lkB und Anti-NF-kappaB p65 und GAPDH., 1: 500 (Hushang Biotechnologie, Shanghai, China)
Quantifizierung von NF &kgr; B -DNA durch elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassay
Kernextrakte wurden aus Bindungs ​​Magen-Lysate hergestellt, wie zuvor beschrieben [21]. NF-kappaB Aktivierung durch eine elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (EMSA) und nukleäre Translokation von NF-kappaB bestimmt wurde, wie zuvor beschrieben bewertet (GS009, Beyotime Institut für Biotechnologie, Shanghai, China) [22]. Für NF &kgr; B Bindungsreaktionen, 5 &mgr; g Kernproteinextrakt wurde 20 min mit Reaktionspuffer, enthaltend 20 mM HEPES, pH 7,9, 50 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% Glycerin, 200 &mgr; g bei Raumtemperatur inkubiert /ml BSA und 2 &mgr; g Poly (dI-dC). Dann 32 P-markierten doppelsträngigen Oligonukleotids (1 ng ≥1 × 105 cpm) die NF &kgr; B-Bindungskonsensussequenz enthält (5 '- GGCAACCTGGGGACTCTCCCTTT-3 ') wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben für weitere 10 min bei Raumtemperatur. Die Reaktionsprodukte wurden bei 350 für 60 min auf einem nicht-denaturierenden 6% igen Polyacrylamidgel fraktioniert V, die dann getrocknet und einer Autoradiographie bei -70 ° C über Nacht unterzogen. Für kompetitive Assays, Überschuss-Oligonukleotid (100-fachen molaren Überschuss) Konkurrent war vorinkubiert mit Kernextrakten für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Mutiertes NF &kgr; B-Oligonukleotid (5 '- GGCAACTGCTCACTCTCCCTTT-3 ') wurde für die Konkurrenz-Assay verwendet. Die Signale wurden densitometrisch analysiert.
Doppel immunofluorohistochemistry mit Desoxyribonukleotidyltransferase-vermittelte dUTP-Biotin nick end labeling-Assay (TUNEL) und c-kit-Färbung
Fluoreszenz Immunhistochemie für c-kit (mit dem Antikörper von Santa Cruz) und TUNEL Anfärbung wurden auf 10 &mgr; m-Abschnitte durchgeführt, die vom Hersteller des TUNEL-Kit (TACS STDT, Trevigen Inc, Gaithersburg, MD) veröffentlicht eine Modifikation des Verfahrens verwendet wird. TUNEL-positiven Zellen mit Fluorescein markiert wurden (Ex 488, Em 505-550), c-Kit-positive Zellen wurden mit Cy3 (Ex 543, Em 560-615) markiert, und Kerne wurden mit DAPI (Ex beschriftet 364, Em 385 -470). Gewebeproben wurden in Fluoreszenz Eindeckmedium eingebettet und durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie untersucht [23]. Etwa 200 Zellen wurden pro Feld gezählt, fünf Felder wurden untersucht pro Folie und fünf Objektträger wurden pro Gruppe untersucht. Die Prozentsätze der TUNEL- und c-kit-positive apoptotischen Zellen wurden als apoptotische Index (AI) (%) bezeichnet.
Statistical analysis
Alle Daten sind als Mittelwerte ± SD. Zum Vergleich von Daten zwischen Gruppen von Tieren, one-way Varianzanalyse (one-way ANOVA) und Vergleiche Duncan eingesetzt wurden. Alle statistischen Tests wurden unter Verwendung von SPSS für Windows, ausgeführt Version 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Unterschiede waren statistisch signifikant betrachtet bei P
< 0,05.
