Mikrornk-144 inhibira metastaziranje karcinoma želuca ciljajući MET izraz

Mikrornk-144 inhibira metastaziranje karcinoma želuca ciljajući susreo izraz pregled apstraktne pregled, rak želuca (GC) i dalje je jedna od najčešćih vrsta malignih karcinoma, a molekularni mehanizam u podlozi njegove metastaze je još uvijek u velikoj mjeri nejasno. MikroRNA su se pojavili kao važni regulatori metastaza zbog njihove sposobnosti da djeluju na više signalnih putova. U našem istraživanju, otkrili smo da Mir-144 je znatno regulirani u oba vrlo metastatskih GC stanicama i tkivima. Rezultati iz oba dobitak-of-funkcije i gubitak-of-funkcije pokusa pokazuju da povećana Mir-144 ekspresija značajno smanjiti migraciju GC stanica, dok je smanjena Mir-144 ekspresije dramatično poboljšana migraciju GC stanica. Met proto-onkogena (MET), koji se često pojačan s rakom u čovjeka i funkcije kao važan regulator staničnog rasta i invazije tumora, identificiran je kao izravan cilj Mir-144. Štoviše, odsutnost MET pomoću male ometa RNA (siRNA) Ponavljaju se protiv metastatskog funkciju Mir-144, dok je vraćanje MET izraz oslabljena funkcija Mir-144 u GC stanicama. Nadalje, utvrdili smo da je Mir-144, ciljajući MET, potiskuje fosforilaciju Akt. Konačno, gledali smo inverznu korelaciju između ekspresije Mir-144 i susreo mRNA u GC metastatskih tkiva. Ukratko, miR-144 potiskuje GC progresiju direktno snižavanje MET izraz koji se zatim sprječava aktivaciju pro-onkogenih Akt puta. Ponovno uvođenje Mir-144 ekspresija u GC stanicama predstavlja atraktivan terapijski pristup blokirati metastaziranje raka želuca. Pregled Ključne riječi pregled mikrornk Mir-144 MET Rak želuca Metastaze Uvod pregled Globalno, rak želuca (GC) je jedan od najčešćih vrsta malignih bolesti. U 2008. godini dijagnosticirano oko 989.600 novih slučajeva GC. Osim toga, GC je bio upleten kao uzrok 738,000 smrtnih slučajeva, što GC četvrti najčešći malignom, a vodeći uzrok smrti od raka u svijetu [1]. Kao što je tumor napreduje, da se razvija sposobnost da napadne okolno tkivo i metastazirati. Receptor faktora rasta hepatocita, MET, je poznato da potiče motiliteta i invazivnu sposobnost tumorskih stanica [2]. MET je član obitelji receptora tirozin kinaze i pokazano je da su doregulirane u mnogim tumorima [3-5]. Pretpostavlja se da MET razina ekspresije se povećava ili genske amplifikacije ili hipoksije preko HIF1α. U bolesnika s metastatskim GC, MET pojačavanje i jake ekspresije proteina nisu rijetki. Ovi događaji čini se da su značajno povezana s nepovoljnim kliničkim ishodom [6]. Oko 10% bijelih pacijenata luka dobitak od pet ili više primjeraka MET. Osim toga, ovaj dobitak u MET broju kopija značajno je povezan s lošom prognozom, [7]. Nadalje, Mir-34a /c mikroRNA dokazano negativno moduliraju MET izraz u staničnim linijama izvedenim od raka prostate, hepatocelularnog karcinoma i GC [8-10].
