MicroRNA-144 inhibuje metastázy rakoviny žalúdka zacielením THP výraz

MicroRNA-144 inhibuje metastázy rakoviny žalúdka zacielením MET výraz
abstraktné
rakovinou žalúdka (GC) zostáva jedným z najbežnejších typov rakoviny malígny a molekulárnej mechanizmus je založený jeho metastáz je ešte veľmi nejasné. MikroRNA sa objavili ako dôležité regulátory metastáz, pretože ich schopnosť pôsobiť na niekoľkých signálnych dráh. V našej štúdii sme zistili, že mier-144 je významne downregulated v oboch vysoko metastatických GC bunkových líniách a tkanivách. Výsledky z oboch gain-of-funkcie a so stratou funkcie experimentov ukazujú, že zvýšená MIR-144 expresia významne znižuje migráciu GC bunka, zatiaľ čo sa znížil MIR-144 expresie výrazne zvýšenú migráciu GC buniek. The Met protoonkogenu (MET), ktorý je často amplifikovaná v ľudských nádoroch a funguje ako dôležitý regulátor bunkového rastu a invázie tumoru, bol identifikovaný ako priamy cieľ MIR-144. Okrem toho, umlčanie MET pomocou malej interferujúce RNA (siRNA) zrekapituloval anti-metastatického funkciu Mir-144, zatiaľ čo obnovenie THP výraz tlmí funkciu MIR-144 v GC buniek. Ďalej sme zistili, že mier-144, zacielením THP, potláča fosforylácie Akt. Nakoniec sme pozorovali inverzný koreláciu medzi expresiou Mir-144 a stretol sa mRNA v GC metastatických tkanív. V súhrne možno konštatovať, MIR-144 potláča progresiu GC priamo downregulating THP výraz, ktorý následne zabraňuje aktivácii pre-onkogénne Akt dráhy. Znovuzavedenie Mir-144 expresie v GC buniek predstavuje atraktívny terapeutický prístup k blokovaniu metastázy rakoviny žalúdka.
Kľúčové
microRNA MIR-144 MET Karcinóm žalúdka Metastázy Úvod
Globálne, rakovina žalúdka (GC) je jednou z najrozšírenejších typov malígnych ochorení. V roku 2008 bolo diagnostikovaných približne 989.600 nových prípadov GC. Okrem toho, GC bol zapletený ako príčina úmrtia 738,000, takže GC štvrté najbežnejšie zhubné bujnenie a najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu na celom svete [1]. Ako nádor postupuje, že rozvíja schopnosť napádať okolité tkanivá a metastázovať. Faktora receptora rastového hepatocytov, MET, je známe, že podporujú motilitu a invazívne schopnosť nádorových buniek [2]. MET je členom rodiny receptorov tyrozín kinázy, a bolo preukázané, že up-regulovaná v mnohých nádoroch [3-5]. Predpokladá sa, že MET hladina expresie je zvýšená buď amplifikáciou génu alebo hypoxia, cez HIF1α. U pacientov s metastatickým GC, zosilnenie stretol a silnú expresiu proteínu nie sú časté. sa tieto udalosti, ktoré majú byť spojené s výrazne nepriaznivým klinickým výsledkom [6]. Približne 10% bielych pacientov skrývajú zisk päť alebo viac kópií Met. Navyše tento zisk v MET Počet kópií je významne spojené s nepriaznivou prognózou [7]. Okrem toho majú Mir-34a /c microRNA bolo preukázané, že negatívne modulujú THP expresiu v bunkových líniách odvodených od rakoviny prostaty, hepatocelulárneho karcinómu a GC [8-10].
MikroRNA (miRNA) sú nekódujúca RNA molekuly, približne 21-23 nukleotidov, ktoré regulujú expresiu génu na transkripčný a post-transkripčný úrovni [11-13]. miRNA profilovanie expresia analýzy odhalili globálnej downregulaci zrelých hladín miRNA v ľudských nádoroch v porovnaní s normálnou tkanive [14]. Okrem toho môže miRNA fungovať buď v nádorový supresor alebo onkogénne role, v závislosti od funkcie svojho cieľa. Napríklad, mier-133b bol významne down-regulované v GC tkanivách a pôsobí svojou supresorových úlohu v GC buniek [15]. Expresie MIR-337-3p výrazne downregulated v lymfatických uzlinách metastatických tkanivami pacientov GC, a indukcia Mir-337-3p výraz sa znižuje žalúdočné rakovina invázie buniek kapacity [16]. MIR-25 podporuje progresiu GC priamo downregulating TOB1 pojmu; Preto zvýšená expresia MIR-25 predstavuje možné neinvazívne biomarker pre prognózu chorých GC [17]. Navyše, mier-7 je významne downregulated v oboch vysoko metastatických GC bunkových línií a metastatických tkanív. Nadmerná expresia MIR-7 výrazne inhibuje GC metastáz zameraním expresie inzulínu podobný rastový faktor-1 receptor (IGF1R) onkogénu [18]. V bunkových líniách GC, Opätovné zavedenie MIR-144 expresie vedie k represii ZFX, čo mierne zvyšuje citlivosť buniek karcinómu na 5-fluóruracilu chemoterapie. V 93 prípadoch primárnej GC, zmenšil MIR-144 expresie bola spojená so zlou prognózou [19]. Tieto príklady zdôraznili kľúčovú úlohu miRNA v GC malignance a progresii rakoviny.
