La curcumina mejora la expresión de SCF /c-kit través de atenuar el estrés oxidativo y la activación de NF-kB en los tejidos gástricos del diabética curcumina gastroparesia rats

mejora la expresión de SCF /c-kit través de atenuar el estrés oxidativo y la activación de NF-kB en los tejidos gástricos de ratas gastroparesia diabética Resumen Antecedentes


diabetes mellitus se asocia con muchos tipos de complicaciones. Estudios recientes han demostrado que el estrés oxidativo y las reacciones inflamatorias tienen un papel crítico en la patogénesis de la gastroparesia diabética. La curcumina se sabe que tiene propiedades antioxidantes y anti-inflamatorias. En el presente estudio, se investigó el efecto de la curcumina sobre la motilidad gástrica diabética en un modelo de rata Sprague Dawley de diabetes mellitus tipo 1.
Métodos
ratas SD machos se dividieron en un grupo control, un grupo de control que recibió la curcumina, un grupo de diabéticos, y un grupo de diabéticos recibir curcumina. La diabetes fue inducida mediante inyección intraperitoneal de estreptozotocina. La curcumina (150 mg /kg) fue dada por vía intragástrica durante 6 semanas, y se midieron los niveles de glucosa en sangre y los pesos corporales. Los estómagos fueron extirpados para el análisis de las tasas de vaciado gástrico, y los niveles de estrés oxidativo. NF-B, I-kappa B, y el factor de células madre (SCF) /niveles de proteína c-kit se evaluaron mediante análisis de transferencia Western, mientras que la apoptosis de las células intersticiales de Cajal (ICC) se evaluó mediante la tinción de TUNEL.
Resultados
ratas diabéticas curcumina tratados se observó una mejoría significativa las tasas de vaciado gástrico [(59,4 ± 7,5)%] en comparación con las ratas diabéticas [(44,3 ± 5,7)%], así como la disminución de los niveles de MDA [21,4 ± 1,8 (nmol /mg) vs
27,9 ± 2,1 (nmol /mg)], y el aumento de actividad de la SOD [126,2 ± 8,8 (unidades /mg) vs
107,9 ± 7,5 (unidades /mg)]. Por otro lado, el nivel de vaciado gástrico en el grupo de control no fue significativamente diferente de la del grupo control que recibió el tratamiento de cúrcuma. Además, las ratas diabéticas tratadas con curcumina mostraron un aumento significativo de los niveles de proteína SCF /c-kit en tejidos del estómago, inhibe la degradación de I-kappa B y la activación de NF-kappa B, y la reducción de índice de apoptosis CPI [(26,2 ± 4,1)% vs
(47,5 ± 6,2)%], en comparación con el grupo de diabéticos.
Conclusión
tratamiento curcumina mejora el vaciamiento gástrico mediante el bloqueo de la producción de estrés oxidativo, la supresión de la transducción de señales NF-kB y la mejora de la expresión de SCF /c-kit en ratas con gastroparesia diabética.
Palabras clave
curcumina estrés oxidativo gastroparesia diabética NF-kB células intersticiales factor de células /c-kit de Cajal Introducción
gastroparesia diabética madre es una enfermedad del tracto digestivo, definida como retraso en el vaciamiento de una comida sólida, y se observa en el 30-50% de los pacientes con diabetes tipo 1 o diabetes mellitus tipo 2 [1]. Los pacientes a menudo presentan síntomas del tracto gastrointestinal superior, como saciedad temprana, pérdida de peso, distensión abdominal, molestias abdominales, náuseas, vómitos se producen con frecuencia, y la alteración de control de la glucemia y la enfermedad afecta seriamente la calidad de vida del paciente.
