El microARN-144 inhibe la metástasis del cáncer gástrico mediante la expresión de orientación MET

El microARN-144 inhibe la metástasis del cáncer gástrico mediante la expresión de orientación MET
Resumen
cáncer gástrico (CG) sigue siendo uno de los tipos más comunes de cáncer maligno, y el mecanismo molecular que subyace a sus metástasis sigue siendo en gran medida poco clara. Los microARN han surgido como importantes reguladores de metástasis debido a su capacidad para actuar en múltiples vías de señalización. En nuestro estudio, encontramos que el miR-144 es downregulated significativamente en ambas líneas celulares GC altamente metastásicas y tejidos. Los resultados de ambos ganancia de función y experimentos de pérdida de función demuestran que el aumento de la expresión de miR-144 redujo significativamente la migración de células GC, mientras que disminuyó la expresión de miR-144 mejorado drásticamente la migración celular GC. El proto-oncogén met (MET), que a menudo se amplifica en cánceres y las funciones humanas como un importante regulador del crecimiento celular y la invasión tumoral, fue identificado como un objetivo directo de miR-144. Por otra parte, el silenciamiento de MET utilizando pequeños ARN de interferencia (siRNA) recapitula la función anti-metastásico de miR-144, mientras que la restauración de la expresión de MET atenúa la función de miR-144 en células GC. Además, hemos encontrado que el miR-144, por la orientación MET, suprime la fosforilación de Akt. Por último, se observó una correlación inversa entre la expresión de miR-144 y ARNm MET en los tejidos metastásicos GC. En resumen, el miR-144 suprime la progresión GC mediante la regulación negativa directamente la expresión de MET, que posteriormente se previene la activación de la vía de Akt pro-oncogénica. Reintroducción de miR-144 expresión en células de GC presenta una aproximación terapéutica atractiva para bloquear la metástasis de cáncer gástrico.
Palabras clave
microARN miR-144 MET metástasis del cáncer gástrico Introducción
A nivel mundial, el cáncer gástrico (CG) es una de los tipos más frecuentes de la enfermedad maligna. En 2008, se diagnosticaron aproximadamente 989.600 nuevos casos de CG. Por otra parte, GC fue implicado como causa de 738.000 muertes, haciendo GC la cuarta neoplasia más frecuente y la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. A medida que el tumor progresa, se desarrolla la capacidad de invadir los tejidos circundantes y metástasis. El receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, MET, es conocido por promover la movilidad y la capacidad invasiva de las células tumorales [2]. MET es un miembro de la familia del receptor tirosina quinasa y se ha demostrado que se upregulated en muchos tumores [3-5]. Se sugiere que el nivel de expresión MET se incrementa ya sea por amplificación de genes o hipoxia través HIF1α. En los pacientes con GC metastásico, la amplificación MET y fuerte expresión de la proteína no son infrecuentes. Estos hechos parecen estar asociados significativamente con el resultado clínico desfavorable [6]. Aproximadamente el 10% de los pacientes blancos albergan una ganancia de cinco o más copias de MET. Además, este aumento en el número de copias MET se asoció significativamente con pronóstico desfavorable [7]. Por otra parte, los microARN miR-34a /c se ha demostrado que modulan negativamente la expresión de MET en líneas celulares derivadas de cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular y GC [8-10].