V tejto štúdii sme sa vyznačuje ciele a definoval mechanizmus účinku Mir-144 v GC. Vyvolaním mimomaternicové expresie MIR-144, sme objavili MET je nový terč MIR-144 regulácia. Tento nález bol potvrdený na oboch úrovniach mRNA a bielkovín, a reportér gén Luciferase testy overené Priama väzba MIR-144 na regulačné väzbové miesta 3'UTR THP. Ďalej sme zistili, že MET výraz nepriamo koreluje s MIR-144 úrovní v malej, ale dobre zdokumentované GC kohorty. Predpokladáme, že mier-144 inhibuje GC metastáz, a že niektoré z tejto inhibícia je sprostredkovaná zacielenie na MET výrazu.
Materiály a metódy
vzorky ľudských tkanív a bunkových línií
boli vzorky GC získané od pacientov, ktorí podstúpili chirurgický zákrok na Fudan University v Šanghaji Cancer Center medzi 2012 a 2013 bol protokol schválený Clinical Research etickou komisiou Fudan University, a Výskum bol vykonaný v súlade s ustanoveniami Helsinskej deklarácie z roku 1975. Všetky vzorky boli získané s informovaným súhlasom pacientov. Ľudská GC bunkové línie AGS (ATCC ® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC ® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC ® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC ® CRL-5974 ™) , NCI-N87 (ATCC ® CRL-5822 ™), a KATO III (ATCC ® HTB-103 ™) boli udržiavané v DMEM obsahujúcom 10% fetálneho hovädzieho séra. Všetky bunkové línie boli udržiavané v médiu obsahujúcom penicilín (100 IU /ml) a streptomycínom (100 mg /ml) pri 37 ° C s 5% CO2. Mierny napodobňuje a inhibítory boli získané od firmy Ambion (Austin, TX, USA).
Extrakcia RNA a PCR v reálnom čase
Celková RNA bola extrahovaná z buniek za použitia TRIzolu (Invitrogen, Carlsbad, CA). Pre analýzu miRNA, poly (A) chvosty boli pridané k celkovej RNA s použitím poly (A) polymerázy (Ambion, Carlsbad, CA) pred reverznej transkripciou. Detekčná súprava MiRcute miRNA qPCR (TIANGEN, Beijing, Čína) bol použitý pre kvantifikáciu hladín expresie Mir-144 v závislosti od poskytovanej protokolu. Boli použité nasledujúce PCR podmienky: 95 ° C počas 30 s, nasleduje 40 cyklov 95 ° C počas 5 sekúnd a 60 ° C počas 31 s. Množstvo cieľ (MET /MIR-144), normalizované na endogénne housekeeping génu GAPDH /U6snRNA a relatívnym vzhľadom na referenčný vzorke sa vypočíta podľa nasledujúcej rovnice: množstvo cieľovej = 2- △△ CT
Microarray hybridizácia.
V stručnosti, vzorky RNA boli použité k syntéze dvouřetězcové komplementárna DNA (cDNA), a dvouřetězcová cDNA bol označený a hybridizován na mikromaticový (Arraystar, Rockville, MD). Po hybridizácii a premývanie, spracované sklíčka boli skenované pomocou Axon GenePix 4000B microarray skener (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). P hodnota bola vypočítaná s použitím párového t-testu. Limit stanovený pre hore a dole regulované gény bol krát zmena > 2,0 a hodnota p < 0.05. Hierarchické zhlukovanie bola vykonaná na základe odlišne exprimovaných génov a miRNA s použitím Cluster TREEVIEW softvér zo Stanfordovej univerzity (Palo Alto, CA).
