МикроРНК-144 ингибирует метастазирование рака желудка путем охвата MET expression

микроРНК-144 ингибирует метастазирование рака желудка путем пристреливать MET выражение
Аннотация
рак желудка (GC) остается одним из наиболее распространенных видов злокачественных рака, и молекулярный механизм, лежащий в основе его метастаз по-прежнему в значительной степени неясным. MicroRNAs стали важными регуляторами метастаз из-за их способности действовать на нескольких сигнальных путей. В нашем исследовании мы обнаружили, что микроРНК-144 значительно подавляются в обоих высоко метастатических GC клеточных линий и тканей. Результаты обоих усиления из-функции и с потерей функции экспериментов показывают, что увеличение микроРНК-144 экспрессия существенно снижается миграция GC клеток, в то время как уменьшилось микроРНК-144 экспрессии значительно расширенной миграции GC клеток. Встретил прото-онкогенов (MET), который часто усиливается в злокачественных опухолях человека и функций в качестве важного регулятора клеточного роста и инвазии опухоли, был идентифицирован как прямая мишень микроРНК-144. Кроме того, глушение MET с помощью малых интерферирующих РНК (миРНК) анти воспроизводятся метастатического-функцию MIR-144, в то время как восстановление экспрессии MET ослабляются функции MIR-144 в GC клетках. Кроме того, мы обнаружили, что микроРНК-144, с помощью ориентации MET, подавляет фосфорилирование Akt. Наконец, мы наблюдали обратную корреляцию между экспрессией микроРНК-144 и мРНК MET в GC метастатических тканях. Таким образом, микроРНК-144 подавляет прогрессирование GC непосредственно downregulating экспрессию Met, который впоследствии предотвращает активацию про-онкогенных Akt пути. Реинтродукция MIR-144 экспрессия в клетках GC представляет собой привлекательный терапевтический подход, чтобы блокировать метастазирование рака желудка.
Ключевые слова
микроРНК микроРНК-144 MET Рак желудка Метастазы Введение
Глобально, рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных видов злокачественных заболеваний. В 2008 году был поставлен диагноз около 989600 новых случаев GC. Кроме того, GC был замешан в качестве причины 738,000 смертей, что делает GC четвертым самым распространенным злокачественным и является ведущей причиной смерти от рака во всем мире [1]. По мере прогрессирования опухоли, она развивается способность к вторжению в окружающие ткани и метастазировать. Рецептор фактора роста гепатоцитов, Met, как известно, содействовать моторики и инвазивные способности опухолевых клеток [2]. МЕТ является членом рецепторных тирозинкиназ семейства и было показано, что усиливает свою активность во многих опухолях [3-5]. Предполагается, что уровень экспрессии MET увеличивается либо амплификации гена или гипоксии через HIF1α. У пациентов с метастатическим GC, Met усиления и сильной экспрессии белка не являются нечастыми. Эти события по всей видимости, в значительной степени связано с неблагоприятным клиническим исходом [6]. Примерно 10% белых пациентов гавани прирост пяти или более копий MET. Кроме того, этот выигрыш в MET количество копий в значительной степени связано с неблагоприятным прогнозом [7]. Кроме того, микроРНК-34а /с микроРНК, как было показано отрицательно модулировать экспрессию MET в клеточных линиях, полученных от рака простаты, гепатоцеллюлярной карциномы и GC [8-10].
MicroRNAs (микроРНК) являются некодирующие молекулы РНК, приблизительно 21-23 нуклеотидов в длину, которые регулируют экспрессию генов на транскрипционном или пост-транскрипционном уровне [11-13]. микроРНК выражение профилирование анализы показали глобальный понижающей регуляции зрелых уровней микроРНК в опухолях человека по сравнению с нормальными тканями [14]. Кроме того, микроРНК может функционировать в любом качестве супрессора опухоли или онкогенных роли, в зависимости от зависимости от их цели. Например, микроРНК-133b был значительно понижающей регуляции в тканях GC и оказали свою опухолевый супрессор роль в GC клетки [15]. Выражение MIR-337-3p была значительно подавлена ​​в лимфатических узлов метастазами тканей пациентов GC и индукция микроРНК-337-3p выражение действительно уменьшают желудочную способность инвазии раковых клеток [16]. микроРНК-25 способствует развитию GC непосредственно downregulating выражение TOB1; Таким образом, повышенная экспрессия микроРНК-25 представляет собой потенциальную неинвазивного биомаркера для прогноза GC пациентов [17]. Кроме того, микроРНК-7 значительно подавляются в обоих высоко метастатических GC клеточных линий и метастатических тканей. Сверхэкспрессия MIR-7 заметно ингибирует GC метастазирования путем воздействия на экспрессию инсулиноподобного фактора роста-1 рецептора (IGF1R) онкоген [18]. В строках GC клеток, реинтродукции результатов экспрессии микроРНК-144 в репрессии ZFX, который умеренно повышает чувствительность раковых клеток к 5-фторурацила. В 93 случаях первичного GC, снижение экспрессии микроРНК-144 был связан с плохим прогнозом [19]. Эти примеры подчеркивают ключевую роль микроРНК в GC злокачественности и прогрессии рака.
