MicroRNA-144 slopina skrandžio vėžio metastazių nukreipiant RER išraiška

MicroRNA-144 slopina skrandžio vėžio metastazių nukreipiant RER išraišką
tezės
skrandžio vėžio (GC) išlieka viena iš labiausiai paplitusių rūšių piktybinio vėžio, ir molekulinis mechanizmas grindžiamas jo metastazių yra vis dar labai neaiški. Mikro RNR iškilo kaip svarbius reguliatoriai metastazių, nes jų gebėjimo veikti keliuose signalizacijos būdus. Mūsų tyrimo duomenimis, mes nustatėme, kad Pasaulis-144 yra gerokai downregulated tiek labai metastazavusiu GC ląstelių linijų ir audiniuose. Rezultatai nuo tiek pelnas-ir-funkcijos ir netekus funkcijos eksperimentų rodo, kad padidėjo Pasaulis-144 išraiška žymiai sumažino GC ląstelių migracija, o sumažėjo Pasaulis-144 išraiška labai sustiprintą GC ląstelių migraciją. The Met proto-onkogeno (RER), kuris yra dažnai sustiprina žmogaus vėžio ir funkcijų kaip svarbų reguliatorius ląstelių augimo ir naviko invazijos, buvo išskirtas kaip tiesioginė tikslinė miR-144. Be to, triukšmo slopinimo MET naudojant sirnr (siRNA) suformulavo anti-metastazavusiu funkciją PPN-144, o atkurti RER išraišką ardo tą PPN-144 funkcijos GC ląsteles. Be to, mes nustatėme, kad Pasaulis-144, nukreipiant RER, slopina fosforilinimo Akt. Galiausiai, mes nustatėme Atvirkštinis ryšys tarp PPN-144 ir susitiko mRNR ekspresijos GC metastazavusiu audiniuose. Apibendrinant, PPN-144 slopina GC progresavimą tiesiogiai downregulating RER išraišką, kurią vėliau neleidžia aktyvinti pro-onkogeninių Akt keliu. Pakartotinas miR-144 išraiška GC ląstelių pristato patrauklią terapinis metodas blokuoti skrandžio vėžio metastazių.
Raktiniai žodžiai
MicroRNA Pasaulis-144 RER Skrandžio vėžys Metastazių Įvadas
Visame pasaulyje, skrandžio vėžys (GC) yra vienas iš labiausiai paplitusių rūšių piktybinių ligų. 2008 metais buvo diagnozuotas maždaug 989.600 naujų atvejų GC. Be to, GC buvo susijęs kaip 738,000 mirčių priežastis, todėl GC ketvirtoji dažniausia piktybinių navikų ir pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirties visame pasaulyje [1]. Kadangi auglys progresuoja, ji vystosi gebėjimas įsiveržti aplinkinių audinių ir metastazuoti. Hepatocitų augimo faktoriaus receptoriaus, RER, yra žinoma, kad skatinti peristaltiką ir invazinė pajėgumą vėžinių ląstelių [2]. RER yra receptoriaus tirozino kinazės šeimos narys ir buvo įrodyta, kad būti aktyvinama daugelyje navikų [3-5]. Manoma, kad RER išraiška lygis padidėjo arba geno ar hipoksija per HIF1α. Pacientams, sergantiems metastazavusiu GC susitiko stiprinimas ir stiprus baltymo raiškos nėra reti. Šie įvykiai, atrodo, reikšmingai susijęs su nepalankia klinikinių rezultatų [6]. Maždaug 10% baltųjų pacientų uosto penkis ar daugiau kopijų RER pelną. Be to, šis pelnas RER kopijų skaičiaus yra reikšmingai susijęs su nepalankia prognoze [7]. Be to, Mir-34a /c mikro RNR buvo įrodyta, kad neigiamai moduliuoti RER išraišką ląstelių linijų, gautų iš prostatos vėžio, kepenų ląstelių karcinoma ir GC [8-10].
