MicroRNA-144 estää etäpesäkkeiden mahasyövän suuntaamalla MET ilme

MicroRNA-144 estää etäpesäkkeiden mahasyövän suuntaamalla MET ilmaisu
Abstract
Mahasyöpää (GC) on edelleen yksi yleisimmistä pahanlaatuinen syöpä, ja molekyylimekanismin taustalla sen etäpesäkkeiden on edelleen suurelta osin epäselvä. MikroRNA ovat nousseet tärkeiksi säätelijöinä etäpesäke, koska niiden kyky toimia useilla signalointireittien. Tutkimuksessamme havaitsimme, että miR-144 on merkittävästi vaimentua sekä erittäin metastaattinen GC solulinjoissa ja kudoksissa. Tulokset molemmista voitto-of-function ja menettämisestä toiminto kokeet osoittavat, että lisääntynyt miR-144 ilmaisun vähensi merkittävästi GC solujen vaeltamiseen, kun taas vähentynyt miR-144 ilmaisu paranee dramaattisesti GC solujen vaeltamiseen. The Met proto-onkogeenin (MET), joka on usein monistettu ihmisen syövissä ja toimii tärkeänä säätelijänä solujen kasvua ja kasvaimen invaasio, tunnistettiin välittömänä kohteena miR-144. Lisäksi hiljentäminen MET käyttäen pieniä häiritseviä RNA (siRNA) kertasi antimetastaattisia funktio miR-144, kun taas palauttamalla MET ilmaisu vaimennettu toiminta miR-144 GC soluissa. Lisäksi olemme havainneet, että miR-144, kohdistamalla MET, tukahduttaa fosforylaatiota Akt. Lopuksi havaittiin käänteinen korrelaatio ilmentymisen miR-144 ja MET mRNA GC metastaattisen kudoksissa. Yhteenvetona, miR-144 estää GC etenemistä suoraan vähen- tämisessä MET ilmentymisen, joka sitten estää aktivoinnin pro-onkogeenisen Akt-reitillä. Palauttaminen miR-144 ilmentymisen GC soluissa on houkutteleva terapeuttinen lähestymistapa estää etäpesäkkeiden mahasyövän.
Avainsanat
microRNA miR-144 MET Mahasyöpää Etäpesäkkeitä Johdanto
Maailmanlaajuisesti mahasyöpä (GC) on yksi yleisimpiä tyyppejä pahanlaatuinen sairaus. Vuonna 2008 noin 989600 uutta tapausta GC todettiin. Lisäksi GC oli osallisina aiheuttaa 738000 kuolemantapausta, mikä GC neljänneksi yleisin maligniteetti ja johtava syöpäkuolemien syy maailmanlaajuisesti [1]. Koska kasvain edetessä, se kehittää kykyä hyökätä ympäröivien kudosten ja etäispesäkkeitä. Hepatosyytti- kasvutekijän reseptorin, MET, tiedetään edistävän motiliteettia ja invasiivinen kyky kasvainsolujen [2]. MET on jäsenenä reseptorin tyrosiinikinaasin perhe ja sen on osoitettu voimistuvan monissa kasvaimissa [3-5]. On ehdotettu, että MET ekspressiotaso lisääntyy joko geenimonistuksella tai hypoksian kautta HIF1α. Metastasoituneen GC, MET vahvistus ja vahva proteiinin ilmentyminen eivät ole harvinaisia. Nämä tapahtumat näyttävät huomattavasti liittyy epäedullinen kliiniseen tulokseen [6]. Noin 10% valkoinen potilaista satama voitto viiden tai useamman kopion MET. Lisäksi tämä voitto MET kopiomäärä liittyy merkittävästi epäedullinen ennusteeseen [7]. Lisäksi miR-34a /c MikroRNA on osoitettu moduloivat negatiivisesti MET ilmentyminen solulinjoissa, jotka ovat peräisin eturauhassyövän, maksasyövän ja GC [8-10].
