MicroRNA-144 hemmt die Metastasierung von Magenkrebs durch gezielte MET-Expression

MicroRNA-144 hemmt die Metastasierung von Magenkrebs durch MET-Expression
Zusammenfassung
Magenkrebs Targeting (GC) bleibt eine der häufigsten Arten von bösartigen Krebs, und der molekulare Mechanismus seiner Metastasierung zugrunde liegt, ist noch weitgehend unklar. MicroRNAs wurden als wichtige Regulatoren der Metastase aufgrund ihrer Fähigkeit zu wirken auf mehreren Signalwegen entstanden. In unserer Studie haben wir festgestellt, dass miR-144 signifikant in beiden hochmetastatisch GC-Zelllinien und Geweben nach unten reguliert wird. Ergebnisse aus beiden Gain-of-function und loss-of-function Experimente zeigen, dass eine erhöhte miR-144 Expression signifikant GC Zellmigration reduziert, während miR-144 Expression dramatisch verbessert GC Zellmigration verringert. Das traf Proto-Onkogen (MET), die häufig in menschlichen Krebserkrankungen und fungiert als wichtiger Regulator des Zellwachstums und der Tumorinvasion verstärkt wird, wurde als direktes Ziel von miR-144 identifiziert. Darüber hinaus Silencing MET small interfering RNA (siRNA) rekapituliert die anti-metastatischen Funktion von miR-144, während die Wiederherstellung MET-Expression die Funktion von miR-144 in GC-Zellen abgeschwächt. Des Weiteren fanden wir, dass miR-144, von MET Targeting, die Phosphorylierung von Akt unterdrückt. Schließlich beobachteten wir eine inverse Korrelation zwischen der Expression von miR-144 und MET mRNA in GC metastatischem Gewebe. Zusammenfassend unterdrückt GC Progression miR-144 durch direktes Herunterregulieren MET-Expression, die anschließend die Aktivierung des pro-onkogenen Akt Signalweg verhindert. Die Wiedereinführung von miR-144 Expression in GC-Zellen eine attraktive Therapieansatz stellt die Metastasierung von Magenkrebs zu blockieren.
Schlüsselwörter microRNA miR-144 MET Magenkrebs Metastasen Einführung
Weltweit Magenkrebs (GC) ist ein der am weitesten verbreiteten Arten von bösartigen Erkrankungen. Im Jahr 2008 wurden rund 989.600 neue Fälle von GC diagnostiziert. Des Weiteren wurde GC als Ursache für 738.000 Todesfälle verwickelt, GC macht die vierthäufigste Krebserkrankung und die häufigste Ursache für Krebstod weltweit [1]. Da der Tumor fortschreitet, entwickelt es die Fähigkeit, das umgebende Gewebe eindringen und metastasieren. Der Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor, MET, ist bekannt, die Motilität und die invasive Fähigkeit von Tumorzellen [2] zu fördern. MET ist ein Mitglied der Familie-Rezeptor-Tyrosinkinase und ist in vielen Tumoren [3-5] aufreguliert gezeigt werden. Es wird vorgeschlagen, dass MET Expressionsniveau von jedem Gen-Amplifikation oder Hypoxie über HIF1α erhöht wird. Bei Patienten mit metastasierendem GC, MET Verstärkung und starke Proteinexpression sind nicht selten. Diese Ereignisse scheinen signifikant mit ungünstigen klinischen Ergebnissen in Verbindung gebracht werden [6]. Etwa 10% der weißen Patienten beherbergen einen Gewinn von fünf oder mehr Kopien von MET. Darüber hinaus wird dieser Gewinn an MET Kopienzahl signifikant mit ungünstigen Prognose assoziiert [7]. Darüber hinaus haben die miR-34a /c microRNAs wurde von Prostatakrebs, Leberzellkarzinom und GC [8-10] abgeleitet gezeigt negativ MET-Expression in Zelllinien zu modulieren.