Mikro RNR (miRNAs) yra be kodavimo RNR molekulės, maždaug 21-23 nukleotidų ilgio, kurie reguliuoti genų ekspresiją tuo transkripcijos arba post-transkripcijos lygio [11-13]. Mirna išraiška profiliavimo analizes atskleidė pasauliniu downregulation subrendusių Mirna lygiais žmogaus navikų, palyginti su sveikų audinių [14]. Be to, miRNAs gali funkcionuoti arba auglio slopinamojo arba onkogeninių vaidmenį, priklausomai nuo jų tikslo funkcija. Pavyzdžiui, PPN-133B buvo gerokai žemyn reguliuojama GC audinių ir darė savo auglio slopinamojo vaidmenį GC ląstelių [15]. Išraiška miR-337-3p buvo žymiai downregulated į limfmazgių metastazių audinių GC pacientų, o indukcija Pasaulis-337-3p išraiškos padarė sumažinti skrandžio vėžio ląstelių invazija pajėgumą [16]. Pasaulis-25 skatina GC progresavimą tiesiogiai downregulating TOB1 išraišką; Todėl padidėjo išraiška miR-25 kelia galimą neinvazinį biologinis už GC pacientų [17] prognozė. Be to, PPN-7 yra gerokai downregulated tiek labai metastazavusiu GC ląstelių linijų ir metastazavusiu audiniuose. Raiškos miR-7 žymiai slopina GC metastazių nukreipiant į insuliną panašaus augimo faktoriaus-1 receptoriaus (IGF1R) onkogeno [18] išraiška. GC ląstelių linijų, Pakartotinas Pasaulis-144 raiškos rezultatų represijų ZFX, kuris vidutiniškai padidina vėžio ląstelių jautrumą 5-fluorouracilo chemoterapija. 93 atvejų pirminės GC, sumažėjo Pasaulis-144 išraiška buvo susijęs su blogos prognozės [19]. Šie pavyzdžiai išryškino esminį miRNAs GC malignance ir vėžio progresavimą.
Šiame tyrime mes būdingas tikslus ir apibrėžė veiksmų miR-144 GC mechanizmą. Stimuliuoja negimdinis išraišką PPN-144, mes atrado RER yra naujas tikslas Pasaulis-144 reguliavimas. Ši išvada buvo patvirtinta abiejų mRNR ir baltymų koncentracijos ir žurnalistė genas liuciferazės tyrimai patikrino tiesioginis privalomas miR-144 su reguliavimo privalomą svetainės RER 3'UTR srities. Be to, mes nustatėme, kad RER išraiška atvirkščiai koreliuoja su MIR-144 lygių nedidelis, bet gerai dokumentuota GC kohortos. Mes iškėlė hipotezę, kad Pasaulis-144 slopina GC metastazes, ir kad kai kurios šio slopinimo tarpininkaujant nukreipiant RER išraiška.
Medžiagos ir metodai
žmogaus audinių pavyzdžius ir ląstelių linijas
GC mėginiai buvo surinkti iš pacientų, kuriems buvo atlikta operacija Fudan universiteto Šanchajuje Cancer Center tarp 2012 ir 2013 m protokolas buvo patvirtintas klinikinių tyrimų etikos komiteto Fudano universiteto, o tyrimas buvo atliekamas pagal Helsinkio deklaraciją 1975 nuostatos buvo gauti visi mėginiai su informuoto sutikimo pacientų. Žmogaus GC ląstelių linija "AGS (ATCC® BEL-1739 ™"), SNU-1 (ATCC® BEL-5971 ™ "), SNU-5 (ATCC® BEL-5973 ™"), SNU-16 (ATCC® CRL- 5974 ™ ") , NVI-N87 (ATCC® BEL-5822 ™ ") ir KATO III (ATCC® HTB-103 ™) išliko DMEM, kurių sudėtyje yra 10% vaisiaus galvijų serumo. Visi ląstelių linijos ir buvo išlaikytos laikmena su peniciliną (100 TV /ml) ir streptomicino (100 mg /ml) 37 ° C temperatūroje su 5% CO2. Į Mirna imituoja ir inhibitoriai buvo įsigytas iš Ambion (Austin, TX, USA).