Los microARN (miRNA) son moléculas de ARN no codificantes, aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud, que regulan la expresión génica en el nivel transcripcional o post-transcripcional [11 a 13]. miARN expresión de perfiles de análisis han revelado una regulación a la baja de los niveles mundial miARN maduros en los tumores humanos relativos a los tejidos normales [14]. Además, miRNAs puede funcionar, ya sea en un supresor de tumores o papel oncogénico, dependiendo de la función de su objetivo. Por ejemplo, el miR-133b fue significativamente las reguladas en los tejidos GC y ejerció su función supresora de tumores en las células de GC [15]. La expresión de miR-337-3p se downregulated significativamente en los ganglios tejidos nodo metastásicas de pacientes GC, y la inducción de la expresión de miR-337-3p hizo reducir gástrico capacidad de invasión de células de cáncer [16]. miR-25 promueve la progresión GC mediante la regulación negativa directamente la expresión TOB1; Por lo tanto, el aumento de expresión de miR-25 presenta un potencial biomarcador no invasivo para el pronóstico de los pacientes de GC [17]. Además, miR-7 es downregulated significativamente en ambas líneas celulares GC altamente metastásicas y los tejidos metastásicos. La sobreexpresión de miR-7 inhibe marcadamente GC metástasis por la orientación de la expresión de la insulina como factor de crecimiento-1 receptor (IGF1R) oncogén [18]. En las líneas celulares de GC, la reintroducción de miR-144 de expresión de resultados en la represión de ZFX, que moderadamente aumenta la susceptibilidad de células cancerosas a la quimioterapia 5-fluorouracilo. En 93 casos de CG primaria, disminuyó la expresión de miR-144 se asocia con un mal pronóstico [19]. Estos ejemplos han puesto de manifiesto el papel clave de miRNAs en la malignidad de GC y la progresión del cáncer.
En este estudio, se caracterizaron los objetivos y definido el mecanismo de acción de miR-144 en GC. Mediante la inducción de la expresión ectópica de miR-144, descubrimos MET es un nuevo objetivo de la regulación de miR-144. Este hallazgo fue confirmado en ambos niveles de ARNm y proteínas, y los ensayos de gen reportero de luciferasa verificó la unión directa de miR-144 al sitio de unión de reglamentación en el 3'UTR del MET. Por otra parte, se encontró que la expresión de MET está inversamente relacionada con los niveles de miR-144 en un pequeño pero bien documentada cohorte GC. Nuestra hipótesis es que el miR-144 inhibe la metástasis GC, y que algunos de esta inhibición está mediada por la expresión de segmentación MET.
Materiales y métodos
muestras de tejidos humanos y líneas celulares
se recogieron muestras de GC de pacientes que se sometieron a cirugía en el Centro de cáncer de la Universidad Fudan de Shanghai entre 2012 y 2013. el protocolo fue aprobado por el Comité Ético de investigación clínica de la Universidad de Fudan, y la investigación se llevó a cabo de acuerdo con las disposiciones de la Declaración de Helsinki de 1975. Todas las muestras se obtuvieron con el consentimiento informado de los pacientes. La línea celular humana GC AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL- 5974 ™) , NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), y KATO III (ATCC® HTB-103 ™) se mantuvieron en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10%. Todas las líneas celulares se mantuvieron en medios que contienen penicilina (100 UI /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) a 37 ° C con 5% de CO2. Los imitadores e inhibidores de miRNA se compraron de Ambion (Austin, TX, EE.UU.).
Extracción de RNA y PCR en tiempo real
ARN total fue extraído a partir de células utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para el análisis de los genes miARN, se añadieron colas de poli (A) de RNA total utilizando poli (A) polimerasa (Ambion, Carlsbad, CA) antes de la transcripción inversa. El kit de detección MiRcute miARN qPCR (Tiangen, Pekín, China) se utilizó para cuantificar los niveles de expresión de miR-144 de acuerdo con el protocolo previsto. Se utilizaron las siguientes condiciones de PCR: 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 31 s. La cantidad de diana (MET /miR-144), normalizado al gen endógeno de limpieza GAPDH /U6snRNA y en relación con una muestra de referencia, viene dada por la siguiente ecuación: cantidad de target = 2- △△ CT hibridación de microarrays
.
brevemente, las muestras de ARN se utilizaron para sintetizar ADN complementario de doble hebra (ADNc), y ADNc de doble hebra se marcó y se hibridó con la micromatriz (Arraystar, Rockville, MD). Después de la hibridación y el lavado, los portaobjetos procesados ​​se escanearon con el escáner GenePix 4000B microarray Axon (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). valor de p se calculó utilizando la prueba t pareada. El umbral establecido para arriba y abajo de los genes regulados fue un factor de cambio > 2,0 y un valor de p < 0.05. La agrupación jerárquica se realizó sobre la base de los genes expresados ​​diferencialmente y miRNAs utilizando el software Cluster Treeview de la Universidad de Stanford (Palo Alto, CA).