Mirna-gen sieť
sme zostrojil siete přilehlost medzi dvoma génmi, I a J, definované ako sila korelácie Pearson medzi zodpovedajúce génovej expresie profily, XI a XJ. Matica susednosti, M (i, j), bol vizualizovaný ako graf, a boli skúmané topologické vlastnosti tohto grafu. Ak chcete vizuálnu reprezentáciu, len tí najsilnejší korelácia (viac ako 0,98) boli čerpané v týchto omietok. V miRNA-génu sietí, každý gén zodpovedá uzla. Dva gény sú spojené hranou, čo ukazuje na silnú koreláciu. V rámci sieťovej analýzy, miera je najjednoduchšie, najdôležitejším opatrením pre ústredný význam génu v sieti a určuje relatívnu dôležitosť. Stupeň je definovaný ako počet priamo spojených susedných
predikcie MIR-144 väzobné miesto
väzbové miesta Predpokladané Mir-144 v netranslatované oblasti mRNA THZ, 3 'bolo predpovedané programom Target Scan (http: //. www.targetscan.org). Pozícia 1430-1436 MET 3 'UTR má konzervovanú väzobné miesto pre mier-144 cielenie.
Plasmid transfekciu
ORF sekvencie Met bol amplifikovaný z genómovej DNA izolovanej z bunkovej línie SNU-5 a potom boli subklonovány do Plenty vektora. Plazmid bol transfekován do SNU-5 buniek za použitia Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Po 24 hodinách boli bunky použité pre záchranu experimentu.
Oligonukleotidy transfekcia
MIR-144 napodobňuje, MIR-144 inhibítor (anti-MIR-144), a MET siRNA (siRNA-MET) boli syntetizované Genepharma , Shanghai, Čína. Oligonukleotid transfekcia bola vykonaná s reagenciami Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Konečná koncentrácia MIR-144 napodobenín, anti-MIR-144 alebo siRNA-MET v transfekčního systému bola 100 nM. Účinnosť transfekcia pre jedno a ko-transfekovány štúdiách bola stanovená fluorescenčným mikroskopom.
Imuno-blottingom
ekvivalentné množstvo bunkových lyzátov boli rozdelené o 7% SDS /PAGE a boli prenesené na PVDF membrány. Membrána bola inkubovaná s králičie polyklonálne anti MET protilátkou (1: 500, abca, ab47431), čo je kozie polyklonálne anti-ADAM12 protilátky (0,3 ug /ml, abca, ab28747) a králičie polyklonálne anti-Versican protilátkou (1 ug /ml, abca, ab19345). IRdye značené sekundárne protilátky boli použité pre kvantifikáciu imunoblotu signálu a signály boli analyzované pomocou skenera Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
RNA-chip test
interakcií RNA-proteín sú stanovené s formaldehydom, a chromatín strihanie v kombinácii s liečbou DNázy, čím sa získa RNA /proteínové komplexy, ktoré môžu byť imunoprecipitovány protilátkami na Met proteínov. Krížové odkazy sú následne obráti; RNA sa oddelí a znovu sa spracuje s DNázy, aby bola zaistená neprítomnosť DNA. RNA sa vyzráža z imunitného komplexu a potom analyzované real-time PCR. V tomto RNA-Chip teste nasledujúci vzorec použiť:% vstupného (obnova) = AE (Ct-Ct vstup vzorka) * Fd * 100%. Tu AE je účinnosť zosilnenie (10 (-1 /sklon)) a Fd je faktor riedenia vstupného RNA na vyrovnanie rozdielu v množstve RNA-chip vzorky a vstupné RNA používaných pre real-time PCR.
Luciferase assay
plné o THZ 3 'UTR bol amplifikovaný pomocou PCR s použitím SNU-5 cDNA ako templátu a klonovaný do riadiaceho pGL3 vektora. Použili sme Quick Change mutagenéza k mutácii domnelú väzobné miesto MIR-144 (Stratagene, Santa Clara, CA, USA). SNU-5 bunky a AGS bunky boli transfekovány s Mir-144 /napodobňuje inhibítorov a pGL3 luciferázy reportér konštrukty nesúci MET 3 'UTR. Po 24 hodinách aktivity luciferázy svetlušky a Renilla luciferázy v bunkových lyzátov bola meraná s Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA).
Migrácia testy
Pre testy Transwell migračných, 1 x 105 bunky boli umiestnené v hornej komore obsahujúcej non-membrána. Bunky boli nanesené v médiu bez séra a doplnenom 10% (v /v) séra bol použitý ako chemoatraktantu v dolnej komore. Bunky boli inkubované pri 37 ° C v inkubátore na kultiváciu tkanív s 5% (objem /objem) CO2. Po 16 hodinách, non-migrovaných buniek boli odstránené z horných stranách filtračných vložiek Transwell membrány. Migrované bunky na spodných stranách vložky boli zafarbené Coomassie brilantná modrá, a bunky boli spočítané.