MikroRNA (miRNAs) su non-kodiranje molekule RNA, otprilike 21-23 nukleotida, koji reguliraju ekspresiju gena na transkripcije ili post-razini transkripcije [11-13]. Mirna izraz profiliranje analize su pokazale globalnu downregulation zrelih razinama Mirne u ljudskim tumorima u odnosu na normalna tkiva [14]. Nadalje, miRNAs može funkcionirati bilo u supresor tumora ili onkogenim ulogu, ovisno o funkciji njihove cilja. Na primjer, Mir-133B je značajno dolje regulirano GC tkiva i uložili svoj tumor supresor ulogu u GC stanicama [15]. Izražavanje Mir-337-3p značajno regulirani u limfnom čvoru metastatskih tkiva GC bolesnika, a indukcija Mir-337-3p izražavanja učinio smanjiti želučanu invazije stanica raka kapacitet [16]. Mir-25 potiče GC progresiju direktno snižavanje izraz TOB1; Stoga, povećana ekspresija Mir-25 predstavlja potencijalnu neinvazivnu biomarkera za prognozu GC bolesnika [17]. Osim toga, Mir-7 značajno regulirani u oba vrlo metastatskih GC staničnim linijama i metastatskih tkiva. Prekomjerna ekspresija Mir-7 značajno inhibira metastaziranje GC ciljajući ekspresiju inzulinu sličan faktor rasta-1 receptor (IGF1R) onkogena [18]. U staničnim linijama GC, Recirkulacija miR-144 ekspresija rezultira represiju ZFX koje umjereno povećava stanica raka podložnost kemoterapijom 5-fluoruracilom. U 93 slučajeva primarnog GC, smanjena Mir-144 ekspresija je povezana s lošom prognozom [19]. Ovi primjeri su istaknuli ključnu ulogu miRNAs u GC kancerogenost i progresiju raka.
U ovoj studiji, naznačen smo ciljeve i definira mehanizam djelovanja Mir-144 u GC. Zbog izazivanja izvanmaterničnu izražavanje Mir-144, otkrili smo MET je novi cilj Mir-144 propisom. Ovaj nalaz je potvrđen s obje mRNA i proteina razinama, a testovi reporter gena luciferaze provjereno izravno vezanje Mir-144 regulatornom veznih mjesta u 3'UTR MET. Nadalje, utvrdili smo da MET izraz obrnuto korelira s Mir-144 razina u malom ali dobro dokumentirane GC skupini. Pretpostavljamo da Mir-144 inhibira GC metastaza, te da su neki od tih inhibicija posredovana ciljajući Met izraz.
Materijali i metode
uzoraka ljudskog tkiva i stanične linije pregled uzoraka GC prikupljene su od pacijenata koji su se podvrgnuli operaciji na Fudan Sveučilišta u Šangaju Cancer Center između 2012. i 2013. protokol je odobren od strane kliničkih istraživanja Etičko povjerenstvo Sveučilišta Fudan, a istraživanje je provedeno u skladu s odredbama Helsinškog deklaracije 1975. Svi uzorci su dobiveni uz informirani pristanak pacijenata. GC linija stanica ljudskog AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL 5974 ™), SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™) , NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™) i KATO III (ATCC® HTB-103 ™) su održavane u DMEM koji sadrži 10% fetalni goveđi serum. Sve stanične linije su održavane u mediju koji sadrži penicilin (100 IU /ml) i streptomicin (100 mg /ml) pri 37 ° C s 5% CO2. Mirne oponaša i inhibitori su kupljeni od Ambion (Austin, TX, USA). Pregled, ekstrakcija RNA i real-time PCR pregled Ukupna RNA se ekstrahira iz stanica pomoću Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Za Mirni analizu, poli (A) rep dodani su ukupne RNA koristeći poli (A) polimeraza (Ambion, Carlsbad, CA) prije reverzne transkripcije. MiRcute Mirna qPCR otkrivanje kit (TIANGEN, Peking, Kina) je korištena kako bi se odredila razina ekspresije Mir-144 u skladu s uvjetom protokola. korištene su slijedeće PCR uvjeti su: 95 ° C za 30 s, a zatim 40 ciklusa od 95 ° C u trajanju od 5 sekundi i 60 ° C tijekom 31 s. Količina mete (MET /mir-144), normalizirana na endogeni domaći gen GAPDH /U6snRNA i u odnosu na referentnu uzorku dobiva pomoću slijedeće jednadžbe: količina target = 2- △△ CT pregled Microarray hibridizacije.
