MicroRNA-144 inhibira metastaze raka želodca z usmerjanjem izraz MET

MicroRNA-144 inhibira metastaze raka želodca z usmerjanjem MET izraz
Abstract
želodca raka (GC) je še vedno ena izmed najbolj pogostih vrst raka malignega in molekularni mehanizem, ki je podlaga svojo metastaze je še vedno zelo nejasen. MicroRNAs so postali pomembni regulatorji metastaz zaradi svoje sposobnosti, da deluje na več poti signalizaciji. V naši raziskavi smo ugotovili, da je miR-144 občutno navzdol reguliranih tako zelo metastatskih GC celičnih linijah in tkivih. Rezultati iz obeh dobiček-of-funkcijo in izguba-of-funkcijo poskusov kažejo, da povečana miR-144 izraz bistveno zmanjša migracije GC celic, medtem ko se je miR-144 izražanje močno povečano migracijo GC celic. The Met proto-onkogena (MET), ki je pogosto dopolnjena v človeških rakavih obolenj in deluje kot pomemben regulator rasti celic in tumorjev invazije, je bila opredeljena kot neposredni cilj miR-144. Poleg tega, utišanje MET pomočjo male interferenčne RNA (siRNA) ponavljati, anti-metastatskega funkcijo miR-144, medtem ko obnavljanje izraz MET oslabljen funkcijo miR-144 v GC celicah. Poleg tega smo ugotovili, da miR-144, z usmerjanjem MET, zavira fosforilacijo Akt. Na koncu smo ugotovili, inverzno povezavo med izražanjem miR-144 in MET mRNA v GC metastatskim tkivih. Če povzamemo, miR-144 zatira GC napredovanje neposredno downregulating izraz MET, kar posledično preprečuje aktiviranje pro-onkogenih Akt poti. Ponovna uvedba miR-144 izraz v GC celic predstavlja privlačno terapevtski pristop, da blokira metastaze raka želodca.
Ključne besede
microRNA miR-144 MET Rak želodca metastaze Uvod
svetovnem merilu, raka želodca (GC) je eden najbolj razširjene vrste maligne bolezni. V letu 2008 je bilo diagnosticiranih približno 989.600 novih primerov GC. Poleg tega je bila GC vpleten kot vzrok za 738,000 smrti, zaradi česar GC četrti najpogostejši maligni proces in vodilni vzrok smrti zaradi raka na svetu [1]. Kot tumor napreduje, se razvija sposobnost za napad na okoliških tkiv in metastaze. Faktor receptorja hepatocitnega rastnega MET, je znano, da spodbujajo gibljivost in invazivno sposobnost tumorskih celic [2]. MET je član kinaze družine receptorjev tirozin in pokazalo se je, da bo povečana pri številnih tumorjih [3-5]. Predlaga se, da se TGO nivo izražanja povečala bodisi gena ojačanje ali hipoksije preko HIF1α. Pri bolnikih z metastatskim GC, ojačevanje MET in močno izražanja proteinov niso redke. pojavljajo ti dogodki, ki se bistveno povezana z neugodnim kliničnim izidom [6]. Približno 10% belcev pristanišče dobiček v višini pet ali več izvodov MET. Poleg tega je ta dobiček v MET številu kopij značilno povezana z neugodno prognozo [7]. Poleg tega so bili prikazani miR-34a /c microRNAs so negativno uravnavajo izražanje MET v celičnih linij, pridobljenih iz raka na prostati, karcinomom jetrnih celic in GC [8-10].
