MikroRNA-144 hemmer metastasering av magekreft ved å målrette MET expression

mikroRNA-144 hemmer metastasering av magekreft ved å målrette MET uttrykk
Abstract
Magekreft (GC) er fortsatt en av de mest vanlige typer ondartet kreft, og den molekylære mekanismen bak sin metastaser er fortsatt i stor grad uklart. MicroRNAs har dukket opp som viktige regulatorer av metastasering på grunn av deres evne til å handle på flere signalveier. I vår studie fant vi at MIR-144 er betydelig nedregulert i begge svært metastatisk GC cellelinjer og vev. Resultater fra både gain-of-funksjon og tap-av-funksjon eksperimenter viser at økt Mir-144 uttrykk betydelig redusert GC celle migrasjon, mens redusert Mir-144 uttrykk dramatisk forbedret GC celle migrasjon. Den møtte proto-onkogen (MET), som ofte forsterkes i kreft hos mennesker og fungerer som en viktig regulator av cellevekst og tumorinvasjon, ble identifisert som et direkte mål for MIR-144. Videre stanse av MET ved hjelp av små interfererende RNA (siRNA) rekapitulert anti-metastatisk funksjon av MIR-144, mens gjenopprette MET uttrykk svekket funksjon av MIR-144 i GC-celler. Videre fant vi at MIR-144, ved å målrette MET, undertrykker fosforylering av Akt. Til slutt, observerte vi en invers korrelasjon mellom ekspresjonen av MIR-144 og MET mRNA i GC-metastatiske vev. I sammendrag, undertrykker MIR-144 GC progresjon av direkte downregulating MET uttrykk, som senere hindrer aktivering av pro-onkogen Akt pathway. Gjeninnføring av MIR-144 uttrykk i GC-celler er en attraktiv terapeutisk tilnærming for å blokkere metastasering av magekreft.
Nøkkelord
mikroRNA MIR-144 MET Magekreft metastaser Innledning
Globalt magekreft (GC) er en av de mest utbredte typer ondartet sykdom. I 2008 ble ca 989 600 nye tilfeller av GC diagnostisert. Videre GC ble innblandet som en årsak til 738,000 dødsfall, noe som gjør GC den fjerde vanligste kreftformen og den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Som svulsten skrider frem, utvikles det evnen til å invadere omgivende vev og metastasere. Den hepatocytt-vekstfaktor-reseptor, MET, er kjent for å fremme motilitet og invasive evnen til tumorceller [2]. MET er et medlem av reseptor-tyrosin-kinase-familien, og har vist seg å være oppregulert i mange tumorer [3-5]. Det foreslås at MET uttrykk nivået økes enten ved genamplifisering eller hypoksi via HIF1α. Hos pasienter med metastatisk GC, MET forsterkning og sterk protein uttrykk er ikke sjeldne. Disse hendelsene synes å være signifikant assosiert med ugunstige kliniske utfall [6]. Omtrent 10% av hvite pasienter havn en gevinst på fem eller flere eksemplarer av MET. I tillegg er denne gevinsten i MET kopiantallet signifikant assosiert med ugunstig prognose [7]. Videre er MIR-34a /c microRNAs vist seg å ha negativ modulere MET uttrykk i cellelinjer avledet fra prostata kreft, leverkreft og GC [8-10].