MikroRNA (miRNA) ovat ei-koodaavia RNA-molekyylejä, noin 21-23 nukleotidiä, jotka säätelevät geenien ilmentymistä on transkription tai posttranskriptionaalisella tason [11-13]. miRNA ilmaisun profilointi analyysit ovat paljastaneet maailmanlaajuinen downregulation kypsä miRNA tasoja ihmisen kasvaimissa verrattuna normaaleihin kudoksiin [14]. Lisäksi miRNA voi toimia joko tuumorisuppressorin tai onkogeenisten rooli, toiminnosta riippuen niiden kohde. Esimerkiksi miR-133b merkittävästi säädellä vähentävästi GC kudoksissa ja aiheutti sen tuumorisuppressoriproteiinia roolia GC soluissa [15]. Expression of miR-337-3p merkittävästi vaimentua imusolmuke metastaattisen kudoksia GC potilaiden, ja induktio miR-337-3p ilme teki vähentää mahalaukun syöpäsoluinvaasiota kapasiteetti [16]. miR-25 edistää GC etenemisen suoraan vähen- tämisessä TOB1 ilmaisu; Näin ollen, lisääntynyt ilmentyminen miR-25 aiheuttaa mahdollisen noninvasiivista biomarkkeri ennustetta GC potilaista [17]. Lisäksi miR-7 on merkittävästi vaimentua sekä erittäin metastaattinen GC solulinjoilla ja metastaattisen kudoksissa. Yliekspressio miR-7 inhiboi huomattavasti GC etäpesäke kohdentamalla ilmaus insuliinin kaltaisen kasvutekijä-1-reseptorin (IGF1 R) onkogeeni [18]. GC solulinjoissa, uudelleen miR-144 ilmentyminen johtaa tukahduttaminen ZFX, mikä lisää kohtalaisesti syöpäsolun alttiutta 5-fluorourasiilin kemoterapiaa. 93 primaarisen GC, vähentynyt miR-144-ekspressio liittyy huono prognoosi [19]. Nämä esimerkit ovat korostaneet avainroolia miRNA GC malignance ja syövän etenemistä.
Tässä tutkimuksessa olemme tunnettu tavoitteet ja määritteli vaikutusmekanismi miR-144 GC. Indusoimalla ektooppinen ilmentyminen miR-144, huomasimme MET on uusi kohde miR-144 sääntelyä. Tämä havainto vahvistettiin molempien mRNA ja proteiini tasoilla, ja reportterigeeni Lusiferaasimäärityksiä todennettu suoraa sitoutumista miR-144 sääntely sitoutumiskohtaan 3'UTR MET. Lisäksi olemme havainneet, että MET ilmaisu kääntäen korreloi miR-144 tasot pieni mutta hyvin dokumentoitu GC kohortti. Oletamme, että miR-144 estää GC etäpesäke, ja että osa tästä esto välittyy kohdistamalla MET ilme.
Materiaalit ja menetelmät
ihmisen kudosnäytteiden ja solulinjoissa
GC kerättiin potilailta, joille tehtiin leikkaus Fudanin yliopiston Shanghai Cancer Center välillä 2012 ja 2013. protokolla hyväksyttiin Clinical Research toimikunta Fudanin yliopiston, ja tutkimus toteutettiin säännösten mukaisesti Helsingin julistuksen 1975. Kaikki näytteet, jotka on saatu tietoisen suostumuksen potilaista. Ihmisen GC solulinja AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL- 5974 ™) , NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), ja KATO III (ATCC® HTB-103 ™) pidettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. Kaikkia solulinjoja ylläpidettiin väliaineessa, joka sisälsi penisilliiniä (100 IU /ml) ja streptomysiiniä (100 mg /ml) 37 ° C: ssa 5% CO2. Mirna matkii ja inhibiittorit ostettiin Ambion (Austin, TX, USA).
RNA ja reaaliaikaisen PCR
Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Sillä miRNA-analyysi, poly (A) hännät lisättiin kokonais-RNA käyttämällä poly (A) polymeraasia (Ambion, Carlsbad, CA) ennen käänteistranskriptio. MiRcute miRNA qPCR havaitseminen pakki (TIANGEN, Peking, Kiina) käytettiin kvantitoimiseksi ekspressiotasoja miR-144 mukaisesti tarjotaan protokollaa. Seuraavat PCR-olosuhteita käytettiin: 95 ° C 30 s, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 31 s. Koh- (MET /miR-144), normalisoitu endogeenisen siivous GAPDH /U6snRNA ja suhteessa vertailunäytteeseen, saadaan seuraavasta yhtälöstä: määrä target = 2- △△ CT.
Microarray hybridisaatio
Lyhyesti, RNA-näytteitä käytettiin syntetisoimaan kaksijuosteinen komplementaarinen DNA (cDNA), ja kaksijuosteinen cDNA leimattiin ja hybridisoitiin Microarray (Arraystar, Rockville, MD). Hybridisaation jälkeen ja pesun käsitellyt kalvot skannattiin kanssa Axon GenePix 4000B mikrosiru skanneri (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). P-arvo laskettiin käyttäen parillista t-testiä. Asetetun kynnysarvon ylä- ja alas geenien oli kertainen muutos > 2,0 ja p-arvo < 0,05. Hierarkkinen ryhmittely suoritettiin perustuen differentiaalisesti ilmentyvien geenien ja miRNA käyttäen Cluster Puunäkymäikkuna ohjelmiston Stanfordin yliopistosta (Palo Alto, CA).