Ergebnisse
Wirkung von Curcumin auf das Körpergewicht und den Blutzucker diabetischer Ratten
Plasmaglucosespiegel wurden bei diabetischen Ratten (Gruppe II) [(322 ± 41) mg /dl] im Vergleich mit denen stark erhöhten in normalen Kontrollratten (Gruppe I) [(98 ± 12) mg /dl]. Es gab einen deutlichen Rückgang in den Körpergewichten der Gruppe II Ratten [(298 ± 16) g] im Vergleich zu altersentsprechenden Gruppe I Ratten [(449 ± 21) g]. Chronic Curcumin-behandelten diabetischen Ratten (Gruppe III) zeigten keine signifikanten Verbesserungen des Körpergewichts und keine Abnahme der Plasmaglucosespiegel im Vergleich mit Gruppe II Ratten [Gruppe III, das Körpergewicht (324 ± 19) g und Glucose (302 ± 38) mg /dl] (Tabelle 1) .Tabelle 1 Blutzuckerspiegel und das Körpergewicht in vier Gruppen
Gruppen
Gruppe I
Gruppe II
Gruppe III

Gruppe IV
Blutzucker (mg /dl)
98 ± 12
322 ± 41 *
302 ± 38 * #
100 ± 11
Körpergewicht (in g)
449 ± 21
298 ± 16 *
324 ± 19 *
476 ± 27
Gruppe I = normal Kontrollratten; Gruppe II = diabetischen Kontrollratten; Gruppe III = diabetische + Curcumin behandelten Ratten (150 mg /kg); Gruppe IV = normal + Curcumin behandelten Ratten (150 mg /kg). Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD dargestellt. * P
< 0,05 (im Vergleich zur Gruppe I), #P
> 0,05 (im Vergleich zu Gruppe II)
Wirkung von Curcumin auf die Magenentleerung
Magenentleerung deutlich in SD-Ratten verzögert wurde, die Diabetes für 8 Wochen gehabt hatte. . Die Menge der Magenentleerung in Gruppe II war 44,3 ± 5,7%, was als signifikant niedriger war in der Gruppe I [(76,2 ± 4,3)%, P
< 0,01] und diabetischen Ratten unterzogen Curcumin Behandlung [(Gruppe III) ,; (59,4 ± 7,5)%, P
< 0,05]. Jedoch wurde zwischen Gruppe I und Gruppe IV-Ratten [(73,3 ± 5,2%), P >
kein signifikanter Unterschied festgestellt; 0,05] (Abbildung 1). Abbildung 1 Wirkungen von Curcumin auf die Magenentleerung bei diabetischen Ratten. Gruppe I = normal Kontrollratten (n = 10); : Gruppe II = diabetischen Kontrollratten (n = 10); : Gruppe III = Curcumin diabetische + Ratten behandelt wurden (n = 10); : Gruppe IV = Curcumin behandelten Ratten normal + (n = 10). Alle Werte sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. * P
< 0,01 (im Vergleich zu der Gruppe I), # p
< 0,05 (im Vergleich zu Gruppe II), Ap
>. 0,05 (im Vergleich zu der Gruppe I)
Curcumin Behandlung verringert MDA Bildung erhöht SOD-Aktivität
Wir oxidativen Stress mit verschiedenen Methoden, weil Glucose-induzierten oxidativen Stress ein wichtiger Mechanismus bei der chronischen diabetischen Komplikationen zu postuliert wurde untersucht. Diabetische Ratten zeigten MDA-Pegel erhöht [Gruppe I 15,7 ± 1,7 (nmol /mg) vs
Gruppe II 27,9 ± 2,1 (nmol /mg), P
= 0,006] und verringert SOD Ebenen [Gruppe I 146,2 ± 9,3 ( u /mg) vs
Gruppe II 107,9 ± 7,5 (u /mg), P
= 0.008], ein molekularer Marker für oxidativen Stress (Abbildung 2). Sechs Wochen von Curcumin Behandlung reduziert den Grad der MDA upregulation [Gruppe III, 21,4 ± 1,8 (nmol /mg), P
= 0,033 im Vergleich zu der Gruppe I und P
= 0,004 im Vergleich zu der Gruppe II], und verbessert die SOD nach unten -Regelung [Gruppe III 126,2 ± 8,8 (Einheiten /mg), P
= 0,036 im Vergleich zu der Gruppe I und P
= 0,001 im Vergleich zu der Gruppe II]. Curcumin signifikant SOD-Aktivität verbessert und reduziert MDA Spiegel im Magen Homogenaten. Darüber hinaus wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen I und IV Tiere festgestellt (P
> 0,05; Abbildung 2). Abbildung 2 Wirkungen von Curcumin auf MDA und SOD in diabetischen Ratten. Die Gehalte an MDA vermindert wurde, nachdem sie mit Curcumin behandelt wurden die Konzentrationen von SOD nach mit Curcumin behandelt erhöht. : Gruppe I = normalen Kontrollratten (n = 10); : Gruppe II = diabetischen Kontrollratten (n = 10), Gruppe III Curcumin diabetische + behandelten Ratten = (n = 10); : Gruppe IV = Curcumin behandelten Ratten normal + (n = 10). Alle Werte sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt * p
. ≪ 0,01 (im Vergleich zu Gruppe I), # p
< 0,01 (im Vergleich zu Gruppe II), &Dgr; p
> 0,05 (im Vergleich zu Gruppe I).