MicroRNAs (miRNAs) so-kodiranje nahajajo RNA molekule, kar je približno 21-23 nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na transkripcijsko ali post-transkripcijski ravni [11-13]. miRNA izraz profiliranje analize so pokazale globalno downregulation zrelih ravni miRNA v človeških tumorjih v primerjavi z običajnimi tkiva [14]. Poleg tega lahko miRNAs deluje bodisi v zaviralnih ali onkogenih vloge, odvisno od funkcije njihove tarče. Na primer, miR-133b je močno navzdol urejeno v GC tkivih in zavzela zaviralnih vlogo pri GC celic [15]. Izražanje pokoj-337-3p je precej navzdol reguliranih v bezgavkah metastatskim tkiv bolnikov GC, in indukcija miR-337-3p izražanja storil zmanjšanje želodčne karcinom invazijo sposobnosti [16]. miR-25 spodbuja GC napredovanje neposredno downregulating TOB1 izraz; zato povečano izražanje miR-25 predstavlja potencialno neinvazivni biomarker za prognozo GC bolnikov [17]. Poleg tega je miR-7 občutno navzdol reguliranih tako zelo metastatskih GC celičnih linij in metastatskih tkiv. Prekomerno miR-7 močno zavira GC metastaz z usmerjanjem ekspresijo inzulinu podoben rastni faktor-1 receptorja (IGF1R) onkogena [18]. V celičnih linijah GC, ponovna uvedba miR-144 rezultatov izražanja v zatiranju ZFX, ki zmerno poveča občutljivost raka celic za 5-fluorouracilom kemoterapijo. V 93 primerih primarne GC, zmanjšana miR-144 Izraz je povezan s slabo prognozo [19]. Ti primeri so poudarili ključno vlogo miRNAs v GC malignance in napredovanju raka.
V tej študiji smo značilno cilje in določili mehanizem delovanja miR-144 v PK. Z indukcijo zunajmaternično izraz miR-144, smo ugotovili, MET je nov cilj uredbe miR-144. Ta ugotovitev je bila potrjena na obeh mRNA in beljakovin ravni, in reporterski gen luciferazne teste preverjeno direktno vezavo miR-144 regulativnega vezavno mesto v 3'UTR MET. Poleg tega smo ugotovili, da izraz MET obratno korelira 144 MIR-levels v majhno, a dobro dokumentirano GC kohorte. Smo hipotezo, da miR-144 zavira GC metastaze, in da se nekateri tega delovanja posredovana z usmerjanjem MET izraz.
Materiali in metode
primerkov človeških tkiv in celičnih linij
bili vzorci GC zbranih od bolnikov, ki so bili operirani na Fudan University Shanghai Cancer Center med 2012 in 2013 je bil protokol odobrila klinične raziskave etiko odbora z dne Fudan univerze in raziskave je bila izvedena v skladu z določbami Helsinške deklaracije iz leta 1975. Vsi vzorci so bili pridobljeni s privolitvijo informiranega bolnikov. GC celična linija človeških AGS (ATCC® CRL-1739 ™), snu-1 (ATCC® CRL-5971 ™), snu-5 (ATCC® CRL-5973 ™), snu-16 (ATCC® referenčnim laboratorijem Skupnosti za 5974 ™) , NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), in KATO III (ATCC® HTB-103 ™) je ohranila v DMEM, ki vsebuje 10% fetalnega govejega seruma. Vse celične linije smo ohranjali in medijev, ki vsebujejo penicilin (100 ie /ml) in streptomicin (100 mg /ml) pri 37 ° C s 5% CO2. Mirne posnema in inhibitorji so bili kupljeni od Ambion (Austin, TX, ZDA).
Ekstrakcijo RNA in PCR v realnem času
Total RNA je bila vzeta iz celic, ki uporabljajo TRIzola (Invitrogen, Carlsbad, CA). Za analizo miRNA so poli (A) rep dodamo k skupnemu RNA z uporabo poli (A) polimeraza (Ambion, Carlsbad CA) pred reverzne transkripcije. Zaznavanje komplet MiRcute miRNA qPCR (TIANGEN, Peking, Kitajska), je bila uporabljena za kvantitativno raven izražanja miR-144 v skladu s priloženim protokolom. uporabljeni naslednji PCR pogoji so bili: 95 ° C za 30 sekund, čemur sledi 40 ciklov 95 ° C za 5 sekund in 60 ° C za 31 sekund. Količina cilja (MET /miR-144), normalizirano na endogeni vzdrževalni gen GAPDH /U6snRNA in relativno glede na referenčni vzorec, je podana z naslednjo enačbo: količino target = 2- △△ CT
Mikromrežni hibridizacijo.
kratko, RNA vzorci uporabljeni za sintetiziranje dvojno vijačnico komplementarno DNA (cDNA), in dvojno vijačnico cDNA je bila označena in hibridizirali na mikromrežnem (Arraystar, Rockville, MD). Po hibridizacije in pranje, predelane diapozitivi skenirane z Axon GenePix 4000B mikromrež skener (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). vrednost P je bila izračunana z uporabo seznanjenih t-testa. Prag, določen za navzgor in navzdol reguliranih genov je kratno spremembo > 2,0 in p vrednost < 0,05. Hierarhično grozdenje je bila izvedena na podlagi različno izraženih genov in miRNAs uporabo Cluster drevesni programske opreme na Univerzi Stanford (Palo Alto, CA).