MiRNA-geenin verkon
Me on rakennettu verkon adjacency kahden geenien, i ja j, määritellään teho Pearsonin korrelaatio vastaavan geenin ilmentymisen profiilit, xi ja xj. Vierusmatriisi, M (i, j), tehtiin näkyväksi kuten kuvaaja, ja topologinen ominaisuuksia tämän kuvaajan tutkittiin. Jotta visuaalinen esitys, vain vahvimmat korrelaatiot (> 0,98) tehtiin näissä rappaukset. In miRNA-geenin verkot, kunkin geenin vastaa solmun. Kaksi geenit välillä on kaari, joka osoittaa voimakas korrelaatio. Sisällä verkon analyysin, tutkinto on yksinkertaisin, tärkein mittari keskeisyyden geenin verkon sisällä ja määrittää suhteellinen merkitys. Tutkinto määritellään määrä liittyy suoraan naapureita.
Ennustaminen miR-144 sitoutumiskohta
Otaksutuista miR-144 sitoutumiskohtiin in MET mRNA 3'alueella ennustettiin Target Scan ohjelma (http: //www.targetscan.org). Sijoitus 1430-1436 MET 3 'UTR on säilynyt sitoutumiskohta miR-144 kohdistuksen.
Plasmidi transfektio
ORF-sekvenssit MET monistettiin genomisesta DNA: sta eristettiin SNU-5-solulinja ja sitten subkloonattiin osaksi Plenti vektoriin. Plasmidi transfektoitiin SNU-5-soluissa käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 24 tunnin kuluttua solut käytettiin pelastus- kokeessa.
Oligonukleotidi transfektio
MiR-144 jäljittelee, miR-144-estäjän (anti-miR-144), ja MET siRNA (siRNA-MET) syntetisoitiin Genepharma , Shanghai, Kiina. Oligonukleotidi transfektio suoritettiin Lipofectamine 2000 reagenssit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Lopullinen pitoisuus miR-144 jäljittelee, anti-miR-144 tai siRNA-MET transfektiossa järjestelmä oli 100 nM. Transfektiotehokkuuden yhtenäisen ja ko-transfektoitiin tutkimuksissa määritettiin fluoresenssimikroskooppi.
Immunoblottauksella
Yhtä suuret määrät solulysaateista erotettiin 7% SDS /PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvoja. Kaivoa inkuboitiin kanin polyklonaalisella anti-MET-vasta-ainetta (1: 500, Abcam, ab47431), vuohen polyklonaalisen anti-ADAM12-vasta-ainetta (0,3 ug /ml, Abcam, ab28747), ja kaniinin polyklonaalista anti-versikaani-vasta-ainetta (1 ug /ml, Abcam, ab19345). IRdye-leimatut sekundääriset vasta-aineet käytettiin kvantitointiin immunoblottaus-signaalin, ja signaalit analysoitiin käyttämällä Odyssey skanneri (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
RNA-ChIP määrityksessä
RNA-proteiini-vuorovaikutusten kiinnitetään formaldehydillä ja chromatin leikkaus yhdistetään DNaasikäsittely antamaan RNA /proteiini-komplekseja, jotka voidaan immunosaostettiin vasta MET proteiineja. Cross-linkit, muuttuu RNA otetaan talteen ja käsiteltiin uudelleen DNaasi varmistamiseksi, ettei DNA: ta. RNA saostetaan immuuni kompleksi sitten analysoida real-time PCR. Tässä RNA-chip määritys, seuraavaa kaavaa voidaan käyttää:% tulo (talteenotto) = AE (Ct tulo-Ct näyte) * Fd * 100%. Tässä, AE on vahvistushyötysuhde (10 (-1 /kulmakerroin)), ja Fd on laimennuskerroin lähtö-RNA: tasapainottaa ero määriä RNA-ChIP näytteen RNA-käyttää real-time PCR.
Lusiferaasianalyysi
koko MET 3'-UTR monistettiin PCR: llä käyttäen SNU-5 cDNA: ta templaattina ja kloonattiin pGL3 kontrollivektorilla. Käytimme Pikavaihto mutageneesi muuntua MIR-144 otaksuttu sitoutumiskohta (Stratagene, Santa Clara, CA, USA). SNU-5-solut ja AGS-solut transfektoitiin miR-144 jäljittelee /estäjien ja pGL3 lusiferaasireportteri- konstrukteja kätkeminen MET 3'UTR. 24 tunnin kuluttua, toiminta tulikärpäsen lusiferaasi ja Renilla lusiferaasin solulysaateissa mitattiin Dual-lusiferaasimäärityssysteamiä (Promega, Madison, WI, USA).