MicroRNAs (mirnas) er ikke-kodende RNA-molekyler, ca. 21-23 nukleotider i lengde, som regulerer genekspresjon ved transkripsjonelle eller post-transkripsjonelle nivå [11-13]. miRNA uttrykket profilering analyser har avdekket en global nedregulering av modne miRNA nivåer i humane svulster i forhold til normalt vev [14]. Videre kan mirnas fungere enten i en tumor suppressor eller onkogene rolle, avhengig av funksjonen av deres mål. For eksempel, MIR-133b ble betydelig nedregulert i GC vev og utøvde sin tumor suppressor rolle i GC-celler [15]. Uttrykk av MIR-337-3p var signifikant nedregulert i lymfeknutemetastatisk vev av GC pasienter, og induksjon av MIR-337-3p uttrykk gjorde redusere magekreft celle invasjon kapasitet [16]. MIR-25 fremmer GC progresjon ved direkte downregulating TOB1 uttrykk; derfor økt uttrykk av MIR-25 presenterer en potensiell invasiv biomarkør for prognosen for GC pasienter [17]. I tillegg er MIR-7 signifikant nedregulert i begge svært metastatisk GC cellelinjer og metastatisk vev. Overekspresjon av MIR-7 markert hemmer GC metastase ved å målrette uttrykket av insulin-like growth factor-1 reseptoren (IGF1R) onkogen [18]. I GC cellelinjer, gjeninnføring av MIR-144 uttrykk resulterer i undertrykkelse av ZFX, som moderat øker kreftcelle mottakelighet for 5-fluorouracil kjemoterapi. I 93 tilfeller av primær GC, redusert Mir-144 uttrykk var assosiert med dårlig prognose [19]. Disse eksemplene har fremhevet den viktige rollen av miRNAs i GC malignance og kreft progresjon.
I denne studien karakteriseres vi målene og definert virkningsmekanismen av MIR-144 i GC. Ved å fremkalle ektopisk uttrykk for MIR-144, oppdaget vi MET er en roman mål av MIR-144 regulering. Dette funnet ble bekreftet på både mRNA og proteinnivåer, og reporter gen luciferase analysene bekreftet direkte binding av MIR-144 til regulatoriske bindingssetet i 3'UTR av MET. Videre fant vi at MET uttrykk omvendt korrelerer til Mir-144 nivåer i et lite, men godt dokumentert GC kohort. Vi hypotese at MIR-144 hemmer GC metastaser, og at noe av dette hemming formidles ved å målrette MET uttrykk.
Materiale og metode
menneske vevsprøver og cellelinjer
GC prøver ble samlet inn fra pasienter som gjennomgikk kirurgi ved Fudan University i Shanghai Cancer Center mellom 2012 og 2013. protokollen ble godkjent av klinisk forskningsetiske komité for Fudan University, og forskningen ble utført i henhold til bestemmelsene i Helsinki-deklarasjonen av 1975. Alle prøver ble oppnådd med informert samtykke av pasientene. Den menneskelige GC cellelinje AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-en (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL- 5974 ™) , NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), og KATO III (ATCC® HTB-103 ™) ble opprettholdt i DMEM inneholdende 10% føtalt bovint serum. Alle cellelinjer ble opprettholdt i media inneholdende penicillin (100 IU /ml) og streptomycin (100 mg /ml) ved 37 ° C med 5% CO2. Mirna ligner og hemmere ble kjøpt fra Ambion (Austin, Texas, USA).
RNA ekstraksjon og real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra celler ved hjelp TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California). For miRNA analyse, ble poly (A) haler tilsatt til totalt RNA ved bruk av poly (A) polymerase (Ambion, Carlsbad, CA) før revers transkripsjon. Den MiRcute miRNA qPCR deteksjon kit (TIANGEN, Beijing, Kina) ble brukt til å kvantifisere uttrykk nivåer av MIR-144 i henhold til gitt protokollen. De følgende PCR-betingelsene ble anvendt: 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 31 s. Mengden av målet (MET /MIR-144), normalisert til den endogene husholdningsgenet GAPDH /U6snRNA og i forhold til en referanseprøve, er gitt ved den følgende ligning: mengden av target = 2- △△ CT
Microarray hybridisering.
korthet RNA-prøver ble brukt til å syntetisere dobbeltkjedet komplementært DNA (cDNA), og dobbelt-trådet cDNA ble merket og hybridisert til Microarray (Arraystar, Rockville, MD). Etter hybridisering og vasking ble behandlet lysbilder skannet med Axon GenePix 4000B microarray scanner (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). P-verdien ble beregnet ved hjelp av paret t-test. Terskelen satt for opp- og ned-regulert gener var en fold endring > 2,0 og en p-verdi < 0,05. Hierarkisk clustering ble utført basert på forskjellig uttrykt gener og mirnas bruker Cluster Utforsker programvare fra Stanford University (Palo Alto, California).