Cell Test proliferácie
Transfekované bunky boli nasadené na 96-jamkové doštičky v hustote 1 x 104 buniek /jamku. Testu proliferácie buniek sa vykonáva za použitia Cell počítanie Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonsko) v súlade s pokynmi výrobcu. Pred pridaním CCK-8, boli bunky premyté teplým médiu kultúry otáčaním doska pri 500 otáčkach za minútu po 3 m, a potom odstránenie supernatantu
náter
Tieto priméry boli použité pre PCR v reálnom čase .: MIR-144: 5-TACAG TATAG ATGAT GTACT-3; U6snRNA: 5-CGCAA GGAUG ACACG CAAAU UCGUG AAGCG UUCCA UAUUU UU-3; SKIL dopredný primer: 5-GTTAA GCGAA CCTGT ACTTC TGT-3, reverzné primer: 5 GTAGG CGACA TGCTT TCTTG G-3; MET dopredný primer: 5-GTCGG AGTAG AGCGT CGAGA-3, reverzné primer: 5-CAGCG CGATC AGGTA Gagcom-3; Top2 dopredný primer: 5-ACCAT TGCAG CCTGT AAATG A-3, reverzné primer: 5-GGGCG Gagcom AAATA TGTTC C-3; ADAM12 dopredný primer: 5-TCAAC CTGGA TACCC GATTC C-3, reverzné primer: 5-GCTCT GTCTG CCGAT GGAG-3; VCAN dopredný primer: 5-GTAAC CCATG CGCTA CATA AGT-3, reverzné primer: 5-GGCAA AGTAG GCATC GTTGA AA-3. Tieto priméry boli použité pre plné uplatnenie MET 3UTR: MET 3 'UTR dopredný primer: 5-TCACT GCCTG ACCTT TA-3, MET 3'UTR reverzné primer: 5-ATCAC TTACT CCCAC AAT-3. Sírne nukleotidov o THP bola použitá takto: siRNA-MET vpred: 5 GUGCC ACUAA cuaca UUUAU U-3, siRNA-MET vzad :. 5-Uááá guage UAGUG GCACU U-3
Štatistická analýza výsledkov
sú uvedené ako priemer ± SEM, a dáta boli analyzované pomocou Studentov testu. Hodnota p < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú.
Výsledky
microRNA profil expresie v karcinómu žalúdka
porovnaní peritoneálnych metastatických tkanív párovaných vzoriek primárneho ložiska GC za použitia hierarchickej zoskupovanie analýzy odhalili systematické rozdiely v expresiu miRNA a génov (Obr 1A a B). Naše údaje naznačujú, že sada miRNA a génov je často aberantne vyjadruje v peritoneálnych metastatických tkanív GC. Okrem toho sme tiež zistili, že niektoré doteraz dobre osvedčili molekuly, ako sú MIR-7 [18], Mir-25 [17], TOB1 a IGF1R, neboli byť identifikovaný v našich čipov. myslel, že sme tieto rozdiely môžu byť indukovaná rozmanitosť klinických vzoriek pochádzajú z rôznych oblastí. Obrázok 1 Jadro miRNA-gen sieť, vrátane 8 kľúčových miRNA a ich cieľov. Hierarchickej analýza zhlukovaniu 27 miRNA (A) a 32 génov (B), ktoré boli odlišne exprimovaných medzi metastazujúcich tkanivami v peritoneálnej a párových primárnych vzoriek GC (vyššia ako 2,0-krát, p menšie ako 0,05). hodnoty expresie sú zastúpené v odtieňoch červenej a zelenej, čo znamená výraz nad a pod strednej hodnote výrazu naprieč všetkými vzorkami. (C) Mirna-gen sieť ukazuje vzťahy medzi 8 kľúčových miRNA a gény súvisiace s nádorom sú predpokladaných regulovať. Farby označujú poznámkami úrovne expresie miRNA a génov.