Gastroparesia está siendo cada vez reconocido como un problema de salud significativo. Aunque la gastroparesia afecta a muchos diabéticos en todo el mundo, no sólo son las opciones de tratamiento muy limitado, sino también a los tratamientos que están disponibles para la gastropatía diabética son con frecuencia ineficaces. Estos incluyen el tratamiento médico, la estimulación eléctrica gástrica, la terapia quirúrgica, y el apoyo nutricional. Los medicamentos para la gastroparesia incluyen metoclopramida, domperidona, cisaprida y eritromicina. Aunque estos agentes se han utilizado para el tratamiento de la gastroparesia, se han notificado a ser de sólo una eficacia limitada, y muchos pacientes no pueden tolerar a causa de sus efectos secundarios. En los pacientes diabéticos con gastroparesia refractaria, de alta frecuencia de estimulación eléctrica gástrica por un sistema implantado de forma permanente mejoró significativamente los síntomas del tracto digestivo superior y representa una terapia quirúrgica alternativa para los pacientes. Los procedimientos quirúrgicos, como la gastrectomía y Antrectomía son la última opción para el tratamiento, siendo controvertido y con necesidad de más estudios [2]. En los pacientes con gastroparesia grave, pero normal de la motilidad intestinal, yeyunostomía de alimentación por sonda se puede aplicar. Si bien esto proporciona apoyo nutricional, no cura la gastroparesia [3]. gastroparesia diabética es generalmente el mejor tratamiento médico, y sólo los pacientes con gastroparesia diabética grave que no han respondido al tratamiento médico debe someterse a otras terapias. Por lo tanto, la búsqueda de fármacos que muestran eficacia en el tratamiento de la gastroparesia diabética es necesario.
Gastroparesia diabética se asocia con una pérdida de células intersticiales de Cajal (ICC) en seres humanos y animales modelo [4]. CCI pueden ser identificados en el tejido, mediante el etiquetado con antisueros para el kit de la tirosina quinasa del receptor, una proteína expresada en los CCI. Kit y su ligando factor de células madre (SCF) también son importantes factores de supervivencia para los CCI [5]. El aumento del estrés oxidativo asociado a la diabetes puede conducir a la pérdida o daño de los CCI en ratones, mientras que el estrés oxidativo conduce a los daños y la pérdida de las redes de la CPI y el desarrollo de retraso del vaciamiento gástrico [6]. La diabetes resulta en un aumento del estrés oxidativo y tiene un papel importante en la patogénesis de las complicaciones diabéticas [7]. La sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) resultados en el daño oxidativo, incluyendo la peroxidación lipídica, la oxidación de proteínas, y daños en el ADN, que puede conducir a la muerte celular. Por otra parte, se sabe que las ERO para actuar como segundos mensajeros para activar factores de transcripción tales como el factor nuclear kappa B (NF-kB). ROS generado durante el estrés en el tejido gástrico puede desencadenar la activación de la cascada de señalización de NF-kappa B; De hecho, el vaciado gástrico en las ratas diabéticas se asocia con la activación de la inflamación mediada por NF-KB.
curcumina (1,7-bis- (4-hidroxi-3-metoxifenil) -1, 6-heptadieno-3,5- diona) es el principal componente activo de la cúrcuma aislado de la planta Curcuma longa L. la curcumina es una molécula multifuncional con efectos reguladores importantes en el cáncer [8], inflamación [9] y las enfermedades relacionadas con la diabetes tales como retinopatía diabética [10], diabético nefropatía [11], y la diabetes disfunción cognitiva [12]. La curcumina es un potente eliminador de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, tales como los radicales hidroxilo y los radicales de dióxido de nitrógeno [13]. Varios estudios han demostrado que la curcumina inhibe la activación de NF-kB vías de señalización proinflamatorias [14]. Mientras tanto, NF-kB factores de transcripción regulan una serie de procesos fisiológicos importantes, incluyendo la inflamación y la respuesta inmune, el crecimiento celular y la supervivencia, por lo que la inhibición de la señalización de NF-kappa B representa una estrategia viable para la terapia de la enfermedad [15]. Sin embargo, ha habido muy poca investigación sobre el potencial de la curcumina para tratar la gastroparesia diabética, o en su mecanismo farmacológico. Francia El objetivo de este estudio fue determinar si, en un modelo de rata Sprague Dawley (SD) de la diabetes tipo 1 mellitus, la dosis media [16] curcumina podría proteger a los CCI en ratas diabéticas con retraso del vaciamiento gástrico al reducir el estrés oxidativo y la inhibición de la activación de NF-kB, aumentando SCF /kit de expresión, y normalizando el retraso en el vaciamiento gástrico.