MicroRNAs (miRNAs) sind nicht-kodierende RNA-Moleküle, etwa 21-23 Nukleotide in der Länge, der die Genexpression auf transkriptioneller oder post-transkriptioneller Ebene regulieren [11-13]. miRNA-Expressionsanalysen Profilierungs haben eine globale Herunterregulieren der reifen miRNA Ebenen in menschlichen Tumoren im Vergleich zu normalen Geweben ergab, [14]. Weiterhin kann miRNAs in Funktion entweder Tumorsuppressor oder onkogene Rolle in Abhängigkeit von der Abhängigkeit von ihrer Ziel. Zum Beispiel wurde miR-133b signifikant in GC Gewebe herunterreguliert und ausgeübten Rolle seiner Tumor-Suppressor in GC-Zellen [15]. Die Expression von miR-337-3p wurde in Lymphknoten metastatischen Geweben von GC-Patienten, und die Induktion von miR-337-3p Expression signifikant nach unten reguliert hat Magenkrebs Zellinvasion Kapazität [16] reduzieren. miR-25 fördert Progression GC durch TOB1 Ausdruck direkt Herunterregulieren; Daher erhöhte Expression von miR-25 stellt eine potentielle noninvasive Biomarker für die Prognose von Patienten GC [17]. Zusätzlich miR-7 wird deutlich in den beiden hochmetastatisch GC-Zelllinien und metastatischen Gewebe nach unten reguliert. Überexpression von miR-7 inhibiert deutlich GC Metastasierung durch die Expression des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-1-Rezeptor (IGF1R) Onkogen Targeting [18]. In GC-Zelllinien, die Wiedereinführung von miR-144 Expression zu Unterdrückung von ZFX, die mäßig Krebszelle Anfälligkeit für 5-Fluorouracil Chemotherapie erhöht. In 93 Fällen von primären GC, wurde verringert miR-144 Expression mit einer schlechten Prognose assoziiert [19]. Diese Beispiele haben die zentrale Rolle der miRNAs in GC malignance und Krebsprogression hervorgehoben.
In dieser Studie, sind wir für die Ziele und definiert den Wirkungsmechanismus von miR-144 in GC. Durch die Induktion ektopische Expression von miR-144, entdeckten wir MET ist ein neues Ziel von miR-144 Regulierung. Diese Feststellung wurde auf beiden mRNA und Protein-Ebene bestätigt und Reportergen Luciferase Assays direkte Bindung von miR-144 zur regulatorischen Bindungsstelle in der 3'-UTR von MET bestätigt. Darüber hinaus fanden wir, dass MET-Expression invers korreliert mit miR-144 Ebenen in einem kleinen, aber gut dokumentiert GC Kohorte. Wir vermuten, dass miR-144 GC Metastasen hemmt, und dass einige dieser Hemmung durch gezielte MET-Expression vermittelt wird.
Materialien und Methoden
Menschliche Gewebeproben und Zelllinien
GC-Proben von Patienten gesammelt wurden, die Operation unterzog an der Fudan-Universität Shanghai Cancer Center zwischen 2012 und 2013 wurde das Protokoll von der Clinical Research Ethics Committee der Fudan-Universität und der Forschung erfolgte nach den Bestimmungen der Deklaration von Helsinki 1975 Alle Proben wurden mit der informierten Einwilligung erhalten genehmigt der Patienten. Die menschliche Zelllinie GC AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL-5974 ™) , NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™) und KATO III (ATCC® HTB-103 ™) wurden in DMEM gehalten, das 10% fötales Rinderserum enthält. Alle Zelllinien wurden in Medien, enthaltend Penicillin (100 IU /ml) und Streptomycin (100 mg /ml) bei 37 ° C mit 5% CO2 gehalten. Die miRNA-Mimetika und Inhibitoren wurden von Ambion (Austin, TX, USA) erworben.
RNA-Extraktion und real-time PCR
Gesamt-RNA aus Zellen extrahiert wurde mit TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Für miRNA-Analyse Poly (A) Schwänze wurden auf Gesamt-RNA unter Verwendung von Poly (A) polymerase (Ambion, Carlsbad, CA) vor hinzugefügt reversen Transkription. Die MiRcute miRNA qPCR-Nachweis-Kit (TIANGEN, Beijing, China) wurde verwendet, um die Expression von miR-144 gemäß dem mitgelieferten Protokoll zu quantifizieren. Die folgenden PCR-Bedingungen wurden verwendet: 95 ° C für 30 s, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 5 s und 60 ° C für 31 s. Die Menge an Ziel (MET /miR-144), normalisiert auf die endogene Housekeeping-Gen GAPDH /U6snRNA und relativ zu einer Referenzprobe, die durch die folgende Gleichung gegeben: Menge target = 2- △△ CT
Microarray-Hybridisierung.
kurz gesagt, wurden RNA-Proben verwendet doppelsträngige komplementäre DNA (cDNA) und doppelsträngiger cDNA markiert und auf dem Mikroarray (Array, Rockville, MD) hybridisiert wurde zu synthetisieren. Nach der Hybridisierung und dem Waschen wurden verarbeitet Dias mit dem Axon 4000B GenePix Microarray-Scanner (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) gescannt. P-Wert wurde mit der gepaarter t-Test berechnet. Der Schwellenwert eingestellt für Aufwärts- und Abwärts regulierte Gene war ein Fold Change > 2,0 und einem p-Wert < 0,05. Hierarchical Clustering wurde basierend auf differentiell exprimierte Gene und miRNAs mit der Cluster Treeview-Software von der Stanford University (Palo Alto, CA) durchgeführt.