В этом исследовании мы охарактеризовали цели и определили механизм действия MIR-144 в GC. По индукции эктопической экспрессии микроРНК-144, мы обнаружили MET является новым объектом микроРНК-144 регулирования. Этот вывод был подтвержден на обеих мРНК и белка уровней, и ген-репортер люциферазы анализы проверены прямого связывания микроРНК-144 на сайт регуляторной связывания в 3'UTR МЕТ. Кроме того, мы обнаружили, что экспрессия МЕТ обратно коррелирует-Mir 144 уровней в небольшой, но хорошо документированный когорте GC. Мы предполагаем, что микроРНК-144 ингибирует GC метастаз, и что некоторые из этого ингибирование опосредовано ориентации MET экспрессии.
Материалы и методы
образцы человеческих тканей и клеточных линий
образцы GC были собраны от пациентов, перенесших операцию в университете Фудань Shanghai Cancer Center между 2012 и 2013 г. протокол был утвержден клинический исследовательский комитет по этике университета Фудань побочный, и исследование было проведено в соответствии с положениями Хельсинкской декларации 1975 г. Все образцы были получены с информированного согласия пациентов. Человек GC клеточная линия AGS (ATCC® CRL-1739 ™), СНУ-1 (ATCC® CRL-5971 ™), СНУ-5 (ATCC® CRL-5973 ™), СНУ-16 (ATCC® CRL- 5974 ™) , NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), и КАТО III (ATCC® HTB-103 ™) поддерживали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Все клеточные линии поддерживали в среде, содержащей пенициллин (100 МЕ /мл) и стрептомицин (100 мг /мл) при 37 ° С с 5% СО2. Мимика и ингибиторы микроРНК были приобретены у Ambion (Остин, штат Техас, США).
Выделение РНК и ПЦР в реальном времени
Суммарную РНК экстрагировали из клеток с использованием TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Для анализа микроРНК, поли (А) хвосты были добавлены к общей РНК с использованием поли (А) полимеразы (Амбион, Карлсбад, Калифорния) до обратной транскрипции. Комплект обнаружения MiRcute микроРНК КПЦР (TIANGEN, Пекин, Китай) использовали для количественной оценки уровней экспрессии микроРНК-144 в соответствии с предоставленным протоколом. Были использованы следующие условия ПЦР: 95 ° С в течение 30 сек, затем 40 циклов при 95 ° С в течение 5 с и 60 ° С в течение 31 сек. Сумма целевого (МЕТ /микроРНК-144), нормированы на эндогенного гена домашнего хозяйства GAPDH /U6snRNA и относительно эталонного образца, задается следующим уравнением: количество целевых = 2- △△ КТ
микрочипов гибридизации.
Вкратце, образцы РНК были использованы для синтеза двухцепочечной комплементарной ДНК (кДНК), так и в двухцепочечной кДНК, метили и гибридизовали с микрочипом (Arraystar, Rockville, MD). После гибридизации и промывки, обработанные предметные стекла сканировали с микрочипов сканером Аксон GenePix 4000B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Значение Р рассчитывалась с использованием парного критерия Стьюдента. Порог, установленный для вверх и вниз регулируемых генов была складка изменение > 2,0 и значение р &л; 0.05. Иерархическая кластеризация проводили на основе дифференциально экспрессируемых генов и микроРНК с использованием программного обеспечения кластера TreeView из Стэнфордского университета (Пало-Альто, Калифорния).