MiRNA-genet nettverk
Vi konstruerte nettverket tilstøter mellom to gener, i og j, definert som en strøm av Pearson korrelasjon mellom tilsvarende genet-uttrykk profiler, xi og xj. Naboskapsmatrisen, M (i, j), ble visualisert som et diagram, og de topologiske egenskaper av denne grafen ble undersøkt. For å gjøre en visuell representasjon, bare de sterkeste korrelasjonene (> 0,98) ble trukket i disse gjengivelser. I miRNA-genet nettverk tilsvarer hvert gen til en node. To gener er forbundet med en kant, som indikerer en sterk korrelasjon. Innenfor nettverksanalyse, er en viss grad den enkleste og mest viktig mål for sentralitet av et gen i et nettverk og bestemmer den relative viktighet. En grad er definert som antall direkte knyttet naboer
Prediksjon av MIR-144 bindingssetet
Antatte MIR-144 bindingsseter i MET mRNA 3 'ikke-translatert område ble spådd av Target Scan program (http:. //www.targetscan.org). Plassering 1430-1436 av MET 3 'UTR har konservert bindingssete for MIR-144 målgruppe Plasmid transfeksjon.
ORF sekvenser av MET ble forsterket fra genomisk DNA isolert fra SNU-fem cellelinje og ble deretter subklonet inn i plenti vektor. Plasmidet ble transfektert inn i SNU-5-celler ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Etter 24 timer ble cellene brukt for en redning eksperiment
. Oligonukleotid transfeksjon
MiR-144 etterligner, MIR-144 inhibitor (anti-MIR-144), og MET siRNA (siRNA-MET) ble syntetisert ved Genepharma Shanghai, Kina. Oligonukleotid transfeksjon ble utført med Lipofectamine 2000 reagenser (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Den endelige konsentrasjonen av Mir-144 etterligner, anti-MIR-144 eller siRNA-MET i transfeksjon systemet var 100 nM. Transfeksjon effektivitet for single og co-transfektert studier ble bestemt ved fluorescens mikroskop.
Immunoblotting
Ekvivalente mengder cellelysater ble vedtatt med 7% SDS /PAGE og ble overført til polyvinylidenfluorid membraner. Membranen ble inkubert med et kanin polyklonalt anti-MET-antistoff (1: 500, Abcam, ab47431), en geit polyklonalt anti-ADAM12 antistoff (0,3 ug /ml, Abcam, ab28747), og et kanin polyklonalt anti-Versican antistoff (1 ug /ml, Abcam, ab19345). IRdye merkede sekundære antistoffer ble brukt for kvantifisering av immunblot signal, og signalene ble analysert ved hjelp av en Odyssey scanner (LI-COR biovitenskap, Lincoln, NE, USA).
RNA-chip-analysen
RNA-protein interaksjoner er festet med formaldehyd, og kromatin skjær er kombinert med DNase-behandling for å gi RNA /proteinkomplekser som kan immunoutfelt med antistoff mot MET proteiner. Kryssbindinger senere blir reversert; RNA gjenvinnes og igjen behandlet med DNase for å sikre fravær av DNA. RNA ble utfelt fra immunkomplekset deretter bli analysert ved hjelp av sanntids-PCR. I denne RNA-chip assay følgende formel anvendes:% av inndata (recovery) = AE (Ct-Ct inngangsprøve) * Fd * 100%. Her, er AE forsterkning effektivitet (10 (-1 /helling)) og Fd er en fortynningsfaktor av inngangs RNA for å balansere forskjell i mengden av RNA-Chip prøven og inngangs RNA som brukes for real-time PCR.
Luciferase-analyse
fulle MET 3'UTR ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av SNU-5 cDNA som templat og klonet inn i pGL3 kontroll vektor. Vi brukte Quick Change mutagenese å mutere Mir-144 antatte bindingsstedet (Stratagene, Santa Clara, CA, USA). SNU-5 celler og AGS celler ble transfektert med Mir-144 etterligner /hemmere og pGL3 luciferase reporter konstruerer husing MET 3'UTR. Etter 24 timer, ble virksomheten til ildflue luciferase og Renilla luciferase i cellelysatene målt med Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA).