Mierne-gen-sieť bol zostavený s cieľom identifikovať kľúčové miRNA, ktoré regulujú expresiu génov, vyjadrujúcim tumor asociované pri progresii nádorových metastáz. Vzhľadom k tomu, koexprese moduly pravdepodobne zodpovedajú biologických dráh, sme sa zamerali na koexpresi moduly, ktoré sú spojené s vysokým počtom génov kódujúcich proteíny. Okrem toho, Detaily NCBI RefSeq funkcie mnohých génov, ktoré podporovaný našej identifikácii génov, GC-spojené. Pomocou tejto metódy sme vyznačujúci úlohu Mir-144 v peritoneálnej metastatického ložísk GC. V Koexprese siete rakoviny, MIR-144 je pripojený na 6 génov kódujúcich proteíny, ktoré sa podieľajú na raste nádoru a metastázy (obrázok 1C).
Regulačný úlohu Mir-144 v žalúdku nádorových metastáz
Pre zistenie, spätných 144 funkcie, najprv skúmané hladiny Mir-144 v paneli 6 ľudských bunkových línií GC. Ako je ukázané na obrázku 2A, sme vybrali AGS, vyznačujúci sa up-regulovaná MIR-144, a SNU-5, vyznačujúci sa downregulated MIR-144, k ďalšiemu štúdiu. Bunková línia bola odvodená od AGS žalúdočné nádorových fragmentov, ktoré boli po resekcii z pacienta, ktorý dostal žiadne predchádzajúce terapiu, zatiaľ čo SNU-5 bol odvodený z ascites pacienta s zle diferencované karcinómu žalúdka. Obrázok 2 MIR-144 potláča migráciu GC buniek. hladiny (A) Expresia MIR-144 boli testované v paneli 6 ľudských GC bunkových línií za použitia real-time PCR metódy. (B) Migrácia SNU 5-buniek ošetrených s Mir-144 napodobenín bola kontrolovaná pomocou no-Matrigelu ošetreného transjamkových komory. (C) Migrácia AGS buniek ošetrených inhibítorom MIR-144 bola kontrolovaná za použitia ne-Matrigelu ošetrené transjamkových komory. (*** P < 0,001).
V našej štúdii sme pozorovali blízky vzťah medzi MIR-144 strát a metastáz v GC (obr 1A a C). Zodpovedajúcim spôsobom, skoršie štúdie dokumentovali MIR-144 založený na inhibíciu migrácie a invázie nádorových buniek do epiteliálne karcinóm z dlaždicových buniek. Predpokladali sme, že opätovné zavedenie MIR-144 prejavu by potlačiť migráciu nádorových buniek. Vhodne, zavedenie MIR-144 expresie inhibuje migráciu buniek v SNU-5 (obrázok 2B). V porovnaní s SNU-5, AGS bunky majú relatívne vyššiu úroveň endogénnej expresie MIR-144. Nie je prekvapením, že inhibícia MIR-144 vzrástol AGS migráciu buniek (obrázok 2c). V skutočnosti sme tiež vykonali inváziu analýzu s použitím Matrigelu ošetreného Transwell, a nie je žiadny rozdiel pre invazívne schopnosť SNU-5 /AGS buniek po ošetrených MIR-144 /anti-MIR-144 (dáta nie sú ukázaná). Tieto výsledky ukázali, že mier-144 hrá dôležitú úlohu v migrácii, ale nie v invázii GC buniek.
MIR-144 ovplyvňuje o STH výraz
Prostredníctvom ektopickej expresie Mir-144 v SNU-5 bunkách, sme zistili, ADAM12 , VCAN a MET sú domnelé MIR-144 ciele. Ako je znázornené na obrázku 3A, mier-144 expresie dramaticky ovplyvnené hladiny mRNA ADAM12, VCAN a stretol. boli tiež zistené ADAM12, VCAN a MET expresné hladiny proteínu pomocou Western blotting v nádorových bunkách transfekciou MIR-144 napodobenín. Ako je znázornené na obrázku 3B, len MET množstvo bielkoviny boli downregulated Mir-144. To ukazuje, že mier-144 ovplyvňuje THZ expresie na transkripčný úrovni, možno prostredníctvom štiepením alebo destabilizácii štruktúry mRNA. Avšak sme tiež zistili, že množstvo bielkoviny ADAM12 a VCAN nie sú znížila o exogénnym zavedením MIR-144. Mysleli sme si, že mRNA a množstva bielkoviny nemôžu byť priamo korelovaný z dôvodu odlišného polčasu. Tiež sme si, že ukázal, že môže byť v dôsledku prítomnosti MIR-144, ktorý bol neustále potláčať preklad v jednom prípade, ale nie iným. MET: Mir-144 interakcie sa preukázal aj v