MiRNA-Gen-Netzwerk kaufen Wir das Netzwerk adjacency zwischen zwei Genen konstruiert, i und j, definiert als eine Leistung des Pearson-Korrelation zwischen dem Gen-Expressionsprofilen, xi und xj entspricht. Die Adjazenzmatrix, M (i, j) wurde als Diagramm visualisiert und die topologischen Eigenschaften dieses Graphen untersucht wurden. Um eine visuelle Darstellung, nur die stärksten Korrelationen (> 0,98) wurden in diesen Darstellungen gezeichnet. In miRNA-Gen-Netzwerke entspricht jedes Gen mit einem Knoten. Zwei Gene werden durch eine Kante verbunden sind, eine starke Korrelation hinweist. Innerhalb der Netzwerkanalyse, ist ein gewisses Maß die einfachste, wichtiges Maß für die Zentralität eines Gens innerhalb eines Netzwerks und bestimmt die relative Bedeutung. Ein Abschluss ist definiert als die Anzahl der in direktem Zusammenhang mit Nachbarn
Vorhersage von miR-144-Bindungsstelle
Vermeintliche miR-144-Bindungsstellen in MET mRNA 3 'untranslatierten Region des Ziel Scan-Programm (http vorhergesagt wurden. //www.targetscan.org). Position 1430-1436 von MET 3 'UTR hat eine konservierte Bindungsstelle für miR-144-Targeting.
Plasmidtransfektion
Die ORF-Sequenzen von MET aus genomischer DNA aus der Linie SNU-5-Zellen isoliert verstärkt wurden und dann subkloniert in den Plenti Vektor. Das Plasmid wurde in transfizierten SNU-5-Zellen unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Nach 24 h wurden die Zellen für eine Rettung Experiment verwendet.
Oligonukleotids Transfektion
MiR-144 imitiert, miR-144-Hemmer (anti-miR-144) und MET siRNA (siRNA-MET) von Genepharma synthetisiert , Shanghai, China. Oligonukleotid-Transfektion mit Lipofectamin 2000 Reagenzien (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) durchgeführt. Die Endkonzentration von miR-144 nachahmt, anti-miR-144 oder siRNA-MET in dem Transfektionssystem betrug 100 nM. Die Transfektionseffizienz für die Einzel- und cotransfiziert Studien wurde durch Fluoreszenzmikroskop bestimmt.
Immunoblotting
Äquivalente Mengen von Zelllysaten um 7% SDS /PAGE aufgelöst wurden und auf Polyvinylidenfluorid-Membranen übertragen. Die Membran wurde mit einem Kaninchen polyklonalen Antikörper anti-MET inkubiert (1: 500, Abcam, ab47431), einem polyklonalen Ziegen-anti-ADAM12-Antikörper (0,3 ug /ml, Abcam, ab28747) und einem polyklonalen Kaninchen-anti-Versican-Antikörper (1 &mgr; g /ml, Abcam, ab19345). IRdye-markierten sekundären Antikörper wurden für die Quantifizierung des Immunoblotting-Signal verwendet, und die Signale wurden unter Verwendung eines Scanners Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) analysiert.
RNA-ChIP-Test
RNA-Protein-Interaktionen mit Formaldehyd fixiert und Chromatin Scherung mit DNase-Behandlung kombiniert, um RNA /Proteinkomplexe ergeben, die mit Antikörpern gegen MET Proteine ​​immunpräzipitiert werden kann. Querverbindungen werden anschließend umgekehrt; RNA wird zurückgewonnen und erneut behandelt mit DNase Abwesenheit von DNA zu gewährleisten. RNA präzipitiert aus dem Immunkomplex dann durch Echtzeit-PCR analysiert werden. In dieser RNA-ChIP Assay wird die folgende Formel verwendet werden:% der Eingang (Recovery) = AE (Ct Input-Ct Probe) * Fd * 100%. Hier AE ist die Amplifikationseffizienz (10 (-1 /Steigung)) und Fd ist ein Verdünnungsfaktor des Eingangs RNA, den Unterschied in den Mengen von RNA-ChIP Probe und Eingangs RNA auszubalancieren verwendet für Echtzeit-PCR.