Migrasjon analyser
For de transwell migrasjon analyser, en × 105 celler ble sådd ut i den øvre kammer som inneholder et ikke-belagte membran. Cellene ble sådd ut i serumfritt medium, og medium supplert med 10% (v /v) serum ble anvendt som en kjemoattraktant i det nedre kammer. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i en vevskultur-inkubator med 5% (volum /volum) CO2. Etter 16 timer ble de ikke-migrerte celler fjernet fra de øvre sidene av transwell membranfilterinnsatser. De migrerte celler på den nedre side av innsatsene ble farget med Coomassie brilliant blue, og cellene ble tellet.
Celleproliferasjonsanalyse
De transfekterte celler ble sådd i 96-brønns plater ved en tetthet på 1 x 104 celler /godt. En celleproliferasjon Analysen ble utført ved hjelp av Cell Telle Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Før tilsetningen av CCK-8, ble cellene vasket med varmt kulturmedium ved å spinne platen ved 500 rpm i 3 minutter og deretter kaste supernatanten
Primere
De følgende primere ble anvendt for sanntids-PCR.: MIR-144: 5-TACAG TATAG ATGAT GTACT-3; U6snRNA: 5-CGCAA GGAUG ACACG CAAAU UCGUG AAGCG UUCCA UAUUU UU-3; SKIL frem primer: 5-GTTAA GCGAA CCTGT ACTTC TGT-3, reverse primer: 5- GTAGG CGACA TGCTT TCTTG G-3; MET frem primer: 5-GTCGG AGTAG AGCGT CGAGA-3, reverse primer: 5-CAGCG CGATC AGGTA GAGC-3; TOP2A frem primer: 5-ACCAT TGCAG CCTGT AAATG A-3, reverse primer: 5-GGGCG GAGCA AAATA TGTTC C-3; ADAM12 frem primer: 5-TCAAC CTGGA TACCC GATTC C-3, reverse primer: 5-GCTCT GTCTG CCGAT GGAG-3; VCAN frem primer: 5-GTAAC CCATG CGCTA CATAA AGT-3, reverse primer: 5-GGCAA AGTAG GCATC GTTGA AA-3. Følgende primere ble brukt i full MET 3UTR søknaden: MET 3'UTR frem primer: 5-TCACT GCCTG ACCTT TA-3, MET 3'UTR reverse primer: 5-ATCAC TTACT CCCAC AAT-3. SiRNA nucleotide for MET ble brukt som følger: siRNA-MET frem: 5-GUGCC ACUAA CUACA UUUAU U-3, siRNA-MET omvendt. 5-UAAAU GUAGU UAGUG GCACU U-3
Statistisk analyse
Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM, og dataene ble analysert med Student t-test. En verdi på p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
mikroRNA uttrykk profil i magekreft Host Sammenligning av peritoneal metastatisk vev med sammenkoblede primære foci prøver av GC bruker hierarkisk clustering analyse avdekket systematisk variasjon i uttrykket av miRNAs og gener (Figur 1A og B). Våre data tyder på at et sett av miRNAs og gener er ofte abnormt uttrykt i peritoneal metastatisk vev av GC. I tillegg fant vi også at noen tidligere Brønnen påviste molekyler, slik som MIR-7 [18], Mir-25 [17], TOB1 og IGF1R, ikke ble identifisert i våre mikromatriser. Vi tenkte disse forskjell kan induseres ved mangfold av kliniske prøver kom fra forskjellige områder. Figur 1 Kjerne miRNA-genet nettverk, inkludert 8 viktige mirnas og sine mål. Hierarkisk clustering analyse av 27 mirnas (A) og 32 (B) gener som er differensielt uttrykte mellom metastatiske vev i det peritoneale og sammenkoblede primære prøver av GC (større enn 2,0 ganger; p < 0,05). Ekspresjons-verdier er representert i nyanser av rødt og grønt, noe som indikerer ekspresjon over og under den midlere uttrykket verdi på tvers av alle prøver. (C) Den miRNA-genet nettverk viser forholdene mellom 8 nøkkel mirnas og tumorassosierte gener som de er forutsagt å regulere. Fargene indikerer kommenterte uttrykk nivåer av miRNAs og gener.