Ukratko, uzorci RNA su korišteni da sintetiziraju dvolančanu komplementarne DNA (cDNA) i dvolančane cDNA označen te hibridizira s mikropolja (Arraystar, Rockville, MD). Nakon hibridizacije i pranja, obrađeni stakalca su skenirani s Axon GenePix 4000B mikropolja skenera (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). P vrijednost je izračunata korištenjem upareni t-test. Prag set za nad- i genima dolje regulirano je fold promjene > 2.0 i p vrijednost < 0.05. Hijerarhijski klastera provedena je na temelju diferencijalno izraženih gena i miRNAs pomoću klaster Treeview softver na Sveučilištu Stanford (Palo Alto, CA). Pregled, Mirna-gen mreža pregled smo konstruirali mreže susjedstvo između dva gena, i i j, definirana kao snaga od Pearson korelacija između odgovarajućih profili genske ekspresije, XI i Xj. Matrice susjedstva, M (i, j), vizualizira kao graf, a ispitani su u topološka svojstva ovog grafa. Da bi vizualni prikaz, samo najjači korelacije (> 0,98) određeno je u tim vizualizacije. U Mirna-gena mrežama, svaki gen odgovara čvor. Dva gena povezani bridom, što ukazuje na jaku korelaciju. Unutar mreže analize, stupanj je najjednostavniji, najvažnija mjera središnje uloge gena unutar mreže i određuje relativnu važnost. Stupanj se definira kao broj izravno povezane susjeda
Predviđanje Mir-144 veznih mjesta pregled, vezna mjesta pretpostavljenim Mir-144 u Met mRNA 3 'netranslatirane regije su predviđen programom cilj skeniranja (http:. //www.targetscan.org). Položaj 1430-1436 of MET 3 'UTR je sačuvano mjesto za vezanje miR-144 ciljanje. Pregled Plazmid transfekciju pregled ORF sekvence MET su amplificirani iz genomske DNA je izolirana iz stanične linije SNU-5, a zatim su supklonirani u plenti vektor. Plazmid je unesen u SNU-5 stanice pomoću Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Nakon 24 sata, stanice su korišteni za eksperiment spašavanja. Pregled Oligonucleotide transfekciju pregled Mir-144 oponaša, miR-144 inhibitor (anti-miR-144), te MET siRNA (siRNA-MET) su sintetizirani Genepharma , Shanghai, China. Oligonukleotid Transfekcija je izvedena s Lipofectamine 2000 reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Konačna koncentracija Mir-144 oponaša, anti-Mir-144 ili siRNA-MET u sustav transfekcije je 100 nm. TRANSFICIRANJE učinkovitost za jednu i kotransficiranih studija određen je fluorescentnim mikroskopom.
Imunoblot pregled ekvivalentne količine stanica lizata su riješeni 7% SDS /PAGE i prebačeni su na membranama polivinilidenfluorid. Membrana se inkubira s zečjim poliklonskim anti-met antitijelo (1: 500, abcam, ab47431) kozjih poliklonalnog anti-ADAM12 antitijela (0,3 ug /ml, abcam, ab28747) i poliklonskog zečjeg anti-versikan protutijela (1 ug /ml, abcam, ab19345). IRdye-obilježena sekundarna antitijela se koriste za određivanje količine imunobloting signala, a signali su analizirani pomoću Odyssey skeneru (Li-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
RNA-Chip testa pregled RNA-protein interakcije fiksirane s formaldehidom i kromatina smicanja se pomiješa s DNase obradom, čime se dobije RNA /proteinskog kompleksa koji se mogu imunoprecipitiran s antitijelima za Met proteina. Cross-linkovi kasnije se poništavaju; RNA se obnovi i ponovno se pomiješa s DNazom kako bi se osiguralo da nema DNA. RNA se taloži iz imunološkog kompleksa zatim se analizira pomoću real-time PCR. U ovom RNA-Chip testu se koristi sljedeća formula:% pretporeza (oporavak) = AE (CT ulazno-Ct uzorak) * Fd * 100%. Evo, AE učinkovitost pojačanje (10 (-1 /nagib)) i Fd je faktor razrjeđenja od ulaznog RNA za ravnotežu razlika u količinama RNA-Chip uzorka i ulazni RNA koristiti za real-time PCR.