МикроРНК-генная сеть
Мы построили сети смежности между двумя генами, я и J, определяемый как степень корреляции Пирсона между соответствующими профилями экспрессии генов, XI и XJ. Матрица смежности, М (I, J), визуализировали в виде графа, и были исследованы топологические свойства этого графика. Для того, чтобы визуальное представление, только самые сильные корреляции (&GТ; 0,98) были сделаны в этих визуализаций. В микроРНК-генных сетей, каждый ген соответствует узлу. Два гена связаны ребром, что указывает на сильную корреляцию. В рамках сетевого анализа, степень является самым простым, наиболее важной мерой центральности гена в сети и определяет относительную важность. Степень определяется как число непосредственно связанных соседей
Прогнозирование микроРНК-144 сайта связывания
Предполагаемые микроРНК-144 сайтов связывания в нетранслируемой области мРНК MET 3 'были предсказаны программой Target Scan (HTTP:. //www.targetscan.org). Позиция 1430-1436 МЕТ 3 'UTR имеет законсервированный сайт связывания микроРНК-144 таргетирования.
Плазмид трансфекцию
В ORF последовательности МЕТ амплифицировали из геномной ДНК, выделенной из клеточной линии СНУ-5, а затем субклонировали в Plenti вектор. Эту плазмиду трансфицируют в клетки СНУ-5 с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). Через 24 часа клетки были использованы для спасателя эксперимента.
Олигонуклеотид трансфекция
MIR-144 подражает, ингибитор микроРНК-144 (анти-микроРНК-144), и МЕТ миРНК (миРНК-МЕТ) были синтезированы Genepharma , Шанхай, Китай. Олигонуклеотид трансфекцию проводили с Липофектамин 2000 реагентами (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Конечная концентрация микроРНК-144 мимике, анти-микроРНК-144 или миРНК-МЕТ в системе трансфекции составляла 100 нМ. Эффективность трансфекции для одно- и котрансфицируют исследований определяли с помощью флуоресцентного микроскопа.
иммуноблоттинга
Эквивалентные количества клеточных лизатов были решены на 7% SDS /PAGE и переносили на поливинилиденфторида мембраны. Мембрану инкубировали с кроличьей поликлональной анти-Met антитела (1: 500, Abcam, ab47431), коза поликлональной анти-Адам-12 антителом (0,3 мкг /мл, Abcam, ab28747) и кроличьего поликлонального анти-Versican антителом (1 мкг /мл, Abcam, ab19345). IRdye-меченых вторичных антител были использованы для количественного определения сигнала иммуноблоттинга, а сигналы были проанализированы с помощью сканера Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
РНК-элементных анализ
РНК-белковых взаимодействий фиксируются с формальдегидом, и хроматин сдвигового усилия в сочетании с обработкой ДНКазой с образованием РНК /белковые комплексы, которые могут быть иммунопреципитации с антителами к МЕТ белками. Перекрестные ссылки впоследствии восстанавливаются; РНК выделяют и снова обрабатывали ДНКазой, чтобы гарантировать отсутствие ДНК. РНК осаждают из иммунного комплекса затем анализироваться ПЦР в реальном времени. В этой РНК-элементных анализе, можно использовать следующую формулу:% от входного сигнала (восстановления) = АЕ (Ct вход-Ct образец) * Fd * 100%. Здесь АЕ эффективность амплификации (10 (-1 /наклон)) и Fd является коэффициент разбавления входного РНК, чтобы сбалансировать разницу в количестве РНК-элементных образца и входной РНК, используемых для ПЦР в реальном времени.
люциферазы
в полной мере MET 3'-UTR амплифицировали с помощью ПЦР с использованием SNU-5 кДНК в качестве матрицы и клонировали в вектор управления pGL3. Мы использовали Quick Change мутагенеза мутировать предположительный сайт связывания микроРНК-144 (Stratagene, Санта-Клара, Калифорния, США). СНУ-5 клеток и AGS клетки трансфицировали микроРНК-144 /мимике и ингибиторы pGL3 люциферазы репортер конструкций, несущие MET 3'UTR. Через 24 ч деятельность люциферазы светлячка и Renilla люциферазы в клеточных лизатов были измерены с помощью двойного люциферазы системы анализа (Promega, Madison, WI, США).