Curcumin erhöht SCF und c-kit Proteinspiegel
Repräsentative Bilder der RT-PCR-Analyse von SCF in den Magengeweben von Ratten in jeder Gruppe sind in Abbildung 3A gezeigt ist. Verglichen mit der Gruppe I lag der SCF signifikant niedriger in Gruppe II [(0,44 ± 0,02) vs
(0,69 ± 0,03), P
= 0 .002] und ein Vergleich der Werte in der Gruppe III zeigte, dass SCF-Niveau in Curcumin behandelten Ratten war größer als die in Gruppe II [(0,58 ± 0,04) vs
(0,44 ± 0,03) P
= 0 0,003]. Allerdings waren zwischen den Gruppen I und IV [(0,69 ± 0,03) vs
(0,66 ± 0,03) P
= 0,56] (Abbildung 3b) keine Unterschiede festgestellt. Western-Blot-Analyse (Abbildung 4a, B) zeigte, dass der Pegel des SCF in Magengewebe von Ratten der Gruppe II als die signifikant niedriger war in Gruppe I und III Ratten [Verhältnisse von (0,33 ± 0,02) vs
(0,47 ± 0,03) und (0,41 ± 0,02) beziehungsweise P
< 0 .05)]. Es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen der Gruppe IV und Gruppe-I-Ratten [(0,45 ± 0,03) vs
(0,47 ± 0,03), P >
gefunden; 0.05)], was darauf hindeutet, dass Curcumin Intervention effektiv lokale SCF-Proteinspiegel in den Magen Gewebe der diabetischen Ratten wieder herstellen könnte. Abbildung 3 Veränderungen in SCF /GAPDH und C-kit /GAPDH mittels RT-PCR-Analyse. (A) Repräsentative Bilder der Gelelektrophorese von GAPDH, SCF und c-kit in Ratten jeder Gruppe. (B) auf Konzernebene der relativen mRNA-Expression von SCF und c-kit, mit Produkten Verhältnis zu GAPDH quantifiziert. : Gruppe I = normalen Kontrollratten (n = 10); : Gruppe II = diabetischen Kontrollratten (n = 10); : Gruppe III = Curcumin diabetische + Ratten behandelt wurden (n = 10); : Gruppe IV = Curcumin behandelten Ratten normal + (n = 10). Alle Werte sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. * P
< 0,01 (im Vergleich zu Gruppe I), # p
< 0,05 (im Vergleich zu Gruppe II), Ap
>. 0,05 (im Vergleich zu der Gruppe I)
Abbildung 4 Änderungen in SCF /GAPDH und C-kit /GAPDH durch Western-Blot-Analyse. (A) Repräsentative Bilder Proteinbande von SCF, c-kit und Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH). (B) auf Konzernebene der relativen SCF und c-kit Protein durch das Verhältnis zu GAPDH ausgedrückt. : Gruppe I = normalen Kontrollratten (n = 10); : Gruppe II = diabetischen Kontrollratten (n = 10); : Gruppe III = Curcumin diabetische + Ratten behandelt wurden (n = 10); : Gruppe IV = Curcumin behandelten Ratten normal + (n = 10). Alle Werte sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. * P
< 0,01 (im Vergleich zu der Gruppe I), # p
< 0,01 (im Vergleich zu Gruppe II), Ap
>. 0,05 (im Vergleich zu der Gruppe I)
RT-PCR Analyse zeigte, dass die Expressionsniveaus für c-kit in Magengewebe waren 0,78 ± 0,04, 0,37 ± 0,02 und 0,59 ± 0,03 für die Gruppen I, II bzw. III. Die c-kit-Expressionsniveaus in den Gruppen II und III Ratten waren niedriger als die in der Gruppe I Ratten. Ein Vergleich der Gruppen II und III offenbart jedoch, dass der c-kit-Ebene in Curcumin-behandelten Ratten war größer als die in nicht-behandelten diabetischen Ratten (P
< 0,05, Abbildung 3b). Ähnliche Ergebnisse wurden durch Western-Blot-Analyse (Abbildung 4B) unter Beweis gestellt. Die Niveaus der c-kit-Proteins (Verhältnisse von 0,45 ± 0,03, 0,21 ± 0,02 und 0,34 ± 0,02, jeweils für die Gruppen I, II und III) waren viel höher in der Gruppe III als in Gruppe II (P
< 0 .05, Abbildung 4B) und das Niveau in der Gruppe III war niedriger als die in den Gruppen I und IV. Beide Analysen zeigten, dass 6 Wochen Curcumin Intervention signifikant die Abnahme der c-kit Ebenen bei diabetischen Ratten wieder herstellen könnte.