MiRNA-gen-nettverket ble satt sammen med mål om å identifisere de viktigste mirnas som regulerer tumorassosiert genuttrykk under utviklingen av tumormetastaser. Fordi koekspresjon moduler sannsynligvis tilsvarer biologiske mekanismer, fokuserte vi på koekspresjon moduler som er forbundet med et høyt antall av protein-kodende gener. Videre NCBI RefSeq detaljer funksjonene til mange gener, som hjulpet vår identifikasjon av GC-assosiert gener. Ved hjelp av denne metoden, karakteriseres vi rollen som MIR-144 i peritoneal metastaser fra GC. I kreft koekspresjon nettverket, MIR-144 koblet til 6 proteinkodende gener som er involvert i tumorvekst og metastasering (figur 1C).
Regulatory rolle MIR-144 i magekreft metastaser
å undersøke speil 144 funksjon, ser vi først undersøkt MIR-144 nivåer i et panel på 6 humane GC-cellelinjer. Som vist i figur 2A, valgte vi AGS, karakterisert med oppregulert MIR-144, og SNU-5, karakterisert med downregulated MIR-144, for videre studier. AGS-cellelinjen ble avledet fra gastrisk tumorfragmenter som ble resekterte fra en pasient som hadde fått noen tidligere behandling, mens SNU-5 ble utledet fra ascites av en pasient med dårlig differensiert karsinom i magen. Figur 2 MiR-144 undertrykker migrering av GC-celler. (A) Expression nivåer av MIR-144 ble sjekket i et panel av 6 menneskelige GC cellelinjer ved hjelp av real-time PCR-metoden. (B) Migrasjon av SNU-5 celler behandlet med Mir-144 etterligner ble kontrollert ved hjelp av ikke-matrigel behandlet transwell kammeret. (C) Migrering av AGS celler behandlet med en MIR-144 inhibitor ble kontrollert ved hjelp av ikke-matrigel behandlet transwell kammeret. (*** P < 0,001).
I vår studie observerte vi en nær sammenheng mellom MIR-144 tap og metastaser i GC (figur 1A og C). Tilsvarende har tidligere studier dokumentert MIR-144-basert hemming av tumorcellemigrasjon og invasjon i epitelial plateepitelkarsinom. Vi antok at gjeninnføring av Mir-144 uttrykk ville undertrykke kreft celle migrasjon. Passende innføring av MIR-144 uttrykk hemmet celle migrasjon i SNU-5 (figur 2B). Sammenlignet med SNU-5, AGS celler har et relativt høyere nivå av endogen MIR-144 uttrykk. Ikke overraskende, hemming av MIR-144 økt AGS celle migrasjon (figur 2C). Faktisk, også utførte vi invasjonen analyse ved bruk av matrigel-behandlede transwell, og det er ingen forskjell for invasiv evne av SNU-5 /AGS-celler etter behandling med MIR-144 /anti-MIR-144 (Data ikke vist). Resultatene viste at MIR-144 spiller en viktig rolle i migrasjon, men ikke i invasjonen av GC-celler.