Миграции анализы
Для Transwell миграции анализов, 1 × 105 клеток высевали в верхней камере, содержащей мембрану, не покрытой оболочкой. Клетки высевали в среде без сыворотки, и среда с добавлением 10% (об /об) сыворотки использовали в качестве хемоаттрактанту в нижней камере. Клетки инкубировали при 37 ° С в питательной инкубаторе ткани с 5% (об /об) СО2. Через 16 ч неперемещенным клетки удаляли из верхних сторон фильтра вставок Transwell мембран. Перенесенные клетки на нижних сторонах вставок окрашивали Кумасси бриллиантовым синим, и клетки подсчитывали. Анализ
пролиферации клеток
Трансфицированные клетки высевали в 96-луночные планшеты при плотности 1 × 104 клеток /Что ж. Анализе пролиферации клеток проводили с использованием Cell Counting Kit-8 (DOJINDO, Кумамото, Япония) в соответствии с инструкциями изготовителя. Перед добавлением CCK-8, клетки промывают теплой культуральной среды путем прядения планшет при 500 оборотах в минуту в течение 3 м, а затем отбрасывая супернатант
Грунтовки
Следующие праймеры использовали для ПЦР в реальном времени.: микроРНК-144: 5-TACAG TATAG ATGAT GTACT-3; U6snRNA: 5-CGCAA GGAUG ACACG CAAAU UCGUG AAGCG UUCCA UAUUU УУ-3; SKIL прямой праймер: 5-GTTAA GCGAA CCTGT ACTTC TGT-3, обратный праймер: 5- GTAGG CGACA TGCTT TCTTG G-3; MET прямой праймер: 5-GTCGG AGTAG AGCGT CGAGA-3, обратный праймер: 5-CAGCG CGATC AGGTA GAGC-3; Top2a прямой праймер: 5-ACCAT TGCAG CCTGT AAATG A-3, обратный праймер: 5-GGGCG GAGCA AAATA TGTTC C-3; Адам-12 прямого праймера: 5-TCAAC CTGGA TACCC GATTC C-3, обратный праймер: 5-GCTCT GTCTG CCGAT GGAG-3; VCAN прямой праймер: 5-GTAAC CCATG CGCTA CATAA АГТ-3, обратный праймер: 5-GGCAA AGTAG GCATC GTTGA AA-3. Следующие праймеры использовали для полного применения МЕТ 3UTR: МЕТ 3'UTR пр мой праймер: 5-TCACT GCCTG ACCTT ТА-3, Met 3'UTR обратный праймер: 5-ATCAC TTACT CCCAC ААТ-3. МиРНК нуклеотиддля MET использовали следующим образом: миРНК-МЕТ вперед: 5-GUGCC ACUAA CUACA UUUAU U-3, миРНК-МЕТ обратное:. 5-UAAAU GUAGU UAGUG GCACU U-3
Статистический анализ
Результаты представлены в виде среднего ± SEM, и данные были проанализированы с помощью критерия Стьюдента. Значение р < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты экспрессии микроРНК в профиль рака желудка
Сравнение перитонеального метастатических тканей с парными образцами первичных очагах GC с использованием иерархического кластерного анализа выявлены систематические различия в экспрессии микроРНК и генов (рис 1А и В). Наши данные свидетельствуют о том, что набор микроРНК и генов часто аберрантно выражается в перитонеальной метастатических тканях GC. Кроме того, мы также обнаружили, что некоторые ранее хорошо зарекомендовавшие себя молекулы, такие как MIR-7 [18], MIR-25 [17], TOB1 и IGF1R, не были быть идентифицированы в наших микрочипов. Мы думали, что эти различия могут быть вызваны разнообразием клинических образцов происходил из разных областей. Рисунок 1 Базовая сеть микроРНК-гена, в том числе 8 ключевых микроРНК и их цели. Иерархический кластерный анализ 27 микроРНК (А) и 32 генов (В), которые были дифференциально экспрессирующихся метастатических тканей в перитонеальной и парными первичных образцов GC (более чем 2,0 раза; р ≪ 0,05). значения экспрессии представлены в оттенки красного и зеленого цвета, указывая выражение выше и ниже среднего значения выражения во всех образцах. (C) Сеть микроРНК-гена показывает взаимосвязь между 8 ключевых микроРНК и опухолевых генов, ассоциированных с их прогнозируемыми регулировать. Цвета указывают аннотированные уровни экспрессии микроРНК и генов.