red miARN gen
Hemos construido la red de adyacencia entre dos genes, I y J, definido como una potencia de la correlación de Pearson entre los correspondientes perfiles de expresión génica, xi y xj. La matriz de adyacencia, M (i, j), se visualizó como un gráfico, y se examinaron las propiedades topológicas de este gráfico. Para hacer una representación visual, sólo los más fuertes correlaciones (> 0,98) fueron elaboradas en estas representaciones. En las redes de los genes miARN-genes, cada gen corresponde a un nodo. Dos genes están conectados por un borde, lo que indica una correlación fuerte. Dentro del análisis de redes, un grado es la medida más simple, más importante de la centralidad de un gen dentro de una red y determina la importancia relativa. Un título se define como el número de vecinos directamente vinculados
Predicción de miR-144 sitio de unión
supuestos sitios de unión de miR-144 en la región no traducida del ARNm MET 3 'fueron predichas por el programa Objetivo del Análisis (http:. //www.targetscan.org). Posición 1430-1436 del MET UTR 3 'tiene un sitio de unión conservada de miR-144 de orientación.
Transfección del plásmido Francia El ORF secuencias de MET se amplificaron a partir de ADN genómico aislado de la línea celular SNU-5 y luego se subclonaron en el vector plenti. El plásmido se transfectó en SNU-5 células utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Después de 24 h, las células se usaron para un experimento de rescate.
De oligonucleótidos transfección
miR-144 imita, miR-144 inhibidor (anti-miR-144), y MET siRNA (siRNA-MET) fueron sintetizados por Genepharma , Shanghai, China. transfección de oligonucleótidos se llevó a cabo con Lipofectamine 2000 reactivo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). La concentración final de miR-144 imita, anti-miR-144 o siRNA-MET en el sistema de transfección fue 100 nM. La eficacia de transfección para los estudios individuales y co-transfectadas se determinó mediante microscopio de fluorescencia.
Immunoblotting
cantidades equivalentes de lisados ​​celulares se resolvieron por 7% de SDS /PAGE y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno. La membrana se incubó con un anticuerpo policlonal de conejo anti-MET (1: 500, Abcam, ab47431), un anticuerpo anti-ADAM12 policlonal de cabra (0,3 g /ml, Abcam, ab28747), y un anticuerpo policlonal de conejo anti-versicano (1 g /ml, Abcam, ab19345). IRDye marcado con anticuerpos secundarios fueron utilizados para la cuantificación de la señal de inmunotransferencia, y las señales se analizaron mediante un escáner Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EE.UU.).
Ensayo de ARN-chip
ARN-proteína interacciones se fijan con formaldehído, y el corte de la cromatina se combina con el tratamiento con DNasa para producir complejos de ARN /proteína que puede ser inmunoprecipitada con anticuerpos frente a proteínas MET. Los enlaces cruzados se invierte posteriormente ARN se recupera y se trata de nuevo con DNasa para garantizar la ausencia de ADN. ARN precipitado a partir del complejo inmune entonces ser analizados por PCR en tiempo real. En este ensayo de ARN-chip, se utilizará la siguiente fórmula:% de la entrada (recuperación) = AE (Ct muestra de entrada-Ct) * Fd * 100%. Aquí, AE es la eficiencia de amplificación (10 (-1 /pendiente)) y FD es un factor de dilución del ARN de entrada para equilibrar la diferencia en las cantidades de ARN-chip de la muestra y la entrada de ARN utilizados para PCR en tiempo real.