Materiales y métodos
ratas experimentales y la inducción de la diabetes
ratas SD macho (8 semanas de edad) fueron criados en el Centro de Animales experimentales, Zhejiang Universidad médica de china, (Hangzhou, china), donde una específica libre de patógenos (SPF) -Nivel de laboratorio ha sido autorizado por el gobierno de la provincia de Zhejiang. Todas las ratas se alojaron en condiciones de humedad controlada (50-60%). Ellos se mantuvieron bajo luz controlada (12 h ciclo día /noche) con acceso libre al agua y para roedores. Todos los experimentos con animales se realizaron en coherencia con la licencia de la Oficina de Ciencia y Tecnología de la provincia de Zhejiang (Hangzhou, China) y con la aprobación del comité de ética animal de la Universidad de Medicina de Zhejiang de China. Todos los experimentos se ajustaban a las directrices para la conducta ética en el cuidado y uso de animales. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el estrés de los animales.
ratas en ayunas durante 12 h fueron sometidos a una única inyección intraperitoneal de estreptozotocina (STZ), 50 mg /kg, recién disuelto en tampón citrato de sodio 100 mM a pH 4,5. ratas normales emparejados por edad recibieron sólo el tampón de citrato. El desarrollo de la diabetes fue confirmada por los niveles de glucosa en sangre en ayunas (FBG) usando un kit de reactivos (Roche, Shanghai, China). Las ratas con los niveles de FBG superiores a 11,1 mM (200 mg /dl) a las 72 h después de la inyección de STZ se consideraron ratas diabéticas. Una vez que las ratas se convirtieron en diabéticos, se midieron diariamente sus niveles de glucosa. Los experimentos se iniciaron 8 semanas después de la aparición de la diabetes para permitir el desarrollo de la gastroparesia.
Diseño experimental
Ocho semanas después de la aparición de la diabetes, los animales fueron divididos en cuatro grupos, es decir, el control de ratas macho normales (Grupo I), varón diabético ratas (grupo II), las ratas curcumina complementado diabéticos machos (Grupo III), y las ratas control masculino curcumina suplementado (Grupo IV). Las ratas de los grupos III y IV (n = 10 cada uno) fueron tratados diariamente con curcumina (150 mg /kg; i.g.) durante 6 semanas. La curcumina (pureza > 95%) a partir de Fusong County Natural Biotecnología Company Ltd. (Jilin, China), se suspendió en 0,5% de solución /v de sodio carboximetil-celulosa (CMC-Na) w. Las ratas de los grupos I y II (n = 10 cada uno) recibieron sólo el 0,5% de solución de CMC-Na. Después del tratamiento durante 6 semanas, los animales fueron sacrificados bajo anestesia con éter etílico, se recogió sangre por sangrado de la vena femoral y se separó el suero. Los estómagos se retiraron rápidamente, y muestras de tejido tomadas de animales se almacenaron a -80 ° C hasta su procesamiento para los ensayos bioquímicos. El vaciado gástrico, estrés oxidativo, la activación de NF-kB, CCI y la expresión de SCF /kit de estómagos fueron también estudiados al final de la sexta semana de tratamiento (14 ª semana de la diabetes).
Estudios de vaciamiento gástrico
se empleó el método estándar para la preparación de una comida fenol marcador rojo como se describe anteriormente [17]. El vaciado gástrico se determinó usando una modificación de un procedimiento previamente informado [18]. Las ratas se les permitió libre acceso al agua hasta 3 h antes de la administración de alimentación forzada de la curcumina. Una solución de 0,1% (w /v) de rojo de fenol en carboximetilcelulosa de sodio acuoso (1,5% w /v) se utilizó como una comida de prueba. La curcumina se le dio 1 h antes de la administración oral de la comida de prueba. Veinte minutos después de la administración de la comida de prueba, se sacrificaron las ratas. Los estómagos fueron entonces expuestos por laparotomía y se retira. Las ratas tratadas con el vehículo (solución salina, solución de cloruro sódico 0,9%, 0,2 ml) se sacrificaron inmediatamente después de la administración oral de la comida de prueba y el contenido de rojo de fenol en el estómago fue considerado como el estándar (100%). Los estómagos fueron retirados practicará una incisión en 40 ml de solución de NaOH (0,1 N) y el contenido se disolvieron. Se añadió una alícuota de 1 ml de las soluciones de lavado a 2 ml de ácido tricloroacético (7,5% w /v) para precipitar las proteínas. Después de la centrifugación (2500 x g
) durante 20 min, se añadió 1 ml del sobrenadante a 1 ml de NaOH (1 N) para desarrollar la máxima intensidad de color. La absorbancia a 558 nm de la solución a continuación, se midió utilizando un espectrofotómetro (U-1080; Hitachi Ltd., Tokyo, Japón). El vaciado gástrico se calcula según la siguiente fórmula: vaciamiento gástrico %
=
1 | -
X
/
Y
×
100
, España, donde X es la absorbancia de rojo fenol que permanece en el estómago 20 minutos después de la administración de rojo fenol e y es la absorbancia media de rojo fenol se recuperó de los estómagos de los ratones de control inmediatamente después de la administración de rojo de fenol.