živých bunkách pomocou RNA-CHIP testu. V skutočnosti endogénnej MIR-144 bolo zistené spojená s endogénnou THP v anti-splnené, ale nie anti-IgG imunoprecipitáty z buniek (obrázok 3C). Obrázok 3 Expresia MET bola upravená MIR-144. hladiny (A) mRNA putativní MIR-144 ciele boli skúmané pomocou real-time PCR v SNU-5 buniek transfektovaných s Mir-144 napodobňuje alebo MIR-NC. hladiny (B) Proteínové putativní MIR-144 ciele boli skúmané metódou Western blotting v SNU-5 buniek transfektovaných s Mir-144 napodobňuje alebo MIR-NC. (C) V% Vstupný výťažnosti reakcií RNA-chip ilustruje obohatenie Met protilátky. RNA-Chip test pre mier-144 prebieha na proti-Met protilátky z rozrušených buniek. RNA-Chip s nonrelated IgG slúžila ako kontrola. (D) Schematický obrázok predpokladané väzbového miesta MIR-144 v 3 'UTR THP. (E) SNU-5 bunky boli prechodne kotransfekovány LUC MET 3 'UTR a mier-144 napodobňovať. (F) AGS bunky boli prechodne kotransfekovány LUC MET 3 'UTR a inhibítora MIR-144. (G) mutujúce väzbového miesta MIR-144 Met 3 'UTR zrušený MIR-144-indukovanej potlačenie aktivity luciferázy. Aktivita Luciferase sa meria po 24 hodinách a normalizovať na ko-transfekovány Renilla. (* P 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001). For S bioinformatických na základe analýzy sme identifikovali jedným väzbové miesto pre miRNA MIR-144 v 3 'UTR MET mRNA (obrázok 3D). Ak chcete otestovať, či MIR-144 sa priamo viaže na 3'-UTR Met mRNA, sme vykonali luciferázové reportéri testy v SNU-5 buniek. PCR-fragmenty odvodené z meteorologických 3 'UTR boli vložené do kontrolným vektorom pGL3 v Xba1 mieste (LUC-MET 3' UTR). Ko-transfekcia LUC MET 3 'UTR a Mir-144 v napodobňuje SNU-5 bunkách má za následok zníženie Signál luciferázy (v porovnaní s Mir-NC), čo potvrdzuje, že väzba Mir-144 na 3' UTR THP má priamy inhibičný účinok (obrázok 3E). Rubová experiment, vykonaná tak, že blokuje produkciu endogénnej MIR-144 s inhibítorom Mir-144 v bunkách AGS, viedlo k zvýšeniu signálu luciferázy (obr 3F). Zmutovaný luciferázy reportér na väzobnom mieste Mir-144 bol tiež konštruovaný (obrázok 3D). Mutácie väzbového miesta miRNA zrušená MIR-144-sprostredkovanú inhibíciu luciferázové aktivity (obrázok 3G). Tieto údaje naznačujú, že poloha MET 3'UTR 1430-1436 je rozhodujúca pre mier-144-sprostredkovanej génovej regulácie.
MET sprostredkováva MIR-144-indukovaný odpor k migrácii for S real-time PCR, sa stretol expresné hladiny boli stanovené pre šesť bunkových línií ľudského GC. Ako je znázornené, bunkové línie s "downregulated" úrovni Mir-144 majú vyššie množstvo trhového zaobchádzanie v porovnaní s bunkovými líniami s "up-regulované" úrovni Mir-144 (obr 4A). Použitie Neparametrické testy sme zistili významný inverzný koreláciu medzi THP, mRNA a expresie Mir-144 vo vzorkách GC metastatických (Obrázok 4B). Obrázok 4 MET modulácie zodpovedá za antimetastázové účinnosti MIR-144. (A) ukazuje Western blot o THP expresiu v sade ľudských GC bunkových línií. (B) Významný inverzná korelácia je pozorovaná medzi úrovňou expresie Mir-144 a stretli v GC tkanivách (n = 52). (C) MET a fosforylovaného Akt boli inhibované nútené expresie MIR-144 alebo siRNA MET. (D, E) Účinky MIR-144 alebo siRNA-sa stretol na migráciu a proliferáciu boli stanovené v SNU-5 buniek. (F) MET a fosforylovaného Akt boli obnovené nadmernou expresiou stretli v Mir-144 SNU-5 článkov napodobňuje ošetrené. (G, H) Účinky MIR-144 v kombinácii s met-ORF o migrácii a proliferáciu SNU-5 buniek. (I), MET a fosforylovaného Akt bola up-regulovaná tým, že blokuje Mir-144 v bunkách AGS. (J, K) Účinky anti-MIR-144 pre migráciu a proliferáciu buniek AGS.