ensayo de la luciferasa Francia El completo MET 3'UTR se amplificó por PCR usando SNU-5 cDNA como plantilla y se clonó en el vector de control pGL3. Se utilizó la mutagénesis Quick Change para mutar el supuesto sitio de unión de miR-144 (Stratagene, Santa Clara, CA, EE.UU.). SNU-5 células y células AGS se transfectaron con miR-144 imita /inhibidores y pGL3 reportero de luciferasa construcciones de MET que alberga el 3'UTR. Después de 24 h, las actividades de la luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla en los lisados ​​celulares se midieron con el sistema de doble ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Migración ensayos
Para los ensayos de migración transwell, 1 x 105 células se sembraron en la cámara superior que contiene una membrana no recubierta. Las células se sembraron en el medio libre de suero, y el medio suplementado con suero al 10% (v /v) se utilizó como un quimioatrayente en la cámara inferior. Las células se incubaron a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos con 5% (v /v) de CO2. Después de 16 h, las células no migradas fueron retirados de los lados superiores de los insertos de filtro de membrana Transwell. Las células migraron en los lados inferiores de las inserciones se tiñeron con azul brillante de Coomassie, y se contaron las células. Ensayo de proliferación celular
las células transfectadas se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 104 células /bien. Un ensayo de proliferación celular se realizó mediante el Recuento celular Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Antes de la adición de CCK-8, las células se lavaron con medio de cultivo caliente haciendo girar la placa a 500 rpm durante 3 metros y luego desechar el sobrenadante
cebadores
Los siguientes cebadores fueron utilizados para PCR en tiempo real.: miR-144: 5-TACAG TATAG ATGAT GTACT-3; U6snRNA: 5-CGCAA GGAUG ACACG CAAAU UCGUG AAGCG UUCCA UAUUU UU-3; SKIL cebador directo: 5-GTTAA GCGAA CCTGT ACTTC TGT-3, cebador inverso: 5- GTAGG CGACA TGCTT TCTTG G-3; MET cebador directo: 5-GTCGG AGTAG AGCGT CGAGA-3, cebador inverso: 5-CAGCG CGATC AGGTA GAGC-3; TOP2A cebador directo: 5-ACCAT TGCAG CCTGT AAATG A-3, cebador inverso: 5-GGGCG GAGCA AAATA TGTTC C-3; ADAM12 cebador directo: 5-TCAAC CTGGA TACCC GATTC C-3, cebador inverso: 5-GCTCT GTCTG CCGAT GGAG-3; VCAN cebador directo: 5-GTAAC CCATG CGCTA Cataa AGT-3, cebador inverso: 5-GGCAA AGTAG GCATC GTTGA AA-3. Los siguientes cebadores se utilizaron para la plena aplicación MET 3UTR: cebador directo MET 3'UTR: 5-TCACT GCCTG ACCTT TA-3, MET 3'UTR cebador inverso: 5-ATCAC TTACT CCCAC AAT-3. El nucleótido siRNA para MET se utilizó la siguiente manera: siRNA-MET hacia adelante: 5-GUGCC ACUAA cuaca UUUAU T-3, siRNA-MET inversa:.-5 UAAAU GUAGU UAGUG GCACU T-3 Análisis estadístico

Los resultados se presentan como medias ± SEM, y los datos se analizaron con la prueba t de Student. Un valor de p < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
perfil de expresión de microARN en el cáncer gástrico
Comparación de los tejidos metastásicos peritoneales con muestras pareadas focos primarios de GC mediante el análisis de agrupamiento jerárquico reveló variación sistemática en la expresión de miRNAs y genes (Figura 1A y B). Nuestros datos sugieren que un conjunto de miRNAs y genes es frecuentemente expresado de forma aberrante en los tejidos metastásicos peritoneales de GC. Además, también se encontró que algunas moléculas previamente bien probadas, tales como el miR-7 [18], el miR-25 [17], y TOB1 IGF1R, no se pueden identificar en nuestra microarrays. Pensamos estas diferencias pueden ser inducidos por la diversidad de muestras clínicas procedentes de diferentes áreas. Figura 1 núcleo de la red miARN-gen, incluyendo 8 miRNAs clave y sus objetivos. análisis jerárquico agrupación de 27 miRNAs (A) y 32 genes (B) que son expresados ​​diferencialmente entre los tejidos metastásicos en las muestras primarias peritoneales y pareadas de GC (superior a 2,0 veces; p < 0,05). Expresión valores están representados en tonos de rojo y verde, lo que indica la expresión por encima y por debajo del valor medio de expresión en todas las muestras. (C) La red de miARN-gen muestra las relaciones entre 8 miRNAs clave y los genes asociados a tumores que se predice para regular. Los colores indican la anotados los niveles de expresión de los miARN y genes. Comentario El miRNA-gen-red fue montado con el objetivo de identificar los miRNAs clave que regulan la expresión del gen asociado a un tumor durante la progresión de la metástasis tumoral. Debido a que los módulos de coexpresión probablemente corresponden a las vías biológicas, nos centramos en los módulos de coexpresión que están asociados con un alto número de genes codificadores de proteínas. Además, NCBI RefSeq detalla las funciones de muchos genes, que ayudaron nuestra identificación de genes en GC asociado. Usando este método, que caracteriza el papel de miR-144 en los focos metastásico peritoneal de GC. En la red de co-expresión del cáncer, miR-144 se conecta a 6 genes que codifican proteínas que están implicadas en el crecimiento tumoral y la metástasis (Figura 1C).