Luziferasetest
Der vollständige MET 3'UTR wurde durch PCR unter Verwendung von SNU-5-cDNA als Matrize und kloniert in pGL3 Steuervektor verstärkt. Wir verwendeten Quick Change Mutagenese die miR-144 mutmaßliche Bindungsstelle (Stratagene, Santa Clara, CA, USA) zu mutieren. SNU-5-Zellen und AGS-Zellen wurden mit miR-144 ahmt /Inhibitoren transfiziert und pGL3-Luciferase-Reporterkonstrukte, die MET 3'UTR beherbergen. Nach 24 Stunden wurden die Aktivitäten von Firefly Luziferase und Renilla-Luciferase in den Zelllysaten mit Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA) gemessen.
Migration Assays
für die Transwell-Migrationsassays, 1 × wurden in die obere Kammer plattiert 105 Zellen, die eine nicht-beschichtete Membran enthält. Die Zellen wurden in serumfreiem Medium ausplattiert und Medium, das mit 10% (v /v) Serum wurde als Chemoattraktans in der unteren Kammer verwendet ergänzt. Die Zellen wurden bei 37ºC in einem Gewebekultur-Inkubator mit 5% (v /v) CO 2 inkubiert. Nach 16 h wurden die nicht migrierten Zellen von den Oberseiten der Transwell-Membran-Filtereinsätze entfernt. Die migrierten Zellen an den Unterseiten der Einsätze mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt waren, und die Zellen wurden gezählt.
Zellproliferationsassay
Die transfizierten Zellen bei einer Dichte von 1 x 104 Zellen in 96-Well-Platten ausgesät /Gut. Ein Zellproliferationsassay wurde mit der Zellzählung Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) durchgeführt, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Vor der Zugabe von CCK-8 wurden die Zellen mit warmem Kulturmedium gewaschen, indem die Platte bei 500 Umdrehungen pro Minute Spinnen für 3 m und dann der Überstand verworfen
Grundierungen
Die folgenden Primer für real-time PCR verwendet wurden.: miR-144: 5-TACAG TATAG ATGAT GTACT-3; U6snRNA: 5-CGCAA GGAUG ACACG CAAAU UCGUG AAGCG UUCCA UAUUU UU-3; SKIL Vorwärts-Primer: 5-GTTAA GCGAA CCTGT ACTTC TGT-3, Reverse-Primer: 5- GTAGG CGACA TGCTT TCTTG G-3; MET Vorwärtsprimer: 5-GTCGG AGTAG AGCGT CGAGA-3, Reverse-Primer: 5-CAGCG CGATC AGGTA GAGC-3; TOP2A Vorwärts-Primer: 5-ACCAT TGCAG CCTGT AAATG A-3, Reverse-Primer: 5-GGGCG GAGCA AAATA TGTTC C-3; ADAM12 Vorwärts-Primer: 5-TCAAC CTGGA TACCC GATTC C-3, Reverse-Primer: 5-GCTCT GTCTG CCGAT GGAG-3; VCAN Vorwärts-Primer: 5-GTAAC CCATG CGCTA CATAA AGT-3, Rückwärts-Primer: 5-GGCAA AGTAG GCATC GTTGA AA-3. MET 3'UTR Vorwärtsprimer: Die folgenden Primer wurden für die vollständige MET 3UTR Anwendung 5-Tcact GCCTG ACCTT TA-3, MET 3'UTR Reverse-Primer: 5-ATCAC tTACT CCCAC AAT-3. Die siRNA-Nukleotid für MET wurde wie folgt verwendet: siRNA-MET nach vorn: 5-GUGCC ACUAA Cuaca UUUAU U-3, siRNA-MET umkehren. 5-UAAAU GUAGU UAGUG GCACU U-3
Statistische Analyse
Die Ergebnisse präsentiert als Mittelwert ± SEM, und die Daten wurden mit dem Student-t-Test analysiert. Ein Wert von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.
Ergebnisse

• Verband der An- /Abwesenheit und Ein /Aus-Muster von Helicobacter pylori OIPA Gen mit Magengeschwür und Magenkrebs Risiken: eine Meta-analysis
• Beziehung zwischen Darmhormone und Glukose-Homöostase nach bariatrischen Chirurgie