Proteínu funkcie splnená ako receptor tyrozínkinázy a hrá kľúčovú úlohu v podpore bunkového rastu a migrácia zo strany prevádzajúcej extracelulárnej podnety k intracelulárnych signálnych obvodov. Prominentný súčasťou intracelulárnym signálnym stroja je PI3K (fosfoinositid 3-kináza) cesta [20,21]. Vzhľadom k tomu, Mir-144 inhibuje MET výraz, my sme predpokladali, že mier-144 by mohla v konečnom dôsledku znížiť Akt fosforyláciu a aktiváciu cez znížil o THP signalizácie. V dôsledku toho sme sa zaoberali Akt úrovne fosforylácie po MIR-144 nadexpresiou a pozorovať výrazný pokles Akt fosforylácie (obrázok 4C).
Rozhodli sme sa preskúmať, či MIR-144 indukovanú MET zníženie expresie malo vplyv na migráciu a proliferáciu nádorových buniek. transfekovány sme Mir-144 a siRNA pre THP (siRNA MET) v SNU-5 buniek. Migrácia buniek bola hodnotená 16 hodín po transfekciu podľa transwell testu, pričom proliferácia buniek bola stanovená pomocou CCK-8. Ako je znázornené na obrázkoch 4D a E, transfekcia s Mir-144 inhibuje migráciu a proliferáciu buniek v porovnaní s kontrolou. Rovnako tak klesá o THP expresie proteínu pomocou siRNA tiež znížil migráciu a proliferáciu nádorových buniek.
Ak chcete zistiť, či MET je kritický mediátor účinku MIR-144 je na bunkovej migrácie a proliferácie, sme vybudovali dva sa stretol expresný vektor. Z ktorých jedna obsahuje len otvoreného čítacieho rámca sekvencie Met génu (MET-ORF), a druhý vektor obsahuje celú dĺžku nukleotid Met génu, vrátane 3 'UTR sekvencie (MET-plne dlhý). Potom sme Vykonaná analýza westernovým prenosom 48 hodín po transfekciu MET-ORF /MET-full dlho do MIR-144 napodobňuje ošetrené SNU-5 bunkách (obr 4F). V porovnaní s negatívnou kontrolnou skupinou (prázdny vektor), ektopická expresia Met-ORF významne zvyšuje celkové expresiu v trhovom hospodárstve a fosforylovanej Akt. Okrem toho, expresia Met-ORF podporoval migráciu a proliferáciu GC buniek (Obrázok 4G a H). Nadmerná expresia MET zrušil MIR-144-indukovanú inhibíciu migrácie a proliferácie buniek. Na rozdiel od toho hladiny proteínu v trhovom hospodárstve a fosforylovaného-Akt zvyšuje v AGS buniek ošetrených anti-MIR-144 (obr 4I), a blokovanie MIR-144 tiež podporoval migráciu a proliferáciu AGS buniek (obr 4j a K). Tieto výsledky naznačujú, že MET je rozhodujúci cieľ pre anti-migračné účinku MIR-144 v ľudských bunkách GC.
Diskusia
V tejto štúdii sme identifikovali neprekrývajúcich podpisy malého počtu miRNA a gény ktorá aberantne vyjadruje v peritoneálnej metastatických tkanív GC, v porovnaní s párových primárnych tkanív. Analýza miRNA a profilov génovej expresie v miRNA gén siete identifikované MIR-144 ako regulátor veľkých onkogénnych ciest, ako je proliferácia a migrácia. Pacienti GC peritoneálnej metastázy mali nižšie hladiny expresie MIR-144 ako u pacientov bez metastáz. Toto zistenie implikuje MIR-144 ako potenciálny nádorový supresor v GC. Okrem toho, mier-144 je spojená s mechanizmami metastáz. Naše výsledky korešpondujú s výsledkami predchádzajúcich štúdií o úlohe Mir-144 v šírení rakoviny, migrácia a invázia [22,23]. MIR-144 inhibuje rakovinové bunky metastáz zacielením A disintegrin a člen ADAMTS5 metaloproteinázy (ADAM) proteín rodiny. MicroRNA dysregulácia je spojená so zvýšenou nádorové invazívnosti a metastáz, rovnako ako zníženie prognózy pacientov v určitých epiteliálnych nádorov [24]. Ďalej sme skúmali úlohu MIR-144 deregulácie v GC. Študovali sme vplyv MIR-144 expresie v bunkovej línii SNU-5, ako je charakterizovaný nízkou expresiou MIR-144. Ektopická expresia Mir-144 v SNU-5 bunkách vedie k hlbokej zmeny fenotypu, ako je napríklad znížila migrácia. Rubová experiment, blokovanie expresie MIR-144, bola vykonaná na bunkovej línii AGS, ktorý má relatívne vysokú úroveň endogénnej MIR-144 expresie. Inhibícia expresie MIR-144 viedlo k zvýšenej migrácii AGS buniek.