Papel regulador de miR-144 en el cáncer gástrico metástasis
Para investigar miR 144 de función, lo primero que examinó los niveles de miR-144 en un panel de líneas celulares de 6 GC humanos. Como se muestra en la Figura 2A, se seleccionaron AGS, caracterizado regulada positivamente con el miR-144, y SNU-5, caracterizado downregulated con miR-144, para su posterior estudio. La línea de células AGS se deriva de fragmentos de tumor gástrico que fueron resecados de un paciente que había recibido ningún tratamiento previo, mientras que SNU-5 se derivó de ascitis de un paciente con carcinoma pobremente diferenciado del estómago. Figura 2 miR-144 suprime la migración de las células de GC. niveles (A) la expresión de miR-144 se comprobaron en un panel de líneas celulares de 6 GC humanos utilizando el método de PCR en tiempo real. (B) La migración de las células SNU-5 tratados con miR-144 imita se comprobó utilizando sin Matrigel Transwell tratado cámara. (C) La migración de las células AGS tratados con un inhibidor de miR-144 se comprobó utilizando no-matrigel tratada transwell cámara. (*** P < 0,001).
En nuestro estudio, se observó una estrecha relación entre la pérdida de miR-144 y las metástasis en el GC (Figura 1 A y C). En consecuencia, los estudios anteriores han documentado la inhibición a base de miR-144 de la migración de células tumorales y la invasión en carcinoma de células escamosas epiteliales. La hipótesis de que la reintroducción de la expresión de miR-144 podría suprimir la migración de las células del cáncer. Adecuadamente, la introducción de la expresión de miR-144 inhibe la migración de células en SNU-5 (Figura 2B). En comparación con el SNU-5, las células AGS tienen un nivel relativamente alto de expresión de miR-144 endógeno. Como era de esperar, la inhibición de miR-144 aumentó la migración de células AGS (Figura 2C). De hecho, también se realizó el ensayo de invasión Transwell usando matrigel tratados, y no hay diferencia para la capacidad invasiva de las células SNU-5 /AGS después tratados con miR-144 /anti-miR-144 (datos no mostrados). Estos resultados ilustran que el miR-144 juega un papel importante en la migración, pero no en la invasión de células de GC.