MIR-144 påvirker MET uttrykk
Gjennom ektopisk uttrykk for MIR-144 i SNU-5 celler, vi bestemt ADAM12 , VCAN og MET er mulige Mir-144 mål. Som vist i figur 3A, Mir-144 uttrykk dramatisk påvirket mRNA nivåer av ADAM12, VCAN og MET. ADAM12, VCAN og MET protein uttrykk nivåer ble også påvist gjennom western blot i kreftceller transfektert med Mir-144 etterligner. Som vist i figur 3B, bare MET protein nivåer ble nedregulert av MIR-144. Dette indikerer at MIR-144 påvirker MET ekspresjonen på transkripsjonsnivå, kanskje gjennom spalting eller destabilisering av mRNA struktur. Men vi fant også ADAM12 og VCAN protein nivåer er ikke redusert med eksogent innføring av MIR-144. Vi tenkte at mRNA og proteinnivåer ikke kan være direkte korrelert på grunn av forskjellig halveringstid. Vi tenkte også de viste som kan være på grunn av tilstedeværelsen av MIR-144 som ble kontinuerlig undertrykker oversettelse i ett tilfelle, men ikke den andre. The MET: MIR-144 interaksjonen ble også demonstrert i levende celler ved RNA-CHIP analysen. Faktisk ble endogen MIR-144 funnet assosiert med endogent MET i anti-MET, men ikke anti-IgG immunpresipitatene fra celler (figur 3C). Figur 3 Uttrykk for MET ble regulert av MIR-144. (A) mRNA nivåer av antatte Mir-144 målene ble undersøkt ved real-time PCR i SNU-5 celler transfektert med Mir-144 etterligner eller MIR-NC. (B) Protein nivåer av antatte Mir-144 målene ble undersøkt av western blotting i SNU-5 celler transfektert med Mir-144 etterligner eller MIR-NC. (C)% inngangs inngang på de RNA-chip reaksjoner illustrerer anrikning av MET antistoff. RNA-chip-analysen for MIR-144 utført på anti-MET antistoff fra lysater av celler. RNA-brikke med en nonrelated IgG fungerte som kontroller. (D) En skjematisk bilde av den antatte MIR-144 bindingssete i 3'UTR av MET. (E) SNU-5 celler ble midlertidig ko-transfektert med LUC-MET 3'UTR og Mir-144 etterligne. (F) AGS celler ble midlertidig ko-transfektert med LUC-MET 3'UTR og MIR-144-hemmer. (G) mutere av MIR-144 bindingssetet i MET 3'UTR avskaffet MIR-144-indusert luciferaseaktivitet undertrykkelse. Luciferase aktivitet ble målt etter 24 timer og normalisert til co-transfektert Renilla. (* P < 0,05, ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Bruke bioinformatiske basert analyse, identifiserte vi et enkelt miRNA bindingssete for MIR-144 i 3 'UTR av MET mRNA (Figur 3D). For å teste om MIR-144 direkte binder 3'-UTR fra MET mRNA, utførte vi luciferaserapportørplasmid analyser i SNU-5 celler. PCR-avledede fragmenter fra MET 3'UTR ble satt inn i pGL3 kontroll vektor på Xba1 stedet (LUC-MET 3'UTR). Co-transfeksjon av LUC-MET 3'UTR og Mir-144 etterligner i SNU-5 celler resulterte i en redusert luciferase signal (sammenlignet med MIR-NC), som bekrefter at binding av MIR-144 til 3'UTR av MET har en direkte hemmende effekt (Figur 3E). Det motsatte forsøk, oppnådd ved å blokkere endogen MIR-144 produksjon med en MIR-144 inhibitor i AGS-celler, resulterte i økt luciferase signal (figur 3F). En mutert luciferase reporter på MIR-144 bindingssetet ble også konstruert (figur 3D). Mutasjon av miRNA bindingssetet avskaffet MIR-144-mediert hemming av luciferase aktivitet (figur 3G). Disse dataene antyder at 1430-1436 plasseringen av MET 3'UTR er kritisk for MIR-144-mediert genregulering.
MET formidler MIR-144-indusert motstand mot migrasjon
Bruke real-time PCR, MET ekspresjonsnivåer ble bestemt for seks humane GC-cellelinjer. Som vist, cellelinjer med "nedregulert" Mir-144 nivåer har høyere mengder av MET i forhold til cellelinjer med "oppregulert" Mir-144 nivåer (Figur 4A). Ved hjelp av parametriske tester, bestemt vi en signifikant invers korrelasjon mellom MET mRNA og Mir-144 uttrykk i GC metastatisk prøvene (figur 4B). Figur 4 MET modulasjon står for antimetastatic effekten av MIR-144. (A) Western blot som viser MET ekspresjon i et sett av humane GC cellelinjer. (B) En betydelig invers korrelasjon observert mellom de MIR-144 og MET ekspresjonsnivåene i GC vev (n = 52). (C) The MET og fosforylert Akt ble hemmet av den tvungne uttrykk for MIR-144 eller siRNA-MET. (D, E) Virkningene av MIR-144 eller siRNA-MET på migrasjon og spredning ble bestemt i SNU-5 celler. (F) The MET og fosforylert Akt ble restaurert av overekspresjon av MET i MIR-144 ligner behandlet SNU-5 celler. (G, H) Virkningen av MIR-144 i kombinasjon med MET-ORF på migrasjon og proliferasjon av SNU-5-celler. (I) The MET og fosforylert Akt ble oppregulert ved å blokkere av MIR-144 i AGS celler. (J, K) Effekten av anti-MIR-144 på migrasjon og spredning av AGS celler.