Determinación de MDA y los niveles de SOD en el músculo liso de antro gástrico
se extirparon los estómagos, se pesaron y se congelaron inmediatamente a -70 ° C. El tejido congelado de cada rata se homogeneizó en tampón fosfato enfriado en hielo (KCl 140 mM, fosfato 20 mM, pH 7,4) y se centrifugó a 3.000 × g
para 10 min. El contenido de malonaldehído (MDA), un índice de la peroxidación de lípidos, se determinó utilizando el método del ácido tiobarbitúrico (TBA) con una ligera modificación [19]. Brevemente, 100 l de homogeneizado de tejido se mezclaron con 200 l de solución de trabajo que contiene 0,37% de TBA. La mezcla se incubó a 100 ° C durante 15 min y posteriormente se enfrió. Para extraer MDA, se añadieron 375 l de N-butanol, seguido de agitación vorticial vigorosamente durante 10 s. Después de la centrifugación, la capa de N-butanol superior se transfirió a un tubo de vidrio. La absorbancia de la fase de butanol se midió a 532 nm. contenido de MDA se expresa como proteína nmol /mg. Para la medición de la actividad de SOD, 20 l de homogeneizado de tejido se mezcló con 200 l de solución de reacción que contiene cloruro de nitroazul de tetrazolio (NBT, 750 M), y se incubaron durante 20 min a 37 ° C. Se midió la absorbancia a 560 nm. La actividad enzimática se expresa como unidades /g de proteína y 1 unidad de enzima se define como la cantidad de enzima requerida para inhibir la reducción de NBT en 50% de medición.
RT-PCR semicuantitativa de SCF y c-kit Francia El se recogió el estómago proximal (40-50 mg), y la mucosa se separó por disección. El tejido se homogeneizó mecánicamente en condiciones de RNasa libres y disocia con Tripure reactivo de aislamiento (Roche, Suiza) en hielo durante 5 minutos, y el ARN total se extrajo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total se cuantificó espectrofotométricamente a 260 y 280 nm, con la relación A260 /A280 que van desde 1,8 hasta 2,0. La integridad del ARN se verificó por electroforesis en gel de agarosa, seguido por tinción con bromuro de etidio, y el ARN se utilizó para la transcripción inversa inmediata o se almacenó a -80 ° C en agua libre de RNasa. reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa de dos pasos (RT-PCR) se realizó utilizando el kit de as-α- Revertra primera síntesis de ADNc (Tiangen Biotech, Pekín, China) y 2 x Taq PCR Master Mix (Tiangen Biotech), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una cantidad fija de ARN (0,5 g) se sometió a transcripción inversa. deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) fue seleccionado como un estándar interno. Todos los cebadores de PCR se diseñaron y sintetizaron por Biosune (Shanghai, China). El primer secuencias y longitudes de los productos de PCR son las siguientes: GAPDH, hacia adelante: 5 '- GACAACTITG-GCATCGTGGA-3 ', inversa: 5 '- ATGCAGGGATGATGT-TCTGG-3 ' , 150 pb; SCF, hacia adelante: 5 '- CTT GGA GGC GGT CAT ATC TG-3 ', inversa: 5 '- GCC CTT CTT GTA AGA GAC TG-3 ', 285 pb; y c-kit, hacia adelante: 5 '- GTG GTT AAA CAA GGA GCT CG-3 ', inversa: 5 '- CAT ACA TTT CAG CAG GTG CG-3 ', 400 pb. Las condiciones de reacción fueron optimizados para cada uno de los genes mediante la variación de la temperatura de recocido (58 ° C para GAPDH, 58 ° C para SCF, y 62 ° C para c-kit) y diferentes números de ciclos de PCR [20]. Los productos de PCR se separaron en geles de agarosa al 2% a 100 V durante 30 minutos. Gel imágenes se visualizan en el monitor de pantalla de cristal líquido de un sistema PhotoDoc-Ite transiluminación ultravioleta equipado con una cámara CCD (Bio-Rad Gel Doc 2000, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se conservan para el análisis de intensidad. Los niveles de ARNm relativas de los genes seleccionados se calcularon como la relación de la expresión de GAPDH.