MiR-144 afecta a la expresión MET
A través de la expresión ectópica de miR-144 en 5-SNU células, se determinó ADAM12 , VCAN y MET son putativos de miR-144 objetivos. Como se muestra en la Figura 3A, la expresión de miR-144 afectada drásticamente los niveles de mRNA de ADAM12, VCAN y MET. ADAM12, vcan y cumplen los niveles de expresión de proteínas también se detectaron a través de Western blot en células cancerosas transfectadas con el miR-144 imita. Como se muestra en la Figura 3B, sólo se cumplen los niveles de proteína fueron regulados a la baja por el miR-144. Esto indica que miR-144 afecta MET expresión a nivel transcripcional, tal vez a través de la escisión o la desestabilización de la estructura de mRNA. Sin embargo, también encontramos los niveles de proteína ADAM12 y vcan no son disminuidos por la introducción exógena de miR-144. Pensamos que el ARNm y los niveles de proteína no se pueden correlacionar directamente debido a diferente vida media. También nos pareció que mostraron que puedan deberse a la presencia de miR-144 que reprimía continuamente traducción en un caso pero no en la otra. El MET: la interacción de miR-144 también se demostró en las células vivas mediante el ensayo de ARN-CHIP. De hecho, endógena de miR-144 se encontró asociado con endógena MET en anti-MET pero no inmunoprecipitados anti-IgG de las células (Figura 3C). Figura 3 La expresión de MET estaba regulado por el miR-144. niveles (A) mRNA de putativos de miR-144 objetivos fueron examinados por PCR en tiempo real en las células SNU-5 transfectadas con miR-144 imita o miR-NC. niveles (B) de proteínas putativas de miR-144 objetivos fueron examinados por Western Blot en las células SNU-5 transfectadas con miR-144 imita o miR-NC. (C) Los% de recuperación de entrada de las reacciones de ARN-chip ilustra el enriquecimiento por el anticuerpo MET. ensayo de ARN-chip para el miR-144 lleva a cabo en anticuerpo anti-MET a partir de lisados ​​de células. ARN-chip con una IgG no relacionado sirvieron como controles. (D) Un cuadro esquemático del sitio de unión de miR-144 se predijo en el 3'UTR del MET. (E) SNU-5 células fueron transitoriamente co-transfectadas con LUC-MET 3'UTR y miR-144 imitan. (F) células AGS fueron transitoriamente co-transfectadas con LUC-MET 3'UTR y un inhibidor de miR-144. (G) mutar el sitio de unión de miR-144 en MET 3'UTR abolió la supresión de la actividad de luciferasa inducida por miR-144. La actividad de luciferasa se midió después de 24 h y se normalizaron a la co-transfectadas Renilla. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Utilizando el análisis basado en bioinformático, se identificó un único sitio de unión para los miARN miR-144 en el 3 'UTR del MET mRNA (Figura 3D). Para probar si el miR-144 se une directamente a la 3'-UTR del ARNm MET, hemos realizado ensayos de reportero de luciferasa en células SNU-5. fragmentos derivados de PCR de MET 3'UTR se insertaron en el vector de control pGL3 en Xba1 sitio (LUC-MET 3'UTR). La co-transfección de LUC-MET 3'UTR y miR-144 imita en SNU-5 células dio como resultado una disminución de la señal de luciferasa (en comparación con miR-NC), lo que confirma que la unión de miR-144 a la 3'UTR de MET tiene una efecto inhibidor directo (Figura 3E). El experimento inverso, llevada a cabo mediante el bloqueo de la producción endógena de miR-144 con un inhibidor de miR-144 en células AGS, resultó en un aumento de la señal de luciferasa (Figura 3F). Un reportero de la luciferasa mutado en el sitio de unión de miR-144 se construyó también (Figura 3D). La mutación del sitio de unión miRNA abolió la inhibición mediada por miR-144 de la actividad de luciferasa (Figura 3G). Estos datos sugieren que la posición 1430-1436 de la MET 3'UTR es fundamental para la regulación de genes mediada por el miR-144.