МикроРНК-ген-сеть была собрана с целью выявления ключевых микроРНК, которые регулируют экспрессию генов ассоциированных с опухолью во время прогрессии метастазирования опухоли. Поскольку соэкспрессии модули, вероятно, соответствуют биологических путей, мы сосредоточили внимание на соэкспрессии модулей, которые связаны с большим количеством белок-кодирующих генов. Кроме того, NCBI RefSeq подробно функции многих генов, которые подкрепили нашу идентификацию GC-ассоциированных генов. С помощью этого метода, мы охарактеризовали роль микроРНК-144 в брюшную метастатических очагов GC. В соэкспрессии сети рака, микроРНК-144 соединен с 6-белок-кодирующих генов, которые вовлечены в рост опухоли и метастазирование (Рисунок 1С).
Регуляторная роль микроРНК-144 в желудочном метастазирования рака
Для изучения зер- 144 функции, мы сначала исследовали уровни микроРНК-144 в панели 6 линий человека GC клеток. Как показано на рисунке 2А, ​​мы выбрали АГС, характеризующийся с активируемых MIR-144 и SNU-5, отличающийся тем, с подавляются MIR-144, для дальнейшего изучения. Клеточная линия AGS была получена из желудка фрагментов опухоли, которые резецировали от пациента, который не получал никакой предшествующей терапии, в то время как СНУ-5 была получена из асцита пациента с плохо дифференцированным раком желудка. Рисунок 2 MIR-144 подавляет миграцию клеток GC. Уровни (A) экспрессии микроРНК-144 были проверены на панели 6 линий GC клеток человека с использованием в режиме реального времени методом ПЦР. (В) Миграция SNU-5 клеток, обработанных с микроРНК-144 подражает проверяли не используя-Матригель обработанного Transwell камеры. (C) Миграция клеток AGS, обработанных ингибитором микроРНК-144 был проверен не используя-Матригель обработанного Transwell камеры. (*** Р &л; 0,001).
В нашем исследовании мы наблюдали тесную связь между микроРНК-144 потери и метастазов в GC (рис 1А и С). Соответственно, более ранние исследования документально микроРНК-144 на основе ингибирования миграции опухолевых клеток и инвазии в эпителиальной плоскоклеточной карциномы. Мы предположили, что реинтродукции экспрессии микроРНК-144 будет подавлять миграцию раковых клеток. Соответственно, введение экспрессии микроРНК-144 ингибирует клеточную миграцию в SNU-5 (рис 2B). По сравнению с СНУ-5, AGS клетки имеют относительно более высокий уровень экспрессии эндогенного микроРНК-144. Неудивительно, что ингибирование микроРНК-144 увеличилась на миграцию клеток AGS (рис 2С). На самом деле, мы также провели анализ вторжения с использованием Матригель обработанных Transwell, и нет никакой разницы для инвазивной способности СНУ-5 /AGS клеток после того, как лечение с микроРНК-144 /анти-MIR-144 (данные не показаны). Эти результаты продемонстрировали, что микроРНК-144 играет важную роль в миграции, но не вторжение в GC клетки.