RNR gavybos ir realaus laiko PGR
viso RNR buvo išskirta iš ląstelių naudojant TRIzol (INVITROGEN, Carlsbad, Kalifornija). Dėl Mirna analizės, poli (A) uodega buvo įtraukta į visų RNR naudojant poli (A), polimerazės (Ambion, Karlovi Varai, Kalifornija) prieš atvirkštinę transkripciją. MiRcute Mirna qPCR aptikimo komplektas (TIANGEN, Pekinas, Kinija) buvo naudojamas quantitate ekspresijos lygį PPN-144 pagal pateiktą protokolą. buvo naudojami šie PGR sąlygos: 95 ° C temperatūroje 30 s, o po to 40 ciklų 95 ° C temperatūroje 5 s ir 60 ° C temperatūroje 31 s. Tikslinių suma (RER /Pasaulis-144), normalizuotas endogeninio namų ruošos geno GAPDH /U6snRNA ir, lyginant su etaloninio ėminio, apskaičiuojamas pagal šią lygtį: suma target = 2- △△ KT
mikrogardeliq hibridizacijos.
Trumpai tariant, RNR mėginiai buvo naudojamas sintetinti dvigrandės papildomą DNR (cDNR), ir dvigrandė kDNR buvo paženklintas ir hibridzuojamas mikrogardelių sistemoje (Arraystar, Rockville, MD). Po hibridizacijos ir plovimo, perdirbti skaidres nuskaityta su Aksonas GenePix 4000B mikrogardeliq skaitytuvas (Molekulinė prietaisų, Saniveilis, Kalifornija). P-vertė buvo apskaičiuota naudojant suporuotų t-testą. Nustatyto aukštyn ir žemyn reguliuojama genų riba buvo kartų kaita > 2,0 ir p reikšmė < 0,05. Hierarchinis grupavimas buvo atliktas remiantis skirtingai išreikštas genų ir miRNAs naudojant klasteris TREEVIEW programinę įrangą iš Stanfordo universiteto (Palo Alto, CA).
Mirna genų tinklas
Mes pastatytas tinklo artumą tarp dviejų genų, i ir j, apibrėžiama kaip iš Pearson koreliacijos tarp atitinkamos genų ekspresijos profilius, XI ir XJ galia. Gretimumą matrica, M (I, J), buvo ryškinamos kaip grafikas, ir buvo nagrinėjami topologijos savybės šioje diagramoje. Kad vaizdinis tik stipriausius koreliacijas (> 0,98) buvo sudarytas šių tinkas. Į mirna-genų tinklų, kiekvienas genas atitinka mazgas. Du genai yra sujungti krašto, kas rodo koreliaciją. Per tinklo analizė, laipsnis yra paprasčiausias, svarbiausia matas geno per tinklą centriškumas ir nustato santykinę svarbą. Laipsnis yra apibrėžiamas kaip tiesiogiai susijusios kaimynų skaičius
prognozavimas Pasaulis-144 privalomą svetainėje
spėjamas Pasaulis-144 jungimosi vietų susitiko mRNR 3 'neišverstas regione buvo prognozuojama Tikslinė Scan "programa (" http: //. www.targetscan.org). Pozicija 1430-1436 MET 3 "Rytas turi apsaugotą prijungimo vietą Mir-144 orientacijos.
PLAZMID transfekcijq
ORF sekos RER buvo papildytas iš genomo DNR, išskirtos iš SNU-5 ląstelių linijos ir tada subklonuoti į plenti vektorių. Plazmidės buvo pernešta į SNU-5 ląstelių, naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Po to, kai 24 h, ląstelės buvo naudojamas gelbėjimo eksperimento metu.