Met protein fungerer som en reseptor tyrosin kinase og spiller en sentral rolle i å fremme cellevekst og migrasjon av transducing ekstracellulære stimuli til intracellulære signalkretser. En fremtredende del av den intracellulære signaleringsmaskiner er det PI3K (fosfoinositid 3-kinase) reaksjonsveien [20,21]. Fordi MIR-144 hemmer MET uttrykk, hypotese vi at MIR-144 kan til slutt redusere Akt fosforylering og aktivering gjennom redusert MET signalering. Derfor undersøkte vi Akt fosforylering nivåer etter MIR-144 overekspresjon og observert en betydelig reduksjon av Akt fosforylering (Figur 4C).
Vi bestemte oss for å undersøke om MIR-144-indusert MET downregulation hatt en effekt på tumorcellevandring og spredning. Vi transfektert MIR-144 og siRNA for MET (siRNA-MET) i SNU-5 celler. Cellemigrasjon ble evaluert 16 timer etter transfeksjon av transwell analysen, mens celleproliferasjon ble fastsatt gjennom CCK-8. Som vist i figurene 4D og E, transfeksjon med MIR-144 hemmet cellemigrering og proliferasjon sammenlignet med kontroll. Tilsvarende mink MET protein uttrykk ved hjelp av siRNA også redusert svulst celle migrasjon og spredning.
For å avgjøre om MET er kritisk formidler av MIR-144 effekt på cellulær migrasjon og spredning, bygget vi to MET ekspresjonsvektor. Hvorav den ene inneholder bare den åpne leseramme sekvens av MET-genet (MET-ORF), og en annen vektor inneholder den fulle lengde av nukleotid-MET-genet inkludert 3'UTR-sekvensen (Met-fullstendig lang). Vi deretter utført western blot analyse 48 timer etter transfeksjon av MET-ORF /MET-fulle til langt på Mir-144 etterligner behandlet SNU-5 celler (Figur 4F). Sammenlignet med den negative kontrollgruppen (tom vektor), ektopisk ekspresjon av MET-ORF økte betydelig den totale ekspresjon av MET og fosforylert Akt. Videre uttrykk for MET-ORF forfremmet migrasjon og spredning av GC-celler (figur 4G og H). Overekspresjon av MET avskaffet MIR-144-indusert hemming av cellevandring og spredning. I motsetning til dette proteinnivået MET og fosforylert-AKT øket i AGS celler behandlet med anti-MIR-144 (figur 4I), og blokkering av MIR-144 også fremmet migrasjon og proliferasjon av AGS-celler (figur 4j og K). Disse resultatene indikerer at MET er en kritisk mål for anti-migrering effekten av MIR-144 i humane GC-celler.
Diskusjon
I denne studien har vi identifisert ikke-overlappende signaturer av et lite antall miRNAs og gener som er avvikende uttrykt i peritoneale metastatiske vev av GC, sammenlignet med sammenkoblede primære vev. Analyse av miRNA og genuttrykk profiler i miRNA-genet-nettverk identifiseres MIR-144 som en regulator av store onkogene veier, for eksempel spredning og migrasjon. GC pasienter med peritoneal metastaser hadde lavere Mir-144 uttrykk nivåer enn pasienter uten metastaser. Dette funnet impliserer MIR-144 som en potensiell tumor suppressor i GC. Videre er MIR-144 forbundet med mekanismene for metastasering. Våre resultater samsvarer med resultatene fra tidligere studier på rollen som MIR-144 i kreft spredning, migrasjon og invasjon [22,23]. MIR-144 hemmer kreftcelle metastase ved å målrette den A disintegrinproteinet og metalloproteinase (ADAM) protein familiemedlem ADAMTS5. MikroRNA dysregulering er assosiert med økt tumor invasivitet og metastase, såvel som redusert pasient prognose i visse epiteliale cancere [24]. Vi undersøkte videre rolle MIR-144 deregulering i GC. Vi har studert effekten av MIR-144 ekspresjon i SNU-5 cellelinje, da det er kjennetegnet ved lav ekspresjon av MIR-144. Ektopisk uttrykk for MIR-144 i SNU-5 celler fører til dyptgripende fenotypiske endringer, som redusert migrasjon. Det motsatte forsøk blokkerer MIR-144 ekspresjon, ble gjennomført i AGS-cellelinjen, som har et relativt høyt nivå av endogen MIR-144 uttrykk. Hemming av MIR-144 uttrykk resulterte i økt AGS celle migrasjon.