MET media la resistencia inducida por el miR-144 a la migración
El uso de PCR en tiempo real, MET los niveles de expresión se determinaron para seis líneas de células de GC humanos. Como se muestra, las líneas celulares con miR-144 niveles "downregulated" tienen cantidades más altas de MET en comparación con las líneas celulares con "upregulated" miR-144 niveles (Figura 4A). El uso de pruebas no paramétricas, se determinó una correlación inversa significativa entre MET ARNm y la expresión de miR-144 en las muestras GC metastásicos (Figura 4B). La figura 4 representa la modulación MET para el efecto antimetastásico de miR-144. (A) Western blot que muestra la expresión de MET en un conjunto de líneas celulares humanas GC. Se observa (B) una correlación inversa significativa entre los niveles de expresión de miR-144 y MET en los tejidos GC (n = 52). (C) El MET y Akt fosforilada fueron inhibidos por la expresión forzada de miR-144 o siRNA-MET. (D, E) Los efectos de miR-144 o siRNA-MET sobre la migración y proliferación se determinó en SNU-5 células. (F) El MET y Akt fosforilada fueron restaurados por la sobreexpresión de miR-MET en 144 SNU-5-células tratadas imita. (G, H) Los efectos de miR-144 en combinación con MET-ORF sobre la migración y proliferación de células SNU-5. (I) El MET y Akt fosforilada fueron reguladas mediante el bloqueo de miR-144 en células AGS. (J, K) Los efectos de anti-miR-144 en la migración y proliferación de células AGS. Empresas El funciones de la proteína MET como un receptor tirosina quinasa y desempeña un papel fundamental en la promoción del crecimiento celular y la migración mediante la transducción extracelular estímulos a los circuitos de señalización intracelular. Un componente importante de la maquinaria de señalización intracelular es la PI3K (fosfoinositida 3-quinasa) vía [20,21]. Debido a que el miR-144 inhibe la expresión de MET, la hipótesis de que el miR-144 en última instancia, podría disminuir la fosforilación de Akt y activación a través de la disminución de la señalización de MET. En consecuencia, se examinaron los niveles de fosforilación de Akt después de miR-144 y la sobreexpresión observó una disminución significativa de la fosforilación de Akt (Figura 4C).
Decidimos investigar si inducida por el miR-144 MET regulación a la baja tuvo un efecto sobre la migración de células tumorales y la proliferación. Estamos transfectadas miR-144 y siRNA para MET (siRNA-MET) en SNU-5 células. La migración celular se evaluó 16 h después de la transfección por transwell ensayo, mientras que la proliferación celular se determinó a través de CCK-8. Como se muestra en las figuras 4D y E, la transfección con miR-144 inhibe la migración celular y la proliferación, en comparación con el control. Del mismo modo, la disminución de expresión de la proteína MET utilizando siRNA también disminuyó la migración de células tumorales y la proliferación.
Para determinar si MET es el mediador fundamental del efecto de miR-144 en la migración celular y la proliferación, se construyeron dos vector de expresión de MET. Uno de los cuales incluye solamente la secuencia de marco de lectura abierto del gen MET (MET-ORF), y el otro vector contiene el nucleótido de longitud completa del gen MET incluyendo la secuencia 3'UTR (MET-larga y plena). a continuación, se realizó un análisis de transferencia Western 48 h después de la transfección de MET-ORF /MET-tiempo completo en el miR-144 imita tratados SNU-5 células (Figura 4F). En comparación con el grupo control negativo (vector vacía), la expresión ectópica de MET-ORF aumentó significativamente la expresión total de MET y Akt fosforilada. Además, la expresión de la MET-ORF promovió la migración y proliferación de células GC (Figura 4G y H). La sobreexpresión de MET abolió la inhibición inducida por el miR-144 de la migración celular y la proliferación. Por el contrario, el nivel de proteínas de MET y fosforilada-AKT aumenta en las células AGS tratados con anti-miR-144 (Figura 4E), y el bloqueo de miR-144 también promovió la migración y proliferación de células AGS (Figura 4J y K). Estos resultados indican que la MET es un objetivo fundamental para el efecto anti-migración de miR-144 en células humanas GC.
Discusión
En este estudio, hemos identificado las firmas de un pequeño número de genes de miRNAs y que no se superponen que se expresan de forma aberrante en los tejidos metastásicos peritoneales de GC, en comparación con los tejidos primarios pareadas. Análisis de los genes miARN y los perfiles de expresión génica en el gen de la red miARN miR-144 identificado como un regulador de las principales vías oncogénicas, tales como la proliferación y la migración. GC pacientes con metástasis peritoneales tuvieron menores de miR-144 niveles de expresión que los pacientes sin metástasis. Este hallazgo implica el miR-144 como un supresor tumoral potencial en GC. Además, miR-144 se asocia con los mecanismos de la metástasis. Nuestros resultados se corresponden con los resultados de estudios anteriores sobre el papel de miR-144 en la proliferación del cáncer, la migración y la invasión [22,23]. miR-144 inhibe la metástasis de las células cancerosas al dirigirse al desintegrina A y ADAMTS5 miembro de metaloproteinasa (ADAM) familia de proteínas. desregulación microARN se asocia con el aumento de la invasividad tumoral y metástasis, así como la reducción pronóstico del paciente en ciertos cánceres epiteliales [24]. Además, investigó el papel de miR-144 en la desregulación GC. Se estudió el efecto de la expresión de miR-144 en la línea celular SNU-5, ya que se caracteriza por una baja expresión de miR-144. La expresión ectópica de miR-144 en SNU-5 células da lugar a profundos cambios fenotípicos, tales como la disminución de la migración. El experimento inverso, el bloqueo de miR-144 de expresión, se llevó a cabo en la línea celular AGS, que tiene un relativamente alto nivel endógeno de expresión de miR-144. La inhibición de la expresión de miR-144 produjo un aumento de la migración de células AGS.