Mirna gen omrežje
smo zgradili Susjedstvo omrežja med dvema genov, i in j, ki je opredeljena kot moč v Pearson korelacije med ustrezne gensko izražanje profilov, xi in xj. Sosednosti matrika, M (i, j), smo vizualizirali kot graf, in so bile pregledane topološke lastnosti tega grafa. Da bi vizualno predstavitev, le najmočnejši korelacije (> 0,98), so bili pripravljeni v teh ometi. V miRNA-genskih mrež, vsak gen ustreza vozlišča. Dva gena sta povezana z robom, kar kaže na močno korelacijo. V analizo omrežja, stopnja je najenostavnejši, najbolj pomembno merilo centralnosti gena v omrežju in določa relativni pomen. Diploma je definirana kot število neposredno povezanih sosedov
napoved miR-144 vezavno mesto
so Domnevna miR-144 veznih mest v neprevedene regije MET mRNA 3 'napoveduje program skeniranja (http: //. www.targetscan.org). Položaj 1430-1436 TGO 3 "UTR ima ohranjeno vezavno mesto za miR-144 ciljanje.
Plazmida transfekciji
so ORF sekvence MET pomnožili iz genomske DNA, izolirano iz celične linije snu-5 in nato subklonirali v plenti vektor. Plazmid smo transfektirali v snu-5 celicah z uporabo Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Po 24 urah smo uporabili celice za reševanje eksperiment.
Oligonukleotid transfekciji
MIR-144 posnema, miR-144 inhibitor (anti-miR-144), in MET siRNA (siRNA-MET) smo sintetizirali Genepharma , Šanghaj, Kitajska. Oligonukleotid transfekciji smo izvedli z Lipofectamine 2000 reagenti (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA). Končna koncentracija miR-144 posnema, anti-miR-144 ali siRNA-MET v sistem transfekciji je bila 100 nM. učinkovitost transfekciji za eno- in sočasno transfektirali študijah je bila določena s fluorescenčnim mikroskopom.
imuno
enakovredne zneske celičnih lizatov so razrešili 7% SDS /PAGE in so bile prenesene na poliviniliden fluorida membran. Membrana je bila inkubirana z kunčje poliklonalno protitelo anti-MET (1: 500, abcam, ab47431), kozji poliklonskimi anti-ADAM12 protitelesa (0,3 ug /ml, abcam, ab28747) in kunčje poliklonalno anti-Versican protiteles (1 ug /ml, abcam, ab19345). IRdye označenega sekundarnih protiteles, ki so bili uporabljeni za kvantifikacijo z imuno-signala, signali pa so bili analizirani z uporabo Odyssey skener (LI-COR bioznanosti, Lincoln, NE, ZDA).
RNA-chip testa
RNA-proteinskih interakcij so določene s formaldehidom, in kromatin striženje v kombinaciji z zdravljenjem DNaze da dobimo RNA /proteinskih kompleksov, ki jih lahko imuno s protitelesi, morajo izpolnjevati proteinov. Medsebojne povezave so nato obrnil; RNA predela in ponovno obdelali s DNaze za zagotovitev odsotnosti DNA. RNA oborimo iz imunskega kompleksa nato analizirajo s PCR v realnem času. V tem RNA-chip testom, se uporabi naslednja formula:% vhodne (rekuperacija) = AE (Ct input-Ct vzorec) * Fd * 100%. Tukaj, AE je učinkovitost ojačanja (10 (-1 /nagib)) in Fd je faktor razredčitev vhodni RNA za izravnavo razlike v zneskih RNA-chip vzorca in vhodni RNA, ki se uporabljajo za PCR v realnem času.
luciferaza test
polno MET 3'UTR smo pomnožili s PCR z uporabo snu-5 cDNA kot predlogo in klonirali v nadzorni pGL3 vektor. Uporabili smo Quick Change mutageneze za mutacijo miR-144 domnevnega vezavno mesto (Stratagene, Santa Clara, CA, ZDA). Snu-5 celice in AGS celice so transfekciji s miR-144 posnema /zaviralci in pGL3 luciferaza reporter konstrukti zatočišča za MET 3'UTR. Po 24 urah so bile aktivnosti kresničkino luciferazo in renilla luciferaze v lizatov celic, merjena z Dual-luciferazni test System (Promega, Madison, WI, ZDA).