Å undersøke mekanismen bak MIR-144-avhengige redusert migrasjon av GC, vi identifisert de antatte målene for MIR-144 som spådd av miRNA-gen-nettverk. MIR-144 overekspresjon kan redusere MET uttrykk både mRNA og proteinnivåer, og tilsvarende, luciferaserapportørplasmid analyser viste at MIR-144 kan direkte samhandle med MET 3'UTR. Vi så evaluert MET uttrykk nivåer i en kohort av 52 GC pasienter og fant at MIR-144 nivåer er inverst korrelert til MET uttrykk. Av den grunn, hypotese vi at MIR-144 hemmer GC tumorigenesis ved å målrette MET uttrykk. MET har også blitt beskrevet som en MIR-34a /c target i andre cellemodeller og er kjent for å fremme motilitet og invasive evnen til tumorceller. Overekspresjon av MET er nært korrelert med tumorinvasjon og pasient prognose i GC [6]. I GC, er MET overekspresjon en uavhengig prognostisk faktor og potensielle narkotika mål. Videre kan MET overekspresjon forutsi hvilke pasienter som kan ha nytte av målrettet terapi med MET-hemmere [25]. I vår studie ble MET uttrykk signifikant assosiert med GC differensiering, TNM og metastasering [26]. Vi fastslått at endringer i celleproliferasjon og migrasjon gjennom MIR-144 kan utøves gjennom regulering av MET uttrykk. MIR-144 undertrykking fører til økte nivåer av MET, noe som kan forklare den metastase fenotype av MIR-144-utarmet celler. Interessant, MIR-144 påvirket hepatocytter vekstfaktor (HGF) signalering. HGF, som liganden av MET, kan indusere aktivering av MET i epitelceller. Mens MET overekspresjon ikke kunne helt gjenopprette GC tumorigene kvaliteter, ble GC celle migrasjon og spredning delvis restaurert etter MET overekspresjon. Derfor kan MIR-144 regulerer andre gener i GC-celler. Tidligere studier har vist at MET kan indusere GC tumorigenesis gjennom aktivering av PI3K pathway. I denne studien fant vi at MIR-144 betydelig svekket Akt fosforylering, og at Akt fosforylering ble fullstendig restaurert med overekspresjon av MET. Våre funn tyder på at Mir-144 regulerer Akt fosforylering gjennom MET regulering i GC.
Konklusjonen vår studie identifisert et grunnlag for redusert nivå av MIR-144 sett i GC metastatisk vev. MIR-144 ble identifisert som et potensielt tumor suppressor i GC, og har vært forbundet med mekanismene for GC metastasering. Videre hemmer MIR-144 GC tumorigenesis ved å målrette MET, og senere, den PI3K /Akt veien. Så vidt vi vet er dette første gang MIR-144 har vist seg å målrette MET i GC-celler. Derfor kan videre studier som utforsker anticancer rolle MIR-144 bidrar til utvikling av nye terapeutiske strategier for GC.
Merknader
juni Liu og Hui Xue bidratt likt til dette arbeidet.
Erklæringer
Takk
Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (Grant nr 81201897). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Konkurrerende interesser
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Forfatternes bidrag
JL utførte molekylærbiologiske studier. HX utarbeidet manuskriptet. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Association of nærvær /fravær og av /på mønstre av Helicobacter pylori oipA gen med mavesår og mage kreftrisiko: en meta-analyse
• Forholdet mellom gut hormoner og glukose homeostase etter fedmekirurgi