Migration määrityksissä
Sillä siirtokuoppaan muuttoliike määrityksissä, 1 x 105 solua maljattiin ylä- kammioon, joka sisältää ei-päällystetty kalvo. Solut maljattiin seerumittomassa väliaineessa, ja jota oli täydennetty 10% (v /v) seerumia käytettiin kemoattraktantti alemmassa kammiossa. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kudosviljelyinkubaattorissa, jossa oli 5% (v /v) CO2: ta. 16 tunnin kuluttua, ei-siirretyn solut poistettiin ylemmältä puolin transwell kalvosuodattimella insertit. Siirrettyjä soluja alasivujen inserttien värjättiin Coomassie brilliant blue, ja solut laskettiin.
Soluproliferaatiomääritys
Transfektoidut solut siirrostettiin 96-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 104 solua /hyvin. Soluproliferaation määritys suoritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ennen kuin lisättiin CCK-8, solut pestiin lämpimällä elatusaineet pyörittämällä levyä 500 rpm 3 m ja sen jälkeen heitetään supernatantti.
Alukkeet
Seuraavia alukkeita käytettiin reaaliaikaista PCR: miR-144: 5-TACAG TATAG ATGAT GTACT-3; U6snRNA: 5-CGCAA GGAUG ACACG CAAAU UCGUG AAGCG UUCCA UAUUU UU-3; SKIL forward-aluke: 5-GTTAA GCGAA CCTGT ACTTC TGT-3, käänteinen aluke: 5- GTAGG CGACA TGCTT TCTTG G-3; MET eteenpäin aluke: 5-GTCGG AGTAG AGCGT CGAGA-3, käänteinen aluke: 5-CAGCG CGATC AGGTA GAGC-3; TOP2A forward-aluke: 5-ACCAT TGCAG CCTGT AAATG A-3, reverse-aluke: 5-GGGCG GAGCA AAATA TGTTC C-3; ADAM12 forward-aluke: 5-TCAAC CTG- TACCC GATTC C-3, reverse-aluke: 5-GCTCT GTCTG CCGAT GGAG-3; VCAN forward-aluke: 5-GTAAC CCATG CGCTA CATAA AGT-3, kääntää aluke: 5-GGCAA AGTAG GCATC GTTGA AA-3. Seuraavia alukkeita käytettiin koko MET 3UTR sovellus: MET 3'UTR forward-aluke: 5-TCACT GCCTG ACCTT TA-3, MET 3'UTR reverse-aluke: 5-ATCAC TTACT CCCAC AAT-3. SiRNA nukleotidin markkinatalouskohtelupyyntö käytettiin seuraavasti: siRNA-MET eteenpäin: 5-GUGCC ACUAA CUACA UUUAU U-3, siRNA-MET reverse: 5-UAAAU GUAGU UAGUG GCACU U-3.
Tilastollinen analyysi
Tulokset esitetään keskiarvoina ± SEM, ja tiedot analysoitiin Studentin t-testiä. Arvoa p < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.
Tulokset
MicroRNA ilmentymisen profiili mahasyövän
vertailu vatsakalvon metastaattisen kudosten kanssa pariksi ensisijainen pesäkkeitä näytteet GC käyttäen hierarkkinen ryhmittely analyysi paljasti, systemaattista vaihtelua ilmentymisen miRNA ja geenien (kuvio 1A ja B). Tuloksemme viittaavat siihen, että joukko miRNA ja geenien ilmennetään usein poikkeavasti vatsakalvon metastaattisen kudoksissa GC. Lisäksi olemme myös havainneet, että jotkut aikaisemmin hyvin osoittautui molekyylejä, kuten miR-7 [18], miR-25 [17], TOB1 ja IGF1 R, ei voitu tunnistaa mikrosiruja. Ajattelimme nämä ero voi indusoida monimuotoisuus kliiniset näytteet tulivat eri alueilla. Kuva 1 Core miRNA-geenin verkkoon, mukaan lukien 8 keskeiset miRNA ja tavoitteensa. Hierarkkinen klusterointi analyysi 27 miRNA (A) ja 32 geenit (B), jotka ilmentyvät eri välillä metastaattinen kudosten vatsakalvon ja pariksi ensisijainen näytteet GC (yli 2,0-kertainen; p < 0,05). Expression arvot esitetään sävyjä punainen ja vihreä, mikä osoittaa ilmaisun ylä- ja alapuolella mediaani ekspressioarvo kaikissa näytteissä. (C) Mirna-geeni verkko näyttää välisiä suhteita 8 keskeisten miRNA ja kasvaimeen liittyviä geenejä ne ennustetaan säädellä. Värit osoittavat selityksin ekspressiotasot miRNA ja geenit.