Migracijske analize
Za transwell migracijskih testih za, 1 x 105 celice zasadimo v zgornji komori, ki vsebuje ne-prevlečenega membrano. Celice smo nanesli v mediju brez seruma, in srednje dopolnjen z 10% (v /v) seruma uporabimo kot chemoattractant v spodnjem prostoru. Celice inkubiramo pri 37 ° C v gojitvenem inkubatorju tkiva s 5% (v /v) CO2. Po 16 urah so brez preseljene celice odstranimo iz zgornjih straneh filtrskih vložkov v transwell membran. So prehajali celic na spodnjih straneh vložkov smo obarvali s Coomassie briljantno modro in preštejemo celice. Preizkus
celic proliferacijo
bili na transficirane celice zasejali v 96 vdolbinami z gostoto 1 x 104 celic /jamico. Testu proliferacije celic smo izvedli s pomočjo štetje celic Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonska), v skladu z navodili proizvajalca. Pred dodatkom CCK-8, so bile celice izperemo s toplim gojišč s predenjem ploščo na 500 rpm za 3 m in nato zavržemo supernatant
premazi
bili naslednji primerji, ki se uporabljajo za PCR v realnem času.: miR-144: 5-TACAG TATAG ATGAT GTACT-3; U6snRNA: 5-CGCAA GGAUG ACACG CAAAU UCGUG AAGCG UUCCA UAUUU UU-3; SKIL naprej primer: 5-GTTAA GCGAA CCTGT ACTTC TGT-3, povratne primer: 5 GTAGG CGACA TGCTT TCTTG G-3; MET naprej primer: 5-GTCGG AGTAG AGCGT CGAGA-3, povratne primer: 5-CAGCG CGATC AGGTA GAGC-3; TOP2A naprej primer: 5-ACCAT TGCAG CCTGT AAATG A-3, reverse primer: 5-GGGCG GAGCA AAATA TGTTC C-3; ADAM12 naprej primer: 5-TCAAC CTGGA TACCC GATTC C-3, reverse primer: 5-GCTCT GTCTG CCGAT GGAG-3; VCAN naprej primer: 5-GTAAC CCATG CGCTA CATAA AGT-3, povratne premaz: 5-GGCAA AGTAG GCATC GTTGA AA-3. Naslednji primerji so bili uporabljeni za popolno uporabo MET 3UTR: 3'UTR MET naprej premaz: 5-TCACT GCCTG ACCTT TA-3, MET 3'UTR reverse primer: 5-ATCAC TTACT CCCAC AAT-3. SiRNA nukleotidov za TGO je bil uporabljen kot sledi: siRNA-MET naprej: 5-GUGCC ACUAA CUACA UUUAU U-3, siRNA-MET obratno. 5-UAAAU GUAGU UAGUG GCACU U-3
Statistična analiza
Rezultate so predstavljene kot sredstvo ± SEM, in podatki, ki so bili analizirani z Studentov t test. Vrednost p < 0.05 smo imeli za statistično značilne.
Rezultati
MicroRNA izraz profil na raka želodca
Primerjava peritonealno metastatski tkiva s seznanjenimi primarno poudarkov vzorcev GC uporabljajo hierarhično analizo grozdenje razkril sistematično spremembo v izražanju miRNAs in genov (Slika 1A in B). Naši podatki kažejo, da je niz miRNAs in genov pogosto odklonsko izražena v peritonealno metastatskih tkiva GC. Poleg tega smo tudi ugotovili, da so nekateri že dobro izkazali molekule, kot so pokoj-7 [18], MIR-25 [17], TOB1 in IGF1R, ni bilo treba opredeliti v naših mikromrež. Mislili smo, da lahko povzročijo raznovrstnost kliničnih vzorcev, te razlike so prišli iz različnih področij. Slika 1 Core miRNA-gen omrežja, vključno z 8 ključnih miRNAs in njihovih ciljev. Hierarhična analiza kopičenje 27 miRNAs (A) in 32 genov (B), ki so bili različno izraženih med metastaznih tkiv peritonealno in parnih primarnih vzorcev GC (večja od 2,0-kratne, p 0.05). Expression vrednosti so prikazane v odtenkih rdeče in zeleno, kar pomeni izraz nad in pod srednjo izražanja vrednosti v vseh vzorcih. (C) miRNA-gen omrežje prikazuje razmerja med 8 ključnih miRNAs in tumorjev, povezanih genov so napovedane za urejanje. Barve označujejo označeni raven izražanja miRNAs in genov.