МикроРНК-144 влияет на экспрессию MET
Через эктопической экспрессии микроРНК-144 в SNU-5 клеток, мы определили, Адам-12 , VCAN и MET являются предположительные микроРНК-144 цели. Как показано на фигуре 3А, экспрессия микроРНК-144 резко повлияло на уровни мРНК, VCAN Адам-12 и добычу полезных ископаемых. уровни экспрессии белка Адам-12, VCAN и МЕТ были также обнаружены с помощью вестерн-блоттинга в раковых клетках, трансфицированных микроРНК-144 мимике. Как показано на фигуре 3В, только MET уровни белка были подавляются с помощью микроРНК-144. Это указывает на то, что микроРНК-144 влияет на экспрессию MET на транскрипционном уровне, возможно, путем расщепления или дестабилизации структуры мРНК. Тем не менее, мы также обнаружили, что уровни белка и VCAN Адам-12 не уменьшились на экзогенного введения микроРНК-144. Мы думали, что мРНК и уровни белка не может быть непосредственно коррелируют из-за различной полураспада. Мы также думали, что они показали, что может быть связано с наличием MIR-144, который непрерывно подавляя перевод в одном случае, но не других. MET: взаимодействие микроРНК-144 было также продемонстрировано в живых клетках с помощью РНК-CHIP анализа. На самом деле, эндогенный микроРНК-144 был найден связанный с эндогенным MET в противофазе МЕТ, но не анти-IgG иммуноосажденными из клеток (Фигура 3С). Рисунок 3. Экспрессия MET регулируется микроРНК-144. Уровни (А) мРНК предполагаемых микроРНК-144 мишеней были рассмотрены ПЦР в реальном времени в SNU-5 клеток, трансфицированных микроРНК-144 мимике или MIR-NC. Уровни (B) Белок предполагаемых микроРНК-144 мишеней были исследованы вестерн-блоттинга в SNU-5 клеток, трансфицированных микроРНК-144 мимике или MIR-NC. (C)% входные возмещений реакций РНК-Обломок иллюстрирует обогащение MET антителом. РНК-ЧИП анализ на MIR-144 осуществляется на анти-Met антитела из лизатов клеток. РНК-ЧИП с nonrelated IgG служили в качестве контроля. (D) Схематическое изображение предсказанного сайта связывания микроРНК-144 в 3'UTR МЕТ. (E) СНУ-5 клетки были скоротечно котрансфицируют LUC-MET 3'UTR и микроРНК-144 мимической. (F) AGS клетки транзиторно котрансфицируют LUC-Met 3'-UTR и ингибитор микроРНК-144. (G) Mutating сайта связывания микроРНК-144 в MET 3'UTR отменила микроРНК-144-индуцированное подавление активности люциферазы. Активность люциферазы измеряли через 24 ч и нормализованы к котрансфицируемым рениллы. (* Р &л; 0,05; ** р &л; 0,01; *** р &л; 0,001).
Использование биоинформационного на основе анализа, мы определили один сайт связывания микроРНК для MIR-144 в 3 'UTR МЕТ мРНК (рис 3D). Для того, чтобы проверить, если микроРНК-144 непосредственно связывает 3'-UTR мРНК МЕТ, мы провели люциферазы анализы в СНУ-5 клеток. ПЦР-фрагменты, полученные из MET 3'-UTR были вставлены в вектор управления pGL3 на Xba1 месте (LUC-МЕТ 3'UTR). Котрансфекция из LUC-MET 3'UTR и микроРНК-144 в мимике СНУ-5 клеток приводит к снижению сигнала люциферазы (по сравнению с MIR-NC), подтверждая, что связывание MIR-144 к 3'UTR МЕТ имеет прямое тормозящее действие (рис 3E). Обратный эксперимент, осуществляется путем блокирования эндогенной продукции микроРНК-144 с ингибитором микроРНК-144 в AGS клетках, приводит к увеличению сигнала люциферазы (рис 3F). Мутировавший люциферазы на участке микроРНК-144 связывания также был построен (рис 3D). Мутация участка связывания микроРНК отменило микроРНК-144-опосредованное ингибирование активности люциферазы (рис 3G). Эти данные свидетельствуют о том, что 1430-1436 положение MET 3'UTR имеет решающее значение для микроРНК-144-опосредованной регуляции генов.
MET опосредует микроРНК-144-индуцированной устойчивости к миграции
Использование ПЦР в реальном времени, Met уровни экспрессии были определены для шести линий человеческих клеток GC. Как показала практика, клеточные линии с "подавляются" уровни микроРНК-144 имеют более высокие количества MET по сравнению с клеточными линиями с "активируемых" MIR-144 уровней (рис 4а). Используя непараметрические тесты, мы определили значительную обратную корреляцию между мРНК MET и экспрессии микроРНК-144 в образцах GC метастатических (рис 4б). Рисунок 4 MET модуляции учитывает противометастатическое действие микроРНК-144. (A) Вестерн-блот, показывающий экспрессию MET в наборе линий GC клеток человека. (Б) значимая обратная корреляция наблюдается между уровнями экспрессии микроРНК-144 и МЕТ в тканях GC (п = 52). (C) MET и фосфорилируется Akt тормозились форсированной экспрессии микроРНК-144 или миРНК-MET. (D, E) Эффекты MIR-144 или миРНК-MET по миграции и пролиферации определяли в СНУ-5 клеток. (F) MET и фосфорилируется Akt были восстановлены сверхэкспрессией MET в микроРНК-144 СНУ-5 клеток имитирует обработанных. (G, H) Эффекты микроРНК-144 в сочетании с MET-ORF по миграции и пролиферации СНУ-5 клеток. (I) MET и фосфорилируется Akt были повышающей регуляции путем блокировки MIR-144 в AGS клетках. (J, K) Эффекты анти-MIR-144 по миграции и пролиферации клеток AGS.