MiRNA-geeni-verkon koottiin, jonka tavoitteena on tunnistaa keskeiset miRNA jotka säätelevät kasvaimeen liittyvän geenin ilmentymistä etenemisen aikana tuumorimetastaasin. Koska -parin moduulit todennäköisesti vastaavat biologisiin polkuja, keskityimme -parin moduuleja, joita liittyy suuri määrä proteiinia koodaavan geenien. Lisäksi NCBI RefSeq yksityiskohtaisesti toimintojen monien geenien, joka auttoi myös tunnistamista GC liittyvien geenien. Käyttämällä tätä menetelmää, olemme tunnettu rooli miR-144 vatsakalvon metastaasipesäkkeiden GC. Syövän koekspressointi verkkoon, miR-144 on kytketty 6 proteiinia koodaavan geenejä, jotka osallistuvat kasvaimen kasvun ja etäpesäkkeiden (kuvio 1C).
Regulatory rooli miR-144 mahalaukun syövän etäpesäkkeiden
tutkimiseksi asennuspalveli- 144 toimintoa, ensin tutkittiin miR-144 tasot paneelin 6 ihmisen GC solulinjoissa. Kuten kuviossa 2A on esitetty, valitsimme AGS, tunnettu siitä, kanssa ilmen- tymisen lisääntymisen miR-144, ja SNU-5, tunnettu siitä, jossa vaimentua miR-144, jatkotutkimuksiin. AGS solulinja oli peräisin mahakasvaimen fragmentteja, jotka resekoitiin potilaalta, joka oli saanut ennen hoitoa, kun taas SNU-5 oli peräisin askites potilaan huonosti eriytetty syöpä vatsaan. Kuvio 2 MiR-144 estää migraation GC soluja. (A) Expression tasot miR-144 tarkastettiin paneelin 6 ihmisen GC solulinjoissa käyttäen reaaliaikaista PCR-menetelmällä. (B) Migration of SNU-5-solut käsiteltiin miR-144 matkii tarkistettiin käyttäen no-matrigeeliä käsitelty transwell kammioon. (C) Migration AGS solujen käsitelty miR-144 estäjä tarkistettiin käyttäen no-matrigeeliä käsitelty transwell kammioon. (*** P < 0,001).
Tutkimuksessamme havaitsimme tiiviin miR-144 tappiota ja etäpesäkkeitä GC (kuvio 1A ja C). Vastaavasti aiemmin tutkimuksissa on miR-144-pohjainen esto kasvainsolun muuttoliikkeen ja hyökkäyksen epiteelin okasolusyöpä. Oletimme, että palauttaminen miR-144 ilmentyminen estäisi syöpäsolun muuttoliikettä. Sopivasti käyttöönotto miR-144 ilmaisu esti soluvaelluksen SNU-5 (kuvio 2B). Verrattuna SNU-5, AGS solut on suhteellisen korkeampi endogeeninen miR-144 ilmentymistä. Ei ole yllättävää, esto miR-144 lisääntynyt AGS solujen vaeltamiseen (kuvio 2C). Itse asiassa olemme myös suorittaneet invaasiomääritys käyttäen matrigeeliä käsitellyn transwell, ja ei ole mitään eroa invasiivisia kyky SNU-5 /AGS soluissa, sen jälkeen käsiteltiin miR-144 /anti-miR-144 (tietoja ei esitetä). Nämä tulokset kuvitettu että miR-144 on tärkeä rooli muuttoliikettä mutta eivät hyökkäystä GC soluja.