Los niveles de SCF, c-Kit, I? B y NF-kB evaluados por Western blot
aproximadamente 50 mg de tejido fue tomado de la cerca del estómago proximal. Los tejidos se cortan en pequeños trozos de unos 0,25 cm 3, se homogeneiza y se disocia en la radio-inmunoprecipitación tampón de lisis de ensayo (Hushang Biotecnología, Shanghai, China), que contiene Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 1% NP-40, desoxicolato sódico al 0,5%, 1% de dodecilsulfato de sodio, 1 mM de PMSF, ortovanadato de sodio, fluoruro de sodio, ácido etilendiaminotetraacético, y leupeptina a 4 ° C durante 30 minutos. Los homogeneizados se centrifugaron a 12 000 x g
durante 5 minutos a 4 ° C, y se recogieron y se usaron como la proteína total de los sobrenadantes. Igual cantidad de proteína se sometieron a electroforesis por SDS-PAGE en 10% o 15% en geles de poliacrilamida. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hushang Biotecnología) mediante transferencia semiseca. Las membranas se bloquearon con solución salina tamponada con Tris 0,1% de Tween 20 (TBST) que contenía 5% de leche durante 60 minutos a temperatura ambiente, y luego inmuno-borrados con anticuerpos primarios diluidos apropiadamente a 4 ° C durante la noche. Después de lavar tres veces con TBST, las transferencias se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con HRP durante 60 minutos a temperatura ambiente. A continuación, los complejos se visualizaron utilizando un sistema de imagen iChemi XR (WD9431A, Bomeike Biotecnología, China) con reactivos de quimioluminiscencia (Tigsun Biológica Tecnología Ciencia, Tianjin, China). Semi-cuantificación se realizó usando Quantity One software, versión 4.6.2 (Bio-Rad). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-SCF, 1: 200, c-kit, 1: 200, anti-I? B y p65 anti-NF-kB y GAPDH., 1: 500 (Hushang Biotechnology, Shanghai, China)
La cuantificación de NF-B-ADN vinculante mediante el ensayo de cambio de movilidad electroforética
Los extractos nucleares se prepararon a partir de lisados ​​de estómago como se describe anteriormente [21]. la activación de NF-kB se determinó mediante un ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA), y la translocación nuclear de NF-kB se evaluó como se describió previamente (GS009, Instituto de Biotecnología Beyotime, Shanghai, China) [22]. Por NF-kB reacciones de unión, 5 g de extracto de proteína nuclear se incubó a temperatura ambiente durante 20 min con tampón de reacción que contiene HEPES 20 mM, pH 7,9, KCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, 5% de glicerol, 200 g /mL BSA, y 2 g de poli (dI-dC). Entonces, marcado con 32P oligonucleótido de doble cadena (1 ng ≥1 × 105 cpm) que contiene la secuencia consenso de unión a NF-kB (5 '- GGCAACCTGGGGACTCTCCCTTT-3 ') se añadió a la mezcla de reacción durante 10 min adicionales a temperatura ambiente. Los productos de reacción se fraccionaron en un gel de poliacrilamida al 6% no desnaturalizante durante 60 min a 350 V, que después se secó y se sometió a autorradiografía a -70 ° C durante la noche. Para ensayos de competición, el exceso de oligonucleótido (exceso molar de 100 veces) competidor fue pre-incubado con extractos nucleares de 20 min a temperatura ambiente. Un mutante oligonucleótido NF-kB (5 '- GGCAACTGCTCACTCTCCCTTT-3 ') se utilizó para el ensayo de competición. Las señales se analizaron densitométricamente.