Mirne-gen-omrežje je sestavljen z namenom prepoznavanja ključnih miRNAs, ki urejajo tumorjem povezan izražanje genov v napredovanje tumorja metastaz. Ker soizražanjem moduli verjetno ustreza biološke poti, smo se osredotočili na soizražanjem modulov, ki so povezani z velikim številom kodiranje proteinskih genov. Poleg tega NCBI RefSeq podrobnosti funkcij mnogih genov, ki prejema pomoč, našo identifikacijo-GC, povezanih genov. S to metodo smo označen vlogo miR-144 v peritonealno metastatskega žarišč GC. V soizražanjem omrežja raka, se miR-144 povezan s 6-kodiranje proteinskih genov, ki so vpleteni v rast tumorja in metastaz (slika 1C).
Predpisani vloga miR-144 želodčnega raka metastaz
Da bi raziskali miR- 144 funkcija, moramo najprej preučiti raven miR-144 v senatu 6 celičnih linij človeških GC. Kot je prikazano na sliki 2A, smo izbrali AGS, označen s molekul miR-144 in snu-5, označen s navzdol reguliranih miR-144, za nadaljnjo raziskavo. Celična linija AGS izvira iz želodca tumorskih fragmentov, ki so bile odstranjenimi od pacienta, ki je prejel nobenega predhodnega zdravljenja, medtem ko je snu-5 izvira iz ascitesa od pacienta s slabo diferenciranega raka želodca. Slika 2 MIR-144 zavira migracije GC celic. Stopnje (A) izraz miR-144 smo preverili v senatu 6 GC humanih celičnih linijah, ki uporabljajo v realnem času PCR metodo. (B) migracije celic snu-5, zdravljenih z miR-144 posnema smo preverili s pomočjo ne-Matrigel obdelano transwell komoro. (C) Migracije AGS celic, ki so se zdravili z zaviralcem miR-144 smo preverili s pomočjo ne-Matrigel obdelano transwell komoro. (*** P < 0,001).
V naši raziskavi smo ugotovili tesno povezavo med miR-144 izgube in metastazami v GC (Slika 1A in C). Temu ustrezno so prejšnje študije dokumentirano zaviranje temelji miR-144 migracij tumorskih celic in invazije na epitelijske ploščatoceličnim karcinomom. Domnevali smo, da je ponovna uvedba miR-144 izražanja bi zavira migracije rakavih celic. Primerno uvajanje miR-144 ekspresijo zaviral migracije celic v snu-5 (slika 2B). V primerjavi s snu-5 AGS celice imajo precej višjo raven endogenega miR-144 ekspresijo. Ni presenetljivo, da zaviranje miR-144 v povečanem priseljevanju AGS celic (slika 2C). Dejansko smo izvedli tudi test invazijo pomočjo-Matrigel obdelan transwell in ni razlike invazivno sposobnost celic snu-5 /AGS po zdravljenih z miR-144 /anti-miR-144 (podatki niso prikazani). Ti rezultati pokazala, da ima miR-144 pomembno vlogo pri prehodu, ne pa v invaziji GC celic.