Para investigar el mecanismo detrás de miR-144-dependiente disminución de la migración de GC, se identificaron los supuestos objetivos de miR-144 como se predijo por los genes miARN-gen-red. miR-144 sobreexpresión puede reducir la expresión de MET, tanto en los niveles de proteína y ARNm, y en consecuencia, los ensayos de reportero de luciferasa puesto de manifiesto que el miR-144 puede interactuar directamente con el MET 3'UTR. A continuación, evaluaron los niveles de expresión de MET en una cohorte de 52 pacientes GC y encontró que los niveles de miR-144 está inversamente relacionado con la expresión de MET. Por esa razón, la hipótesis de que el miR-144 inhibe la tumorigénesis por GC expresión de orientación MET. MET también ha sido descrito como un objetivo de miR-34a /c en otros modelos celulares y es conocido por promover la motilidad y la capacidad invasiva de las células tumorales. La sobreexpresión de MET está estrechamente correlacionada con la invasión tumoral y el pronóstico del paciente en GC [6]. En GC, MET sobreexpresión es un factor pronóstico independiente y objetivo potencial de drogas. Por otra parte, la sobreexpresión MET puede predecir qué pacientes pueden beneficiarse de la terapia dirigida con inhibidores de la MET [25]. En nuestro estudio, la expresión de MET se asoció significativamente con la diferenciación GC, TNM y la metástasis [26]. Se determinó que los cambios en la proliferación celular y la migración a través de miR-144 podría ser ejercida a través de la regulación de la expresión de MET. miR-144 represión conduce a mayores niveles de MET, lo que puede explicar el fenotipo de la metástasis de las células agotadas-miR-144. Curiosamente, el miR-144 influenciada señalización del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). HGF, como el ligando de MET, puede inducir la activación de MET en células epiteliales. Mientras que la sobreexpresión MET no pudo restaurar completamente GC cualidades tumorigénicas, la migración celular y la proliferación de GC fueron restaurados parcialmente después de la sobreexpresión MET. Por lo tanto, el miR-144 podrá regular otros genes en células de GC. Estudios anteriores han demostrado que MET puede inducir la tumorigénesis GC a través de la activación de la vía PI3K. En este estudio, encontramos que el miR-144 atenuó significativamente la fosforilación de Akt, y que la fosforilación de Akt fue completamente restaurado con sobreexpresión de MET. Nuestros hallazgos sugieren que el miR-144 regula la fosforilación de Akt través de la regulación MET en GC.
En conclusión, nuestro estudio identificó una base para la disminución del nivel de miR-144 se ve en los tejidos metastásicos GC. miR-144 fue identificado como un supresor de tumores potencial en GC y se ha asociado con los mecanismos de la metástasis GC. Por otra parte, el miR-144 inhibe la tumorigénesis GC apuntando MET, y posteriormente, la vía PI3K /Akt. Para nuestro conocimiento, este es el primer tiempo de miR-144 se ha demostrado que el objetivo MET en células de GC. Por lo tanto, otros estudios que exploran el papel contra el cáncer de miR-144 pueden contribuir al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para la GC.
Notas
Jun Liu Hui Xue y contribuyeron igualmente a este trabajo.
Declaraciones
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81201897). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Contribuciones de los autores
JL llevaron a cabo los estudios de biología molecular. HX redactó el manuscrito. JZ llevó a cabo el análisis bioinformático. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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