Curcumin hemmt I-kappaB-Abbau und NF-kappaB Aktivierung
Berichte zeigen, dass eine erhöhte und chronischem oxidativen Stress aktivieren können oder perturb NF-kappaB-Aktivität [24]. Wir untersuchten, ob Curcumin in der Aktivierung des NF-kB Signalweg führen könnte. Um dies zu tun, maßen wir das Niveau von NF &kgr; B in der Gegenwart oder Abwesenheit von Curcumin zu identifizieren, ob NF &kgr; B aktiviert wurde. Zuerst untersuchten wir die Proteinspiegel von I &kgr; B, zu dem inaktivierten NF-? B bindet. Wir fanden, dass das Niveau der I &kgr; B in der Gruppe I-Ratten war höher als die in der Gruppe II-Ratten, während der Pegel in der Gruppe III Ratten geringer war als in Gruppe II-Ratten (p < 0,01), aber höher als die Konzentrationen, in Gruppen I und IV-Ratten (p < 0,05). Dann untersuchten wir, ob Curcumin NF-kappaB blockieren könnte. Wir fanden, dass Diabetes (Gruppe II) führte zu einer Erhöhung der NF &kgr; B Ebenen [Gruppe I 75,5 ± 7,7 (pg /ml) vs
Gruppe II 102,8 ± 12,4 (pg /ml), P = 0,001
] während der Behandlung mit Curcumin [Gruppe III 91,3 ± 8,9 (pg /ml)] dieser Effekt verhindert. Basierend auf dieser Erkenntnis, schlugen wir vor, dass Curcumin unterdrückt die Aktivierung von NF-kappaB [Gruppe IV 70,9 ± 8,1 (pg /ml), P
= 0.026] (Abbildung 5). Wir untersuchten, ob Curcumin NF-kappaB-Translokation in den Zellkern blockieren könnte, weil die nukleäre Translokation als Zellreaktion auf ROS Stimulation erkannt und scheint mit NF-kappaB-vermittelte Transkriptionsaktivierung zu korrelieren. Um dies zu bewerten, gemessen wir das Niveau von NF-kappaB in den Kern von der EMSA. Entwicklung von Diabetes induziert eine Erhöhung der NF-kappaB-Spiegel im Zellkern, während der Behandlung mit Curcumin diesen Effekt (Abbildung 6) verhindert. Daher schlugen wir vor, dass Curcumin nicht nur indirekt unterdrückt die Aktivierung von NF &kgr; B-DNA-Bindung, sondern daß sie auch unterdrückt Aktivierung stromaufwärts von I &kgr; B. Abbildung 5: Wirkung von Curcumin auf der I-kappaB und NF-kappaB. (A) das Balkendiagramm war klar Reflexion der Ebene der I-kappaB und NF-kappaB unter vier Gruppen. (B) die Höhe der I-kappaB /GAPDH wurde in Gruppe II verringert, aber durch Curcumin erhöht. I: Die Gruppe I = normalen Kontrollratten (n = 10); II: Gruppe II = diabetischen Kontrollratten (n = 10); III: Gruppe III = diabetische + Curcumin behandelten Ratten (n = 10); IV: Gruppe IV = normal + Curcumin behandelten Ratten (n = 10). Alle Werte sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt * p
. ≪ 0,01 (im Vergleich zu Gruppe I), # p
< 0,01 (im Vergleich zu Gruppe II), &Dgr; p
> 0,05 (im Vergleich zu Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

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