MiR-144 vaikuttaa MET ilmaisu
kautta kohdunulkoinen ilmaus miR-144 SNU-5-solut, päätimme ADAM12 , VCAN ja MET ovat otaksuttu miR-144 tavoitteita. Kuten kuviossa 3A on esitetty, miR-144 ilmentymisen dramaattisesti vaikuttaa mRNA-tasot ADAM12, VCAN ja MET. ADAM12, VCAN ja MET proteiinin ekspressiotasoja havaittiin myös läntisen blot syöpäsoluissa transfektoitu miR-144 jäljittelee. Kuten kuviossa 3B on esitetty, vain MET-proteiinin tasot vaimentua by miR-144. Tämä osoittaa, että miR-144 vaikuttaa MET ilmaisu transkriptiotasolla ehkä pilkkomalla tai epävakauteen mRNA rakenteen. Kuitenkin huomasimme ADAM12 ja VCAN proteiinin tasot eivät laskivat eksogeeninen käyttöön miR-144. Luulimme, että mRNA ja proteiini tasoja ei voida suoraan korreloi koska eri puoliintumisaika. Olemme myös ajatus he osoittivat, että voi johtua läsnäolosta miR-144, joka oli jatkuvasti tukahduttaa käännös yhdessä tapauksessa, mutta ei muita. MET: miR-144 vuorovaikutus osoitettiin myös elävissä soluissa RNA-Chip määrityksessä. Itse asiassa, endogeeninen miR-144 todettiin liittyvän endogeenisen MET anti-MET mutta ei anti-IgG immunopresipitaattien soluista (kuvio 3C). Kuvio 3 ilmentyminen MET säädeltiin miR-144. (A) mRNA: n tasot oletetun miR-144 tavoitteet tutkittiin reaaliaikaisella PCR: SNU-5-soluja, jotka on transfektoitu miR-144 jäljittelee tai miR-NC. (B) Proteiini tasojen otaksuttu miR-144 tavoitteita tutkittiin western blotting in SNU-5-solut transfektoitu miR-144 jäljittelee tai miR-NC. (C)% tulo saannot RNA-chip reaktioita kuvaa väkevöimisen MET vasta-aineella. RNA-chip määritys miR-144 suoritettiin anti-MET-vasta lysaateista soluista. RNA-chip kanssa nonrelated IgG toimivat vertailuryhmänä. (D) Kaavamainen kuva ennustetun miR-144 sitoutumiskohdan 3'UTR MET. (E) SNU-5-soluissa oli ohimenevästi kotransfektoitiin LUC-MET 3'UTR ja miR-144 matkivat. (F) AGS-soluja väliaikaisesti kotransfektoitiin LUC-MET 3'UTR ja miR-144-estäjän. (G) muuntuvat ja miR-144 toutumiskohdasta MET 3'UTR poisti miR-144 aiheuttama lusiferaasiaktiivisuus tukahduttaminen. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin 24 tunnin kuluttua ja normalisoitiin kotransfektoitiin Renillaa. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Käyttäminen bioinformatiikka-analyysi, tunnistimme yhden miRNA sitoutumiskohdan miR-144 3 'UTR MET mRNA: ta (kuvio 3D). Sen testaamiseksi, miR-144 suoraan sitoo 3'-UTR MET mRNA, suoritimme lusiferaasireportterista määrityksissä SNU-5-soluissa. PCR-peräinen fragmentit MET 3'UTR insertoitiin pGL3 ohjaus vektorin Xba1 päällä (LUC-MET 3'UTR). Kotransfektoimalla LUC-MET 3'UTR ja miR-144 jäljittelee in SNU-5-soluissa johti vähentynyt lusiferaasisignaaliin (verrattuna miR-NC), joka vahvistaa, että sitoutuminen miR-144 3'UTR MET on suora estävä vaikutus (kuvio 3E). Päinvastainen kokeilu, saavutetaan estämällä endogeenisen miR-144 tuotannon kanssa miR-144 estäjää AGS soluissa, lisännyt lusiferaasisignaaliin (kuvio 3F). Mutatoitu lusiferaasireportterista klo miR-144 sitoutumiskohta rakennettiin myös (kuvio 3D). Mutaatio miRNA sitoutumiskohtaan lakkautetaan miR-144 estoa lusiferaasin aktiivisuuden (kuvio 3G). Nämä tiedot viittaavat siihen, että 1430-1436 asema MET 3'UTR on kriittinen miR-144 välittämä geenin sääntelyä.
MET välittää miR-144 aiheuttama vaelluksen kestävyys
käyttäen reaaliaikaista PCR, MET ekspressiotasoja määritettiin kuuden ihmisen GC solulinjoissa. Kuten on esitetty, solulinjoissa "vaimentua" miR-144 tasot ovat suurempia määriä MET verrattuna solulinjoissa "voimistunut" miR-144 tasoa (kuvio 4A). Käyttämällä nonparametric testit, päätimme merkittävä käänteinen korrelaatio MET mRNA ja miR-144 ilmentymisen GC metastaattisen näytteistä (kuvio 4B). Kuva 4 MET modulaatio selittää haarapesäkkeiden vaikutuksen miR-144. (A) Western blot, joka osoittaa MET ilmentymisen joukko ihmisen GC solulinjoissa. (B) merkittävä käänteinen korrelaatio havaitaan välillä miR-144 ja MET ekspressiotasot GC kudoksissa (n = 52). (C) Markkinatalouskohtelun ja fosforyloitu Akt inhiboi pakotetun ilmaus miR-144 tai siRNA-MET. (D, E) vaikutukset miR-144 tai siRNA-MET maahanmuutto- ja leviämisen määritettiin SNU-5-soluissa. (F) MET ja fosforyloitu Akt oli palauttaa yli-ilmentyminen MET in miR-144 jäljittelee saaneilla SNU-5-soluissa. (G, H) vaikutukset miR-144 yhdistettynä MET-ORF maahanmuutto- ja leviämisen SNU-5-soluissa. (I) Markkinatalouskohtelun ja fosforyloitu Akt oli säädelty estämällä Mir-144 AGS soluissa. (J, K) vaikutukset anti-miR-144 maahanmuutto- ja leviämisen AGS soluja.