Immunofluorohistochemistry Doble con desoxinucleotidil terminal de ensayo de transferasa mediada dUTP-biotina nick fin de etiquetado (TUNEL) y tinción de c-kit
fluorescencia inmunohistoquímica para c-kit (usando el anticuerpo de Santa Cruz) y TUNEL tinción se realizó en secciones de 10-micras utilizando una modificación del procedimiento publicado por el fabricante del kit TUNEL (TACS STDT, Trevigen Inc, Gaithersburg, MD). células TUNEL positivas fueron marcadas con fluoresceína (Ex 488, Em 505-550), las células c-kit-positivos fueron marcadas con Cy3 (Ex 543, Em 560 a 615), y los núcleos fueron marcadas con DAPI (Ex 364, Em 385 -470). Las muestras de tejido fueron incorporados en el medio de montaje de fluorescencia e investigados por microscopía confocal de barrido láser [23]. Aproximadamente 200 células fueron contadas por campo, cinco campos fueron examinados por diapositiva y cinco diapositivas fueron examinados por grupo. Los porcentajes de células apoptóticas TUNEL y c-kit positivo se denotan como el índice apoptótico (AI) (%). El análisis estadístico

Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar. Para comparar los datos entre los grupos de animales, el análisis de una vía de la varianza (ANOVA de una vía) y comparaciones Duncan fueron empleados. Todas las pruebas estadísticas se realizaron con SPSS para Windows, versión 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a P Hotel < 0.05.
Resultados
Efecto de la curcumina sobre el peso corporal y la glucosa en sangre de ratas diabéticas
niveles de glucosa en plasma fueron altamente elevada en ratas diabéticas (grupo II) [(322 ± 41) mg /dl] en comparación con aquellos en ratas normales de control (Grupo I) [(98 ± 12) mg /dl]. Hubo una marcada disminución en el peso corporal de las ratas del grupo II [(298 ± 16) g] en comparación con emparejados por edad ratas del grupo I [(449 ± 21) g]. ratas diabéticas curcumina tratados crónicas (Grupo III) no mostraron mejoras significativas en el peso corporal y no disminución de los niveles de glucosa en plasma en comparación con las ratas del Grupo II [Grupo III, el peso corporal (324 ± 19) g y glucosa (302 ± 38) mg /dl] (Tabla 1) .table nivel de glucosa en sangre 1 y el peso corporal en cuatro grupos Barcelona grupos
Grupo I Grupo II

Grupo III

Grupo IV
de glucosa en sangre (mg /dl)
98 ± 12 322 ± 41
*
302 ± 38 * #
100 ± 11
El peso corporal ( g)
449 ± 21 298 ± 16
*
324 ± 19 * 476 ± 27

Grupo I = ratas normales de control; Grupo II = ratas control diabéticas; Grupo III = + diabético tratado curcumina ratas (150 mg /kg); Grupo IV = + tratados con curcumina ratas normales (150 mg /kg). Los resultados se presentan como media ± desviación estándar. * P Hotel < 0,05 (en comparación con el grupo I), #P Hotel > 0,05 (en comparación con el Grupo II)
Efecto de la curcumina en el vaciado gástrico
vaciado gástrico se retrasó significativamente en las ratas SD que habían tenido diabetes durante 8 semanas. . La cantidad de vaciado gástrico en el Grupo II era 44,3 ± 5,7%, lo que fue significativamente menor que en el grupo I [(76,2 ± 4,3)%, P
< 0,01], y diabéticos ratas en tratamiento curcumina [(Grupo III) ,; (59,4 ± 7,5)%, P Hotel < 0,05]. Sin embargo, no se observó diferencia significativa entre el grupo IV ratas [(73.3 ± 5.2%) Grupo I y, P
> 0,05] (Figura 1). Figura 1 Efectos de la curcumina en el vaciado gástrico en ratas diabéticas. Grupo I = ratas de control normales (n = 10); : Grupo II ratas de control = diabéticos (n = 10); : Grupo III = diabético + curcumina ratas tratadas (n = 10); : Grupo IV = + normal tratado curcumina ratas (n = 10). Todos los valores se expresan como la media ± desviación estándar. * P Hotel < 0,01 (en comparación con el grupo I), # p Hotel < 0,05 (en comparación con el Grupo II), Ap Hotel > disminución de 0,05 (en comparación con el grupo I)
tratamiento de curcumina. la formación de MDA, aumenta la actividad de SOD