Pre skúmanie mechanizmu Mir-144 v závislosti na znížila migrácie GC, sme identifikovali predpokladané ciele pre mier-144, ako predpokladá miRNA gén siete. MIR-144 nadmerná expresia môže znížiť o THP expresiu na úrovni mRNA a nízka hladina bielkovín, a zodpovedajúcim spôsobom, luciferázové reportéri testy bolo zistené, že mier-144 sa môže priamo interagovať s MET 3 'UTR. Potom sme hodnotili úrovne expresie stretol v kohorte 52 pacientov GC a zistili, že hladiny MIR-144 je nepriamo úmerná na Met expresiu. Z tohto dôvodu sme predpokladali, že mier-144 inhibuje GC tumorigenezi zacielením o THP výraz. MET bola tiež opísaná ako cieľ MIR-34a /c v iných bunkových modeloch, a je známe, že podporujú motilitu a invazívne schopnosť nádorových buniek. Nadmerná expresia MET je úzko koreluje s nádorovú inváziu a prognózu pacienta v GC [6]. V GC MET nadmerná expresia je nezávislý prognostický faktor a potenciálne cieľové drog. Okrem toho MET nadmerná expresia môže predpovedať, ktorí pacienti môžu mať prospech z cielenej terapie s ACE THP [25]. V našej štúdii MET expresie bola významne spojená s GC diferenciáciu, TNM a metastáz [26]. Zistili sme, že zmeny v bunkovej proliferácii a migrácii cez Mir-144 by mohol byť vyvíjaný prostredníctvom regulácie MET prejavu. MIR-144 represia vedie k zvýšeným hladinám splnená, čo môže vysvetľovať metastázy fenotyp MIR-144-vyčerpaných buniek. Je zaujímavé, že mier-144 ovplyvňoval rastový faktor hepatocytov (HGF) signalizáciu. HGF, ako ligand THP, môžu indukovať aktiváciu STH v epiteliálnych bunkách. Kým MET nadmerná expresia nemohla úplne obnoviť GC tumorigénny vlastnosti, GC migráciu a proliferáciu buniek boli čiastočne obnovené po THP zvýšenou expresiou. Preto môže MIR-144 reguláciu ďalších génov v GC buniek. Predchádzajúce štúdie ukázali, že MET môže vyvolať GC tumorigenezi prostredníctvom aktivácie PI3K dráhy. V tejto štúdii sme zistili, že mier-144 podstatne zmiernený Akt fosforylácie, a že Akt fosforylácia bola úplne obnovená s nadmernou expresiou MET. Naše výsledky naznačujú, že mier-144 reguluje Akt fosforylácie prostredníctvom regulácie ohľadom zaobchádzanie ako v GC.
Na záver, naše štúdie identifikovala základ pre zníženou hladinou MIR-144 vidieť na GC metastatických tkanív. MIR-144 bol identifikovaný ako potenciálny nádorový supresor v GC a bolo spojené s mechanizmami GC metastáz. Okrem toho, mier-144 inhibuje GC tumorigenezi zacielením THP, a následne, PI3K /Akt dráhy. Pokiaľ je nám známe, toto je prvýkrát, mier-144 bolo preukázané, že cieľ v trhovom hospodárstve v GC buniek. Preto sa ďalšie štúdie skúmajúce protirakovinové úlohu MIR-144 môžu prispieť k vývoju nových terapeutických stratégií pre GC.
Poznámky
júna Liu Hui a Xue prispeli rovnakou mierou na tejto práci.
Deklarácia
Poďakovanie
Táto štúdia bola podporovaná národná prírodná Science Foundation Číny (Grant No. 81201897). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo príprave rukopisu.
Protichodnými záujmami
Autori vyhlasujú, že nemajú žiadne protichodné záujmy. Príspevky
autori '
JL vykonala štúdie molekulárnej biológie. HX navrhol rukopis. JZ vykonal bioinformačných analýzy. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Združenie prítomnosti /neprítomnosti a zapnutie /vypnutie vzoroch Helicobacter pylori oipA génu s vredovým ochorením a žalúdočných rizík vzniku rakoviny: a meta-analysis
• Vzťah medzi črevné hormóny a homeostázy glukózy po bariatrickej chirurgie