MET-proteiini toimii reseptorina tyrosiinikinaasin ja on keskeinen rooli edistettäessä solujen kasvun ja muuttoliikkeen transdusoimalla solunulkoinen ärsykkeitä solunsisäisen signaloinnin piirejä. Merkittävä osa solunsisäisen signaloinnin koneisto on PI3K (fosfoinositidi 3-kinaasi) reitin [20,21]. Koska miR-144 inhiboi MET ilmaisua, me arveltu, että miR-144 voi lopulta vähentää Akt-fosforylaation ja aktivaation kautta laski MET signalointi. Niinpä tutkimme Akt-fosforylaation tasoja jälkeen miR-144 yli-ilmentymisen ja havaittiin merkittävä lasku Akt-fosforylaation (kuvio 4C).
Päätimme tutkia miR-144 aiheuttama MET downregulation ollut vaikutusta kasvaimen solujen vaeltamiseen ja lisääntymistä. Transfektoimme miR-144 ja siRNA varten MET (siRNA-MET) in SNU-5-soluissa. Solumigraation arvioitiin 16 tuntia transfektion jälkeen, jonka siirtokuoppaan määrityksessä, kun taas solujen lisääntymistä määritettiin läpi CCK-8. Kuten kuvioissa 4D ja E, transfektio miR-144 esti solujen vaeltamiseen ja proliferaatiota kontrolliin verrattuna. Vastaavasti vähentämällä MET proteiinin ilmentymisen avulla siRNA laski myös kasvaimen solujen vaeltamiseen ja lisääntymistä.
Voit selvittää MET on kriittinen välittäjä miR-144: n vaikutusta solujen muuttoliikettä ja leviäminen, rakensimme kaksi MET ilmentämisvektorin. Joista toinen sisältää vain avoimen lukukehyksen sekvenssi MET geenin (MET-ORF), ja toinen vektori sisältää täyspitkä nukleotidin MET-geenin lukien 3'UTR sekvenssi (MET-täynnä pitkä). Suoritimme sitten western blot-analyysi 48 h transfektion jälkeen MET-ORF /MET-täysi pitkälle miR-144 jäljittelee saaneilla SNU-5-soluissa (kuvio 4F). Verrattuna negatiiviseen kontrolliryhmään (tyhjä vektori), ektooppinen ilmentyminen MET-ORF huomattavasti koko ilmaus MET ja fosforyloidun Akt. Lisäksi ilmaus MET-ORF edistänyt muuttoliike ja lisääntymistä GC-solujen (kuvio 4G ja H). Yliekspressio MET lakkautetaan miR-144 inhiboivan vaikutuksen solujen vaeltamiseen ja lisääntymistä. Sen sijaan proteiinia taso MET ja fosforyloidun-AKT kasvoi AGS soluissa, joita käsiteltiin anti-miR-144 (kuvio 4I), ja tukkeutuminen miR-144 edistettiin myös migraation ja leviämisen AGS soluja (kuvio 4J ja K). Nämä tulokset osoittavat, että MET on kriittinen tavoite kulkeutumista estävällä vaikutus miR-144 ihmisen GC soluissa.
Keskustelu
Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet ei-päällekkäisiä allekirjoitukset pieni määrä miRNA ja geenien jotka poikkeavasti ilmaistaan ​​vatsakalvon metastaattisen kudoksissa GC, verrattuna pariksi ensisijainen kudoksiin. Analyysi miRNA ja geeniekspressioprofiilien että miRNA-geeni-verkko tunnistaa miR-144 säätelijänä suuren onkogeenisten reittejä, kuten proliferaatio ja migraatio. GC potilaat vatsakalvon etäpesäkkeitä oli alhaisemmat miR-144 ekspressiotasot kuin potilailla, joilla ei etäpesäkkeitä. Tämä havainto syytöksiä miR-144 mahdollisena tuumorisuppressori GC. Lisäksi miR-144 liittyy mekanismeihin etäpesäke. Tuloksemme vastaavat tulokset aikaisempien tutkimusten roolista miR-144 syövän solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion [22,23]. miR-144 estää syöpäsolumetastaasi kohdistamalla A disintegriini- ja metalloproteinaasi (ADAM) proteiini perheenjäsen ADAMTS5. MicroRNA säätelyhäiriötä liittyy lisääntynyt kasvaimen invasiivisuus ja etäpesäkkeiden, sekä vähennetään potilaan ennustetta tietyillä epiteelisyövissä [24]. Tutkimme lisäksi roolia miR-144 sääntelyn purkamista GC. Tutkimme vaikutus miR-144 ilmentymisen SNU-5 solulinja, koska se on tyypillistä alhainen ilmentyminen miR-144. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-144 SNU-5-soluissa aiheuttaa syvällisiä fenotyyppiset muutokset, kuten vähentynyt muuttoliike. Päinvastainen kokeilu, esto miR-144 ilmaisua, suoritettiin AGS solulinjassa, jolla on suhteellisen korkea endogeeninen taso miR-144 ilme. Esto miR-144 ilmaus lisännyt AGS solujen vaeltamiseen.