investigamos el estrés oxidativo utilizando varios métodos, porque el estrés oxidativo inducida por la glucosa se ha postulado que es un mecanismo clave en las complicaciones diabéticas crónicas. Las ratas diabéticas exhiben una mayor niveles de MDA [Grupo I 15,7 ± 1,7 (nmol /mg) vs
II 27,9 ± 2,1 (nmol /mg) Grupo, P = 0,006
] y la disminución de los niveles de SOD [Grupo I 146,2 ± 9,3 ( u /mg) vs
Grupo II 107,9 ± 7,5 (u /mg), P = 0,008
], un marcador molecular del estrés oxidativo (Figura 2). Seis semanas de tratamiento curcumina redujo el grado de MDA upregulation [Grupo III, 21,4 ± 1,8 (nmol /mg), P = 0,033
frente a grupo I y P
= 0,004 frente a grupo II], y la mejora de la SOD abajo -Reglamento [Grupo III 126,2 ± 8,8 (unidades /mg), P = 0,036
frente a grupo I y P = 0,001 frente
Grupo II]. La curcumina mejora de forma significativa la actividad SOD y reduce los niveles de MDA en homogeneizado de estómago. Además, no se observaron diferencias significativas entre los animales del Grupo IV Grupo I y P (Restaurant > 0,05; Figura 2). Figura 2 Efectos de la curcumina en MDA y SOD en ratas diabéticas. Los niveles de MDA se redujo después tratado con la curcumina, los niveles de SOD se incrementó después de tratados con curcumina. : Grupo I = ratas de control normales (n = 10); : Grupo II = ratas de control diabéticos (n = 10); Grupo III = + diabético tratado curcumina ratas (n = 10); : Grupo IV = + normal tratado curcumina ratas (n = 10). Todos los valores se expresan como la media ± SD * p
. ≪ 0,01 (en comparación con el grupo I), # p
< 0,01 (en comparación con el Grupo II), Ap
> 0,05 (en comparación con grupo I).
la curcumina aumenta SCF y los niveles de proteína c-kit
imágenes representativas de la RT-PCR análisis de SCF en los tejidos del estómago de ratas en cada grupo se muestran en Figure3A. En comparación con el Grupo I, el SCF fue significativamente menor en el grupo II [(0,44 ± 0,02) vs
(0,69 ± 0,03), P = 0
0,002], y una comparación de los valores en el Grupo III revelaron que el nivel de SCF en ratas tratadas con la curcumina fue mayor que en el Grupo II [(0,58 ± 0,04) vs
(0,44 ± 0,03) P = 0
0.003]. Sin embargo, no se observaron diferencias entre los grupos I y IV [(0,69 ± 0,03) vs gratis (0,66 ± 0,03) P = 0,56
] (Figure3B). Análisis de transferencia Western (Figure4A, B) reveló que el nivel de SCF en los tejidos del estómago de las ratas del grupo II fue significativamente menor que los de las ratas del Grupo I y III [proporciones de (0,33 ± 0,02) vs
(0,47 ± 0,03) y (0,41 ± 0,02), respectivamente, P
< 0 0,05)]. Sin embargo, no se encontró diferencia significativa entre el grupo IV y las ratas del grupo I [(0,45 ± 0,03) vs
(0,47 ± 0,03), P Hotel > 0,05)], lo que sugiere que la intervención de la curcumina podría restaurar eficazmente los niveles de proteína SCF locales en los tejidos del estómago de ratas diabéticas. Figura 3 Los cambios en SCF /GAPDH y C-kit /GAPDH mediante análisis de RT-PCR. (A) Imágenes representativas de la electroforesis en gel de GAPDH, SCF, y c-kit en ratas de cada grupo. niveles (B) Grupo de la expresión del ARNm relativa de SCF y c-kit, con productos cuantificados por relación a GAPDH. : Grupo I = ratas de control normales (n = 10); : Grupo II ratas de control = diabéticos (n = 10); : Grupo III = diabético + curcumina ratas tratadas (n = 10); : Grupo IV = + normal tratado curcumina ratas (n = 10). Todos los valores se expresan como la media ± desviación estándar. * P
< 0,01 (comparado con el grupo I.), # p
< 0,05 (en comparación con el Grupo II), Ap
>. 0,05 (en comparación con el grupo I): perfil Figura 4 Los cambios en el SCF /GAPDH y C-kit /GAPDH mediante análisis de transferencia Western. (A) Imágenes banda de proteína Representante de SCF, c-kit, y glyceraldehydes-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). niveles (B) grupo de SCF relativa y la proteína c-kit expresado por relación a GAPDH, respectivamente. : Grupo I = ratas de control normales (n = 10); : Grupo II ratas de control = diabéticos (n = 10); : Grupo III = diabético + curcumina ratas tratadas (n = 10); : Grupo IV = + normal tratado curcumina ratas (n = 10). Todos los valores se expresan como la media ± desviación estándar. * P