Oligonukleotidas transfekcija
miR-144 imituoja, miR-144 inhibitoriaus (anti-miR-144), ir meteorologinių siRNR (siRNR-RER) buvo susintetintas Genepharma , Šanchajus, Kinija. Oligonukleotidas transfekcija buvo atliktas su Lipofectamine 2000 reagentų (INVITROGEN, Carlsbad, Kalifornija, JAV). Galutinė koncentracija Pasaulis-144 imituoja anti-Pasaulis-144 arba siRNR-susitiko transfekciją sistemos buvo 100 nm. Transfekcijq efektyvumas vieno ir bendrai perkeltų tyrimų nulėmė fluorescencijos mikroskopu.
Imunoblotas
Lygiaverčiai kiekiai ląstelių fragmentai buvo išspręsta 7% SDS /PAGE ir buvo perkelti į polivinilidenfluorido membranas. Membrana buvo inkubuojamos su triušio polikloniniu kovos su RER antikūnas (1: 500, abcam, ab47431), ožką polikloniniu kovos su ADAM12 antikūnas (0,3 mikrogramo /ml, abcam, ab28747) ir triušio polikloninius kovos su Versican antikūnų (1 mikrogramai /ml, abcam, ab19345). IRdye žymėto antriniai antikūnai buvo naudojami kiekybinio iš imunoblotas signalas, ir signalai buvo analizuojami naudojant Odyssey skaitytuvas (Li-COR biomokslų, Lincoln, NE, JAV).
RNR-Chip tyrimą
RNR-baltymų sąveikos yra nustatytos su formaldehidu, ir chromatino šlyties yra derinamas su DNaze gydymo, taip gaunant RNR /baltymų kompleksus, kad gali būti immunoprecipitated su antikūnų to met baltymų. Cross nuorodos vėliau anuliuojami; RNR yra regeneruotos ir vėl apdorojamos su DNaze, kad būtų užtikrintas DNR nebuvimą. RNR nusodinamas iš imuninio komplekso tada būti analizuojami realaus laiko PGR. Šiuo RNR-Chip tyrimu, gali būti naudojama ši formulė:% sumokėto (atgavimas) = ​​AE (ct įvesties-CT mėginys) * Fd * 100%. Čia AE yra amplifikacija efektyvumas (10 (-1 /nuolydis)) ir Fd yra skiedimo faktorius įvesties RNR, siekiant subalansuoti RNR-Chip mėginio ir įvesties RNR kiekių, naudojamų realaus laiko PGR skirtumą.
liuciferazės tyrimas
visą RER 3'UTR srities sustiprino PGR naudojant SNU-5 kDNR šabloną ir klonuotas į pGL3 valdymo vektorių. Mes naudojamas greito pakeitimo mutagenezę mutuoti ir miR-144 tariamų prisirišimo vietą (Stratageno, Santa Clara, CA, USA). SNU-5 ląstelių ir AGS ląstelės buvo pernešta su Pasaulis-144 imituoja /inhibitorių ir pGL3 liuciferazė reporteris konstruoja slėpimas RER 3'UTR. Po 24 h, "Firefly liuciferazės ir renilla liuciferazės į ląstelių fragmentai veikla buvo matuojamas Dvejopo liuciferazės prabavimo sistemos (PROMEGA, Madison, WI, JAV).
Migracijos tyrimai
Dėl transwell migracijos tyrimus, 1 × 105 ląstelių buvo padengtą į viršų kameroje, kurio sudėtyje yra ne dengtos membraną. Ląstelės buvo talpinami i serumo neturinčioje terpėje, ir vidutinio papildytas 10% (v /v) serumas buvo naudojamas kaip apatinę kamerą chemoattractant. Ląstelės buvo inkubuojamos 37 ° C temperatūroje, audinių kultūros inkubatoriuje su 5% (v /v) CO2. Po 16 h greičiu, ne migravo ląstelės buvo pašalintas iš viršutinių pusių transwell membraninį filtrą intarpais. Išsiskyrusio ląstelės apatinėje pusėse įdėklų buvo tamsintas su coomassie briliantinis mėlynasis, ir buvo skaičiuojami ląstelės.