MiR-144 vpliva na izražanje MET
Z zunajmaternične izražanje miR-144 v 5 snu celic, smo ugotovili ADAM12 , VCAN in MET so domnevni miR-144 ciljev. Kot je prikazano na sliki 3A, miR-144 izraz dramatično vplivalo na ravni mRNA ADAM12, VCAN in MET. ADAM12, VCAN in dosežena raven beljakovin izraz so odkrili tudi prek Western Blot v rakavih celicah transfekciji z miR-144 posnema. Kot je prikazano na sliki 3B, samo MET vsebnosti beljakovin so navzdol reguliranih jih miR-144. To pomeni, da prizadenejo miR-144 MET izraz na transkripcijski ravni, morda s cepljenjem ali destabilizacijo strukturo mRNA. Vendar pa smo ugotovili tudi vsebnosti beljakovin ADAM12 in VCAN niso zmanjšale za eksogeno uvedbo miR-144. Mislili smo, da mRNA in vsebnosti beljakovin ne more biti neposredno povezana zaradi različnih razpolovno dobo. Prav tako menili, da so pokazali, da je lahko posledica prisotnosti miR-144, ki je nenehno zatira prevod v enem primeru ne pa tudi drugi. The Met: interakcija miR-144 se je pokazala tudi v živih celic, ki jih RNA-CHIP testom. V resnici je endogeni miR-144 je dalo povezan z endogenim MET v anti-MET vendar ne anti-IgG immunoprecipitates iz celice (slika 3C). Slika 3 Izražanje MET je urejeno z miR-144. Stopnje (A) mRNA za domnevno miR-144 ciljev so bile pregledane s PCR v realnem času v celicah snu-5 transfekciji z miR-144 posnema ali miR-NC. stopnje (B) Protein iz domnevne miR-144 ciljev so bile pregledane z western blot v celicah snu-5 transfekciji z miR-144 posnema ali miR-NC. (C) V% vhodni Izkoristki reakcij RNA-Chip ponazarja obogatitev s protitelesom MET. RNA-chip test za pokoj-144 izvaja na anti-MET protitelesa iz lizatov celic. RNA-čip z nonrelated IgG služil kot kontrola. (D) Shematski slika predvidene miR-144 vezavnega mesta v 3'UTR MET. (E) snu-5 celice so bile prehodno co-transfekciji s 3'UTR LUC-MET in pokoj-144 posnemajo. (F) AGS celice so bile prehodno co-transfekciji s 3'UTR LUC-MET in inhibitor miR-144. (G) mutacijo v miR-144 vezavno mesto v MET 3'UTR odpravijo miR-144-inducirano supresijo na luciferazno aktivnost. Merimo luciferazno aktivnost po 24 urah in normaliziran sočasno transfektirana Renilla. (* P 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001).
Uporaba osnovi genske-analizo smo ugotovili enoten Mirne vezno mesto za miR-144 v 3 'UTR od MET mRNA (slika 3d). Če želite preveriti, če miR-144 neposredno veže na 3'-UTR za MET mRNA smo izvedli luciferazo reporter testov v snu-5 celic. PCR, ki nastanejo delci MET 3'UTR so vstavili v nadzorni vektorja pGL3 na Xba1 mestu (LUC-MET 3'UTR). Co transfekciji od 3'UTR LUC-MET in miR-144 posnema v snu-5 celic se je znižala luciferazno signala (v primerjavi s pokoj-NC), ki potrjuje, da je vezava miR-144 za 3'UTR srečala neposredna zaviralni učinek (slika 3E). Na hrbtni eksperiment, dosežemo tako, da blokira endogeni miR-144 proizvodnje z miR-144 inhibitor v AGS celic, povzroča vedno večje luciferazno signala (Slika 3F). Mutiral luciferaza reporter na miR-144 vezavno mesto je bila zgrajena tudi (slika 3D). Mutacija Mirne vezivnega mesta ukinjena miR-144-posredovano zaviranje luciferazne aktivnosti (slika 3G). Ti podatki kažejo, da je 1430-1436 položaj MET 3'UTR ključnega pomena za miR-144-posredovane uredbe genov.
MET posreduje MIR-144-inducirano odpornost na migracijo
Uporaba PCR v realnem času, MET stopnje izraženosti smo določili šestih humanih celičnih linijah GC. Kot je razvidno, celične linije z "navzdol reguliranih» MIR-144 ravneh imajo večje količine MET v primerjavi z celičnih linij z "molekul» MIR-144 ravneh (slika 4A). Uporaba neparametrični testi, smo ugotovili velik inverzno povezavo med MET mRNA in miR-144 izražanja v vzorcih GC metastatskih (slika 4b). Slika 4 MET modulacija računov za antimetastatsko učinek miR-144. (A) Western Blot prikazuje izražanje MET v nizu GC humanih celičnih linijah. (B) Pomemben inverzna korelacija je opaziti med izražanjem MIR-144 in se srečal v GC tkiva (n = 52). (C) MET in fosforilirata Akt je bila inhibicija s prisilno izražanje miR-144 ali siRNA-MET. (D, E) Učinki miR-144 ali siRNA-MET o migraciji in orožja so bili določeni v snu-5 celic. (F) MET in fosforilirata Akt bile obnovljene s čezmerni TGO v miR-144 snu-5 celic-posnema zdravljene. (G, H) Učinki miR-144 v kombinaciji z MET-ORF o migraciji in širjenja snu-5 celic. (I) MET in fosforilirata Akt so z blokado miR-144 v AGS celice do regulirane. (J, K) Učinki anti-miR-144 za migracije in proliferacije AGS celic.