Tutkimiseksi mekanismia taustalla miR-144-riippuvainen vähentynyt migraatio GC tunnistimme oletetun tavoitteet miR-144 ennustuksen mukaisesti miRNA-geeni-verkon. miR-144 yliekspressio voi vähentää MET ilmaisun sekä mRNA ja proteiini tasoilla, ja vastaavasti, lusiferaasireportterista määritykset paljastivat, että miR-144 voi suoraan vuorovaikutuksessa MET 3'UTR. Sitten arvioitiin MET ekspressiotasot kohortin 52 GC potilaiden ja totesi, että miR-144 tasot ovat korreloi käänteisesti MET ilme. Tästä syystä me arveltu, että miR-144 estää GC tumorigeneesin kohdistamalla MET ilme. MET on myös kuvattu miR-34a /c tavoite solun muiden mallien ja tiedetään edistävän motiliteettia ja invasiivinen kyky syöpäsoluja. Yliekspressio MET korreloi kasvaimen invaasio ja potilaan ennusteeseen GC [6]. GC, MET yliekspressio on riippumaton ennustetekijä ja mahdollisia lääkkeiden kohde. Lisäksi MET yliekspressio voi ennustaa, mitkä potilaat voivat hyötyä kohdennetun hoidon MET estäjien [25]. Tutkimuksessamme MET ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä GC erilaistumiseen, TNM ja etäpesäkkeiden [26]. Olemme todenneet, että muutoksia solujen lisääntymistä ja maahanmuuton miR-144 voisivat vaikuttaa säätelemällä MET ilmaisua. miR-144 tukahduttaminen johtaa kohonneeseen MET, mikä voi selittää etäpesäke fenotyyppi miR-144-köyhdytettyä soluissa. Mielenkiintoista, miR-144 vaikuttavat hepatosyyttikasvutekijän (HGF) signalointia. HGF, sillä ligandi MET, voivat aktivoituvat MET epiteelisoluissa. Vaikka MET yliekspressio ei täysin palauttaa GC tuumorigeenisia ominaisuuksia, GC solujen vaeltamiseen ja lisääntymistä on osittain palautunut MET yli-ilmentymisen. Siksi miR-144 voidaan säädellä muita geenejä GC soluissa. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että pyynnön voi aiheuttaa GC kasvaimen kehittymisen kautta aktivoitumisen PI3K reitin. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-144 merkittävästi heikennetty Akt fosforylaation, ja että Akt fosforylaatio oli täysin kunnostettu yliekspressioon MET. Tulosten perusteella näyttää, että miR-144 säätelee Akt-fosforylaation kautta MET sääntelyä GC.
Johtopäätöksenä tutkimuksessamme tunnistettu perustan alentunut taso miR-144 nähdään GC metastaattisen kudoksissa. miR-144 identifioitiin mahdollisia tuumorisuppressori GC ja on liitetty mekanismien GC etäpesäke. Lisäksi miR-144 estää GC tumorigeneesin kohdistamalla MET, ja sen jälkeen, PI3K /Akt-reitin. Tietääksemme tämä on ensimmäinen kerta miR-144 on osoitettu kohdistaa MET GC soluissa. Siksi lisätutkimukset tutkia syövän vastaisen roolia miR-144 voi myötävaikuttaa uusien terapeuttisten strategioiden GC.
Huomautuksia
kesäkuu Liu ja Hui Xue vaikuttanut yhtä tähän työhön.
Julistukset
Kiitokset
tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (Grant nro 81201897). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut
Kirjoittajat ilmoittavat, että heillä ei ole kilpailevia intressejä.
Tekijät osuudet
JL suorittaa molekyylibiologian tutkimukset. HX laadittu käsikirjoitus. JZ suorittanut bioinformatiikan analyysi. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Association of läsnäolo /poissaolo ja on /off malleja Helicobacter pylori oipA geenin ulkustauti ja mahasyövän riskit: meta-analysis
• Suhde gut hormoneja ja glukoosihomeostaasiin jälkeen bariatric surgery