MicroRNA-144 hämmar metastasering av magcancer genom att rikta MET uttryck

MicroRNA-144 hämmar metastasering av magcancer genom att rikta MET uttryck Bild Sammanfattning
Magcancer (GC) är fortfarande en av de vanligaste typerna av elakartad cancer, och den molekylära mekanismen bakom dess metastaser är fortfarande till stor del oklar. MicroRNAs har visat sig vara viktiga regulatorer av metastaser på grund av deras förmåga att agera på flera signalvägar. I vår studie fann vi att MIR-144 är betydligt nedregleras i både starkt metastatiska GC cellinjer och vävnader. Resultat från både vinst-of-funktion och förlust av funktions experiment visar att ökad MIR-144 uttryck signifikant reducerad migration GC cell, minskade medan MIR-144 uttryck dramatiskt förbättrad migration GC cell. Den met-proto-onkogenen (MET), som ofta amplifieras i humana cancrar och funktioner som en viktig regulator av celltillväxt och tumörinvasion, identifierades som ett direkt mål för MIR-144. Dessutom tysta MET använder små störande RNA (siRNA) intagits anti-metastaserande funktion av MIR-144, medan återställa status uttryck dämpas funktion miR-144 i GC-celler. Dessutom fann vi att MIR-144, genom att rikta MET, undertrycker fosforylering av Akt. Slutligen konstaterade vi en omvänd korrelation mellan uttrycket av MIR-144 och MET-mRNA i GC metastatiska vävnader. Sammanfattningsvis miR-144 undertrycker GC progression genom att direkt nedreglera MET uttryck, som sedan förhindrar aktivering av pro-onkogena Akt signalvägen. Återinförande av MIR-144 uttryck i GC-celler presenterar en attraktiv terapeutisk metod att blockera metastasering av magcancer.
Nyckelord
microRNA miR-144 MET Gastric cancer Metastaser Inledning
Globalt är en magcancer (GC) av de vanligaste typerna av malign sjukdom. Under 2008 har cirka 989.600 nya fall av GC diagnosen. Vidare GC inblandad som en orsak till 738,000 dödsfall, vilket gör GC den fjärde vanligaste malignitet och den vanligaste orsaken till cancerdöd worldwide [1]. Som tumören fortskrider, utvecklar förmågan att invadera omgivande vävnader och metastasera. Den hepatocyt tillväxtfaktorreceptor, Met, är känd för att främja den motilitet och invasiv förmåga hos tumörceller [2]. MET är en medlem av receptortyrosinkinas familj och har visat sig vara uppreglerad i många tumörer [3-5]. Det föreslås att MET expressionsnivån ökas antingen genom genamplifiering eller hypoxi via HIF1α. Hos patienter med metastaserande GC, MET förstärkning och stark proteinuttryck är inte ovanligt. Dessa händelser verkar vara signifikant associerade med ogynnsamma kliniska resultat [6]. Ungefär 10% av vita patienter hyser en vinst på fem eller fler kopior av MET. Dessutom är denna vinst i MET kopieantal signifikant associerade med ogynnsam prognos [7]. Dessutom har Mir-34a /c mikroRNA visat sig negativt modulera MET uttryck i cellinjer härledda från prostatacancer, hepatocellulär cancer och GC [8-10].
MicroRNAs (miRNA) är icke-kodande RNA-molekyler, cirka 21-23 nukleotider i längd, som reglerar genuttryck på transkriptions eller post-transkriptionell nivå [11-13]. miRNA expression profiling analyser har avslöjat en global nedreglering av mogna miRNA nivåer i humana tumörer i förhållande till normala vävnader [14]. Vidare kan miRNA fungera i antingen en tumörsuppressor eller onkogena roll, beroende på funktionen av deras mål. Till exempel, MIR-133b var signifikant nedreglerade i GC vävnader och utövade sin tumör suppressor roll i GC-celler [15]. Expression av MIR-337-3p signifikant nedregleras i lymfkörtelmetastatiska vävnader GC patienter och induktion av MIR-337-3p uttryck gjorde minska magcancer cellinvasion kapacitet [16]. MIR-25 främjar GC progression genom att direkt nedreglera TOB1 uttryck; Därför, ökat uttryck av MIR-25 utgör en potentiell icke-invasiv biomarkör för prognosen för GC patienter [17]. Dessutom är MIR-7 betydligt nedregleras i både starkt metastatiska GC cellinjer och metastaserande vävnader. Överuttryck av MIR-7 hämmar markant GC metastaser genom att rikta uttrycket av insulinliknande tillväxtfaktor-1 receptor (IGF1R) onkogen [18]. I GC cellinjer, återinförande av MIR-144 uttryck resulterar i förtryck av ZFX, som måttligt ökar cancercellkulturens mottaglighet för 5-fluorouracil kemoterapi. I 93 fall av primär GC, minskade miR-144 uttryck i samband med dålig prognos [19]. Dessa exempel har markerat den nyckelroll som miRNA i GC malignance och cancer progression.