Функции белка MET в качестве рецептора тирозинкиназы и играет ключевую роль в развитии клеточного роста и миграции путем трансдукции внеклеточных стимулы во внутриклеточные цепей сигнализации. Сернистым компонентом внутриклеточного сигнального механизма является PI3K (фосфоинозитидная 3-киназа) путь [20,21]. Потому что микроРНК-144 ингибирует экспрессию MET, мы предположили, что микроРНК-144 в конечном счете может снизить Akt фосфорилирование и активацию за счет сокращения сигнализации MET. Соответственно, мы исследовали уровни фосфорилирования Akt после того, как микроРНК-144 и избыточная экспрессия наблюдается значительное снижение фосфорилирования Akt (рис 4в).
Мы решили исследовать, были ли микроРНК-144-индуцированное MET деактивация влияние на миграцию опухолевых клеток и пролиферации. Мы трансфицировали MIR-144 и миРНК для MET (миРНК-MET) в СНУ-5 клеток. Миграцию клеток оценивали 16 ч после трансфекции Transwell анализа, в то время как на пролиферацию клеток определяли с помощью CCK-8. Как показано на фиг 4D и Е, трансфекция микроРНК-144 заторможенном миграции и пролиферации клеток по сравнению с контролем. Аналогичным образом, уменьшение экспрессии белка MET с помощью миРНК также снизились миграции опухолевых клеток и пролиферации.
Чтобы определить, является ли MET критическим медиатором эффекта MIR-144 по клеточной миграции и пролиферации, мы построили два вектора экспрессии MET. Один из них содержит только последовательности открытой рамки считывания гена МЕТ (МЕТ-ORF), а другой вектор содержит полную длину нуклеотида гена MET включая 3'UTR последовательность (Met-полный длинный). Затем мы проводили Вестерн-блоттинга через 48 ч после трансфекции MET-ORF /Met-полной длиной в микроРНК-144 имитирует обработанных СНУ-5 клеток (рис 4F). По сравнению с отрицательной контрольной группой (пустой вектор), эктопическая экспрессия МЕТ-ORF значительно увеличил общую экспрессию MET и фосфорилированного Akt. Более того, экспрессия МЕТ-ORF способствовали миграции и пролиферации клеток GC (рис 4G и H). Сверхэкспрессия MET отменена микроРНК-144-индуцированное ингибирование миграции клеток и пролиферации. В отличие от этого, уровень белка MET и фосфорилированного-AKT увеличилось в AGS клетках, обработанных анти-микроРНК-144 (рис 4I), и блокирование MIR-144 также способствует миграции и пролиферации клеток AGS (рис 4J и K). Эти результаты указывают на то, что МЕТ является критическим мишенью для анти-миграционного эффекта микроРНК-144 в клетках человека GC.
Обсуждение
В данном исследовании мы выявили непересекающиеся подписи небольшого количества микроРНК и генов которые аберрантно выражены в перитонеальных метастатических тканях GC, по сравнению с парными первичных тканей. Анализ миРНК и профилей экспрессии генов в микроРНК-генного сети определены микроРНК-144 в качестве регулятора основных онкогенных путей, таких как пролиферации и миграции. GC больных с перитонеального метастазов имели более низкие уровни экспрессии микроРНК-144, чем у больных без метастазов. Этот вывод подразумевает MIR-144 в качестве потенциального супрессоров опухоли в GC. Кроме того, микроРНК-144 связан с механизмами метастаз. Наши результаты соответствуют результатам предыдущих исследований о роли микроРНК-144 в пролиферации раковых заболеваний, миграции и вторжения [22,23]. микроРНК-144 ингибирует клеточную метастазирования рака путем пристреливать A дизинтегрин и ADAMTS5 член металлопротеиназы (ADAM) семейства белков. МикроРНК дисрегуляция связано с повышенной инвазивности опухолей и метастаз, а также снижение прогноза пациента в некоторых эпителиальных раковых заболеваний [24]. Кроме того, мы исследовали роль микроРНК-144 дерегуляции в GC. Мы изучали влияние экспрессии микроРНК-144 в клеточной линии СНУ-5, так как он характеризуется низкой экспрессии микроРНК-144. Эктопическая экспрессия микроРНК-144 в СНУ-5 клеток приводит к глубоким изменениям фенотипа, такие, как снижение миграции. Обратный эксперимент, блокирование экспрессии микроРНК-144, был проведен в клеточной линии AGS, который имеет относительно высокий эндогенный уровень экспрессии микроРНК-144. Подавление экспрессии микроРНК-144 привело к увеличению миграции AGS клеток.