< 0,01 (en comparación con el grupo I), # p
< 0,01 (en comparación con el Grupo II), Ap
>. 0,05 (en comparación con el grupo I): perfil del RT-PCR análisis mostró que los niveles de expresión de c-kit en los tejidos del estómago fueron 0,78 ± 0,04, 0,37 ± 0,02 y 0,59 ± 0,03 para los grupos I, II y III, respectivamente. Los niveles de expresión de c-kit en los Grupos II y III ratas fueron menores que en las ratas del Grupo I. Sin embargo, una comparación de los grupos II y III reveló que el nivel de c-kit en ratas tratadas con la curcumina fue mayor que en las ratas diabéticas no tratadas (P
< 0,05, Figure3B). resultados similares han sido obtenidos por Western blot (Figure4B). Los niveles de proteína c-kit (relación de 0,45 ± 0,03, 0,21 ± 0,02 y 0,34 ± 0,02, respectivamente, para los grupos I, II y III) fueron mucho mayores en el Grupo III que en el Grupo II (P
< 0 .05, Figure4B), y el nivel en el grupo III fue menor que los de los Grupos I y IV. Ambos análisis indicaron que las 6 semanas de la intervención curcumina podría restaurar de manera significativa la disminución en los niveles de c-kit en ratas diabéticas.
Curcumina inhibe la degradación de I-kappa B y la activación de NF-kB
Los informes indican que el aumento de estrés oxidativo y crónica puede activar o perturbar la actividad de NF-kB [24]. Investigamos si la curcumina podría resultar en la activación de la vía de señalización de NF-kB. Para ello, hemos medido los niveles de NF-kB en la presencia o ausencia de la curcumina para identificar si NF-kB se activó. En primer lugar, se evaluaron los niveles de proteína de la I-kappa B, a la que inactivado NF-kB se une. Se encontró que el nivel de la I-kappa B en las ratas del Grupo I fue mayor que en las ratas del Grupo II, mientras que el nivel en las ratas del Grupo III fue menor que en las ratas del grupo II (p < 0,01), pero mayor que los niveles en Grupos I y ratas IV (p < 0,05). A continuación, se examinó si la curcumina podría bloquear el NF-kB. Se encontró que la diabetes (Grupo II) llevó a un aumento en los niveles de NF-kB [Grupo I 75,5 ± 7,7 (pg /ml) vs
II 102,8 ± 12,4 (pg /ml) Group, P = 0,001
] , mientras que el tratamiento con curcumina [Grupo III 91,3 ± 8,9 (pg /ml)] impedido este efecto. Sobre la base de este hallazgo, hemos sugerido que la curcumina inhibe la activación de NF-kB [Grupo IV 70,9 ± 8,1 (pg /ml), P = 0,026
] (Figura5). Se examinó si la curcumina podría bloquear NF-kappa B translocación en el núcleo, debido a la translocación nuclear se reconoce como una reacción a la estimulación de células ROS y parece que se correlaciona con la activación transcripcional mediada por NF-kB. Para evaluar esto, se midió el nivel de NF-kappa B en el núcleo de la EMSA. Desarrollo de la diabetes inducida por un aumento en los niveles de NF-kB en el núcleo, mientras que el tratamiento con curcumina impedido este efecto (Figure6). Por lo tanto, hemos sugerido que la curcumina suprime no sólo indirectamente la activación de la unión de NF-kappa B-DNA, sino que también suprime la activación aguas arriba de la I-kappa B. Figura 5 Efecto de la curcumina en la I-kappa B y NF-kB. (A) el gráfico de barras estaba claro reflejo del nivel de la I-kappa B y NF-kB entre los cuatro grupos. (B) el nivel de la I-kappa B /GAPDH se redujo en el grupo II, pero aumentó por la curcumina. I: Grupo I = ratas de control normales (n = 10); II: Grupo II = ratas de control diabéticos (n = 10); III: Grupo III = diabético + curcumina ratas tratadas (n = 10); IV: Grupo IV = + normal tratado curcumina ratas (n = 10). Todos los valores se expresan como la media ± SD * p
. ≪ 0,01 (en comparación con el grupo I), # p
< 0,01 (en comparación con el Grupo II), Ap
> 0,05 (en comparación con Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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