I denna studie, som kännetecknas vi målen och definierat verkningsmekanism Mir-144 i GC. Genom att inducera ektopisk expression av MIR-144, upptäckte vi MET är en ny mål av MIR-144 reglering. Denna slutsats bekräftades både mRNA och proteinnivåer, och reportergenen luciferas analyser verifierade direkt bindning av MIR-144 till det föreskrivande bindningsställe i 3'UTR MET. Dessutom fann vi att MET uttryck korrelerar omvänt till MIR-144 nivåer i en liten men väl dokumenterad GC kohort. Vår hypotes är att MIR-144 hämmar GC metastaser, och att en del av denna hämning medieras genom att rikta MET uttryck.
Material och metoder
mänskliga vävnadsprover och cellinjer
GC prover samlades in från patienter som genomgick operation vid Fudan University i Shanghai Cancer Center mellan 2012 och 2013. protokollet godkändes av den kliniska forskningsetiska kommittén för Fudan University, och forskning genomfördes i enlighet med bestämmelserna i Helsingforsdeklarationen från 1975. Alla prover erhölls med informerat samtycke av patienterna. Den humana GC-cellinjen AGS (ATCC CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC CRL- 5974 ™) , var NCI-N87 (ATCC CRL-5822 ™), och KATO III (ATCC HTB-103 ™), som hölls i DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum. Alla cellinjer bibehölls i media innehållande penicillin (100 lU /ml) och streptomycin (100 mg /ml) vid 37 ° C med 5% CO2. Mirna härmar och inhibitorer köptes från Ambion (Austin, TX, USA).
RNA-extraktion och realtids-PCR
Totalt RNA extraherades från celler med hjälp av TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). För miRNA-analys, var poly (A) svansar läggas till den totala RNA med användning av poly (A) polymeras (Ambion, Carlsbad, CA) före omvänd transkription. Den MiRcute miRNA qPCR detektionskit (TIANGEN, Beijing, Kina) användes för att kvantifiera uttrycket nivåer av MIR-144 enligt den medföljande protokollet. Följande PCR-betingelser användes: 95 ° C under 30 s, följt av 40 cykler av 95 ° C under 5 s och 60 ° C under 31 s. Mängden mål (MET /MIR-144), normaliserad till den endogena housekeepinggen GAPDH /U6snRNA och i förhållande till ett prov referens, ges av följande ekvation: mängd target = 2- △△ CT
microarray-hybridisering.
i korthet, RNA-prover som används för att syntetisera dubbelsträngat komplementärt DNA (cDNA), och dubbelsträngad cDNA märktes och hybridiserades till Microarray (Arraystar, Rockville, MD). Efter hybridisering och tvättning, bearbetades objektglasen skannas med Axon GenePix 4000B microarray scanner (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). P-värde beräknades med parat t-test. Tröskelvärdet för upp- och nedregleras gener var fold change > 2,0 och ett p-värde < 0,05. Hierarkisk klustring utförts baserat på differentiellt uttryckta gener och miRNA använder Cluster Treeview mjukvara från Stanford University (Palo Alto, CA).
MiRNA-genen nätverk
Vi konstruerade nätverket närbelägenhet mellan två gener, i och j, som definieras som en effekt av Pearson korrelation mellan motsvarande gen-uttrycksprofiler, xi och xj. Den grannmatris, M (i, j), visualiserades som en graf, och de topologiska egenskaperna hos denna graf undersöktes. För att göra en visuell representation, endast de starkaste sambanden (> 0,98) drogs i dessa renderingar. I miRNA-gennätverk motsvarar varje gen till en nod. Två gener är förbundna med en kant, vilket tyder på en stark korrelation. Inom analys nätverket är en grad enklaste, mest viktigt mått på det centrala i en gen i ett nätverk och bestämmer den relativa betydelse. En grad definieras som antalet direkt kopplade grannar
Prediction of Mir-144 bindningsställe
Förmodade miR-144 bindningsställen i MET mRNA 3 'otranslaterade regionen förutsågs av Target Scan (http: //. www.targetscan.org). Position 1430-1436 MET 3 'UTR har en bevarad bindningsställe för MIR-144 inriktning.
Plasmidtransfektion
ORF sekvenser av status förstärktes från genomiskt DNA isolerat från SNU-5 cellinje och subklonades därefter in i Plenti vektorn. Plasmiden transfekterades in SNU-5-celler med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Efter 24 timmar tillsattes cellerna används för en räddningsexperiment.
Oligonukleotid transfektion
MiR-144 härmar, miR-144-inhibitor (anti-MIR-144), och MET siRNA (siRNA-MET) syntetiserades genom Genepharma , Shanghai, Kina. Oligonukleotid transfektion utfördes med Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Den slutliga koncentrationen av MIR-144 härmar, anti-MIR-144 eller siRNA-MET i transfektion systemet var 100 nM. Transfektion effektivitet för de enskilda och co-transfekterade studier bestämdes genom fluorescensmikroskop.
Immunoblotting
Likvärdiga mängder cellysat löstes med 7% SDS /PAGE och överfördes till polyvinylidenfluorid-membran. Membranet inkuberades med en kanin polyklonal anti-MET-antikropp (1: 500, Abcam, ab47431), en get polyklonal anti-ADAM12 antikropp (0,3

• Association of närvaro /frånvaro och on /off mönster av Helicobacter pylori oipA genen med magsår och mag cancerrisker: a meta-analysis
• Förhållandet mellan tarmhormoner och glukoshomeostas efter bariatric surgery