Чтобы исследовать механизм за микроРНК-144-зависимой миграции уменьшилось ГК, мы определили предполагаемые цели для MIR-144, как предсказано микроРНК-генного сети. микроРНК-144 избыточная экспрессия может уменьшить экспрессию MET на обоих мРНК и уровня белка, и, соответственно, люциферазы анализы показали, что микроРНК-144 может напрямую взаимодействовать с MET 3'UTR. Затем мы оценивали уровни экспрессии MET в когорте из 52 пациентов GC и обнаружили, что уровни микроРНК-144 обратно коррелирует с экспрессией MET. По этой причине, мы предположили, что микроРНК-144 ингибирует GC туморогенез путем пристреливать экспрессии MET. МЕТ также был описан в качестве мишени микроРНК-34а /с в других клеточных моделях и, как известно, способствуют моторику и инвазивный потенциал опухолевых клеток. Сверхэкспрессия МЕТ тесно коррелирует с опухолевой инвазии и прогноз пациента в GC [6]. В GC, MET избыточная экспрессия является независимым прогностическим фактором и потенциальной мишенью наркотиков. Кроме того, избыточная экспрессия МЕТ может предсказать, какие пациенты могут получить выгоду от целенаправленной терапии ингибиторами MET [25]. В нашем исследовании экспрессия МЕТ была в значительной степени связано с GC дифференциации, ТНМ и метастазирования [26]. Мы определили, что изменения в клеточной пролиферации и миграции через микроРНК-144 может быть оказано посредством регуляции экспрессии MET. микроРНК-144 репрессии приводит к повышению уровня MET, что может объяснить метастаз фенотип микроРНК-144-истощенных клеток. Интересно, что микроРНК-144 под влиянием фактора роста гепатоцитов (HGF) сигнализацию. HGF, в качестве лиганда MET, может индуцировать активацию MET в эпителиальных клетках. В то время как избыточная экспрессия МЕТ не может полностью восстановить GC онкогенных качества, миграции клеток и пролиферации GC были частично восстановлены после MET избыточной экспрессии. Таким образом, микроРНК-144 может регулировать другие гены в клетках GC. Предыдущие исследования показали, что МЕТ может индуцировать GC туморогенез через активацию пути PI3K. В этом исследовании мы обнаружили, что микроРНК-144 значительно ослабляется Akt фосфорилирования, и что Akt фосфорилирования был полностью восстановлен с избыточной экспрессией MET. Наши результаты показывают, что микроРНК-144 регулирует Akt фосфорилирования путем регулирования MET в GC.
В заключение, наше исследование определило основу снижением уровня MIR-144 видели в GC метастатических тканях. микроРНК-144 был идентифицирован как потенциальный опухолевый супрессор в GC и был связан с механизмами GC метастаз. Кроме того, микроРНК-144 ингибирует GC туморогенез путем охвата MET, а впоследствии, PI3K /Akt путь. Насколько нам известно, это первый раз, когда микроРНК-144 было показано, что в целевой MET GC клеток. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования, исследующие противоопухолевую роль микроРНК-144 может способствовать разработке новых терапевтических стратегий для GC.
Notes
Июнь Лю и Хуэй Сюэ внесли одинаковый вклад в эту работу.
Декларациях
Подтверждения
Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (грант № 81201897). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.
Конкурирующими интересами
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Вклад
Авторского <бр> JL проведены исследования молекулярной биологии. HX подготовил рукопись. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Ассоциация присутствия /отсутствия и включения /выключения моделей гена хеликобактерной oipA с язвенной болез…
• Взаимосвязь между кишечными гормонами и гомеостазом глюкозы после бариатрической хирургии