Met beljakovin funkcije kot receptor tirozin kinaze in igra ključno vlogo pri spodbujanju celične rasti in migracij s transdukcijo zunajcelični dražljaji do znotrajceličnih signalnih tokokrogov. Pomembna komponenta znotrajcelične signalne strojev je PI3K (fosfoinozitidnih 3-kinaza) pot [20,21]. Ker miR-144 inhibira MET izraz, smo predpostavili, da bi miR-144 na koncu zmanjšala Akt fosforilacijo in aktivacijo z zmanjšano signalizacijo MET. V skladu s tem smo pregledali Akt ravni fosforilacija po miR-144 prekomerno in opazili precejšnje zmanjšanje Akt fosforilacije (slika 4C).
Smo se odločili, da razišče, ali je miR-144-inducirane downregulation MET vplivajo na migracijo tumorskih celic in orožja. Mi transficirali MIR-144 in siRNA za MET (siRNA-MET) v snu-5 celic. Cell migracije so ocenjevali 16 ur po transfekciji ga transwell testu, medtem ko je celična proliferacija določi z CCK-8. Kot je prikazano v slikah 4D in E, transfekcijo z miR-144 migracije blokiranem celic in proliferacijo v primerjavi s kontrolo. Prav tako zmanjšuje MET beljakovin izraz uporablja siRNA zmanjšala tudi migracijo tumorskih celic in razmnoževanje.
Želite ugotoviti, ali je MET kritična mediator učinka MIR-144 je na celični migraciji in orožja, smo zgradili dve MET izrazni vektor. Od katerih vsebuje samo odprt bralni okvir sekvenco gena MET (MET-ORF), in drugi vektor, ki vsebuje celotno dolžino nukleotida gena MET vključno 3'UTR sekvence (dolge MET-polna). Nato smo izvedli Western ANALIZA popivnamo 48 ur po transfekciji MET-ORF /MET-full dolgo v miR-144-posnema zdravijo snu-5 celic (slika 4f). V primerjavi z negativno kontrolno skupino (Empty vektorski), zunajmaternične izraz MET-ORF znatno povečal skupni izraz za TGO in fosforiliranega Akt. Nadalje izraz MET-ORF spodbujati migracije in proliferacijo GC celic (slika 4G in H). Čezmerno MET ukinjena miR-144-inducirane inhibicije migracije celic in orožja. V nasprotju s tem je raven beljakovin TGO in fosforiliranega-AKT v AGS celicah, obdelanih z anti-miR-144 (slika 4I) povečala, in blokiranje miR-144 spodbujati tudi migracijo in proliferacijo AGS celic (Slika 4j in K). Ti rezultati kažejo, da je izpolnjen ključni cilj anti-migracije učinka Mir-144 v GC celic.
Razprava
V tej študiji smo identificirali ne prekrivajo podpisi manjšega števila miRNAs in genov da so odklonsko izražene v peritonealno metastaznih tkivih GC, v primerjavi z paru primarnih tkiva. Analiza miRNA in izražanja genov profilov v miRNA-gene-omrežja opredeljena MIR-144 kot regulator večjih onkogenih poti, kot so širjenje in migracije. GC bolnikih s peritonealno metastazami imeli nižje nivoje izražanja miR-144 kot pri bolnikih brez metastaz. Ta ugotovitev implicira MIR-144 kot potencialni zaviralnih v PK. Poleg tega je miR-144 povezan z mehanizmom metastaz. Naši rezultati ujemajo z rezultati predhodnih študij o vlogi miR-144 v širjenja raka, migracije in invazije [22,23]. miR-144 zavira raka celic metastaze z usmerjanjem A disintegrin in metalo (ADAM) protein družinskega člana ADAMTS5. MicroRNA disregulacijo je povezano s povečano invazivnosti tumorjev in metastaz, pa tudi zmanjšano prognozo bolnikov v nekaterih epitelijskih raka [24]. Nadaljevali smo raziskovali vlogo miR-144 deregulacije v GC. Raziskovali smo vpliv miR-144 izražanja v celične linije, snu-5, kot je značilna nizka izražanje miR-144. Zunajmaternična izraz miR-144 v snu-5 celic rezultatov v globokih sprememb fenotipske, kot je zmanjšal migracij. Obratno poskus blokiral miR-144 ekspresijo, je bila izvedena v celični liniji AGS, ki ima relativno visoko endogene raven miR-144 ekspresijo. Zaviranje miR-144 izražanja povzročilo povečane migracije AGS celic.