luciferaza analitički pregled punog MET 3'UTR se pojačati pomoću PCR korištenjem SNU-5 cDNA kao predloška i kloniran u kontrolnoj pGL3 vektorom. Koristili smo brzo promijeniti mutageneze mutirati Mir-144 pretpostavljenu vezno mjesto (Stratagene, Santa Clara, CA, USA). SNU-5 stanicama i AGS stanice su transfektirane s miR-144 oponaša /inhibitora i pGL3 luciferaze reporter konstrukti koji nose MET 3'UTR. Nakon 24 sata, aktivnosti luciferaze krijesnice i Renilla luciferaze u staničnim lysates su mjereni sa Dual-luciferaze System (Promega, Madison, WI, USA).
Migracije Testovi
Za transjažice migracija testovima, 1 × 105 stanica je stavljeno u gornjem komori koja sadrži membranu neobložene. Stanice su stavljene u medij bez seruma, a medij, uz dodatak 10% (v /v), seruma je korišten kao kemoatraktant u donje komore. Stanice su inkubirane na 37 ° C u inkubatoru za kulture tkiva sa 5% (v /v), CO2. Nakon 16 sati, bez migrirali stanice su uklonjene iz gornjih strana filterskih umetaka Transwell® membranom. Su migrirale Stanice na donjim stranama insertima su obojene sa Coomassie brilliant blue i stanice su izbrojene. Pregled Test stanične proliferacije pregled Stanice su nasađene na ploče s 96 jažica u gustoći od 1 x 104 stanica /dobro. Stanična proliferacija analiza izvedena je pomoću brojanja Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan), u skladu s uputama proizvođača. Prije dodavanja CCK-8, stanice su isprane s toplim mediju kulture vrtnjom ploče pri 500 rpm 3 m, a zatim odbaci supernatant
Početnice pregled sljedeći primeri su korišteni za real-time PCR.: mir-144: 5-TACAG TATAG ATGAT GTACT-3; U6snRNA: 5 CGCAA GGAUG ACACG CAAAU UCGUG AAGCG UUCCA UAUUU UU-3; SKIL naprijed primer: 5 GTTAA GCGAA CCTGT ACTTC TGT-3, obrnuti primer: 5 GTAGG CGACA TGCTT TCTTG G-3; MET naprijed primer: 5 GTCGG AGTAG AGCGT CGAGA-3, obrnuti primer: 5 CAGCG CGATC AGGTA GAGC-3; TOP2A naprijed primer: 5 ACCAT TGCAG CCTGT AAATG A-3, okrenuti primer: 5 GGGCG GAGCA AAATA TGTTC C-3; ADAM12 naprijed primer: 5 TCAAC CTGGA TACCC GATTC C-3, okrenuti primer: 5 GCTCT GTCTG CCGAT GGAG-3; VCAN naprijed primer: 5 GTAAC CCATG CGCTA CATAA AGT-3, zadnji primer: 5 GGCAA AGTAG GCATC GTTGA AA-3. Sljedeći primeri uporabljeni su za punu MET 3UTR primjene: MET 3'UTR Forward primer 5-TCACT GCCTG ACCTT TA-3, MET 3'UTR reverznog primera 5-ATCAC TTACT CCCAC AAT-3. SiRNA nukleotida za MET se koristi na sljedeći način: siRNA-MET naprijed: 5 GUGCC ACUAA CUACA UUUAU U-3, siRNA-MET obrnuto. 5-UAAAU GUAGU UAGUG GCACU U-3 pregled, Statistička analiza pregled, rezultati su prikazani kao srednje vrijednosti ± SEM, a podaci su analizirani Studentov t test. Vrijednost od p < 0,05 smatrala se statistički značajnom.

• Udruga prisutnosti /odsutnosti i za uključivanje /isključivanje obrascima Helicobacter pylori oipA gena s peptičkog ulkusa i želučani rizika od raka: a meta-analysis
• Odnos između crijevnih hormona i homeostazu glukoze nakon bariatric surgery