Da bi raziskali mehanizem, ki je miR-144-odvisno zmanjšala migracije GC, smo opredelili domnevne cilje za miR-144, kot napovedujejo miRNA gen-omrežja. miR-144 čezmernim lahko zmanjša izražanje MET na ravni mRNA in koncentracije proteina, in ustrezno, luciferazne novinar testi so pokazali, da lahko miR-144 neposredno interakcijo z MET 3'UTR. Nato smo ocenili raven izražanja MET v kohorti 52 bolnikov GC in ugotovila, da se raven miR-144 obratno povezana z izrazom MET. Zaradi tega smo predpostavili, da miR-144 zavira GC tumorigeneze z usmerjanjem izraz MET. MET je opisana tudi kot tarčo za miR-34a /c v drugih celičnih modelih je znano, da spodbujajo gibljivost in invazivno sposobnost tumorskih celic. Čezmerno MET je tesno povezana s tumorsko invazijo in prognozo bolnikov v PK [6]. V GC, MET čezmernim je neodvisen napovedni dejavnik in potencialna tarča drog. Poleg tega lahko MET čezmernim napovedati, kateri bolniki lahko koristi od ciljnega zdravljenja z zaviralci MET, [25]. V naši raziskavi, je izraz MET značilno povezana z razlikovanjem GC, TNM in metastaz [26]. Ugotovili smo, da bi se lahko spremembe v celično proliferacijo in migracijo s miR-144, ki deluje s pomočjo regulacije izražanja MET. miR-144 represija vodi v zvišanje ravni MET, kar lahko pojasni metastaz fenotip miR-144-izčrpanih celic. Zanimivo je, da miR-144 vplivala rast hepatocitov faktor (HGF) signalizacijo. HGF kot ligand MET, lahko povzroči aktivacijo MET v epitelijskih celic. Medtem ko MET overexpression ne more popolnoma obnoviti GC tumorogene lastnosti, so celične migracije GC in širjenje delno obnovljena po prekomerno MET. Zato se lahko miR-144 urediti drugih genov v GC celicah. Predhodne študije so pokazale, da lahko MET inducira GC tumorigeneze preko aktivacije PI3K poti. V tej študiji smo ugotovili, da miR-144 močno oslabljen Akt fosforilacije, in da je Akt fosforilacije popolnoma obnovljena s prekomerno MET. Naše ugotovitve kažejo, da miR-144 ureja Akt fosforilacijo z uredbo TGO v PK.
Skratka, naša študija opredeljena podlaga za zmanjšano stopnjo miR-144 videli v GC metastatskih tkivih. miR-144 je bil prepoznan kot morebitni zaviralnih v PK in je bila povezana z mehanizmi GC metastaz. Poleg tega miR-144 zavira GC tumorigeneze z usmerjanjem MET, nato je PI3K /Akt pot. Da nam je znano, je to prvič miR-144 Dokazano je, da cilj dosežen v GC celicah. Zato lahko nadaljnje študije, ki preučujejo vlogo proti raku miR-144 prispevajo k razvoju novih terapevtskih strategij za GC.
Ugotavlja
junij Liu in Hui Xue prav tako prispevali k temu delu.
IZJAVE
Zahvala
Ta študija je bila podprta z National Natural Science Foundation Kitajske (Grant No. 81201897). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa.
Nasprotujočimi si interesi
Avtorji izjavljajo, da nimajo konkurenčnih interesov. Prispevkov
avtorjev
JL izvajajo študije molekularne biologije. HX pripravila rokopis. JZ izvedli genske analize. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Združenje prisotnosti /odsotnosti in vklop /izklop vzorcih Helicobacter pylori oipA gena z peptičnega in želodca tveganja za nastanek raka: a meta-analysis
• Razmerje med črevesnih hormonov in homeostaze glukoze po bariatric surgery