Ląstelių proliferacija tyrimas
Transfekuoti ląstelės buvo pasėjamos 96 duobučių plokšteles po 1 × 104 ląstelių tankis /gerai. Ląstelių proliferacija tyrimas buvo atliktas naudojant Cell priemonių skaičiavimo KIT-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonija), pagal gamintojo instrukcijas. Iki CCK-8 Be to, ląstelės buvo išplauti šiltu terpėje, kurį tuo 500 apsisukimų per minutę plokštelę verpimo: 3 m ir tada išpilant supernatantą
gruntai
Šie pradmenys buvo naudojami realaus laiko PGR.: Pasaulis-144: 5-TACAG TATAG ATGAT GTACT-3; U6snRNA: 5-CGCAA GGAUG ACACG CAAAU UCGUG AAGCG UUCCA UAUUU UU-3; SKIL priekį gruntas: 5-GTTAA GCGAA CCTGT ACTTC TGT-3, atvirkštinės gruntas: 5-GTAGG CGACA TGCTT TCTTG G-3; MET priekį gruntas: 5-GTCGG AGTAG AGCGT CGAGA-3, atvirkštinės gruntas: 5-CAGCG CGATC AGGTA GAGC-3; TOP2A priekį gruntas: 5-ACCAT TGCAG CCTGT AAATG A-3, atvirkštinis gruntas: 5-GGGCG GAGCA AAATA TGTTC, C-3; ADAM12 priekį gruntas: 5-TCAAC CTGGA TACCC GATTC, C-3, atvirkštinis gruntas: 5-GCTCT GTCTG CCGAT GGAG-3; VCAN priekį gruntas: 5-GTAAC CCATG CGCTA CATAA AGT-3, atvirkštinės gruntas: 5-GGCAA AGTAG GCATC GTTGA AA 3. Šie gruntai buvo naudojami visą RER 3UTR taikymo: met 3'UTR priekį gruntas: 5-TCACT GCCTG ACCTT TA-3, RER 3'UTR atvirkštinio gruntas: 5-ATCAC TTACT CCCAC AAT-3. SiRNR nukleotidų RER buvo naudojamas taip: siRNR-MET priekį: 5-GUGCC ACUAA CUACA UUUAU U-3, siRNR-MET pakeisti:. 5-UAAAU GUAGU UAGUG GCACU U 3
Statistinė analizė
rezultatų pateikiami kaip reiškia ± SEM, o duomenys buvo analizuojami su Stjudento t testą. A p <vertės; 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas.
Rezultatai
MicroRNA išraiška aprašymą skrandžio vėžio
Palyginimas pilvaplėvės metastazavusiu audinių susietų pagrindinis židinių pavyzdžių GC naudojant hierarchinę grupavimo analizė atskleidė, sistemingai variacijos nuo miRNAs ir genų raiškos (paveikslas 1A ir B). Mūsų duomenys rodo, kad iš miRNAs ir genų rinkinys yra dažnai klaidinga išreikštas pilvaplėvės metastazavusiu audinių GC. Be to, mes taip pat nustatė, kad kai kurie anksčiau taip pat įrodė molekulės, pavyzdžiui, miR-7 [18], PPN-25 [17], TOB1 ir IGF1R, nebuvo galima nustatyti mūsų mikrogardelių. Manėme, tai skirtumas gali būti sukeltas įvairove klinikinių mėginių atėjo iš įvairių sričių. 1 pav Core Mirna genų tinklas, įskaitant 8 pagrindines miRNAs ir jų tikslus. Hierarchinis grupavimas analizė 27 miRNAs (A) ir 32 genų (B), kad buvo atskirtinai išreikštų tarp metastazinių audinių pilvaplėvės ir suporuotas pirminių mėginių GC (didesnis nei 2.0 karto; p < 0,05). Expression vertės atstovaujama atspalvių raudonos ir žalios, nurodant išraiška virš ir žemiau medianos išraiška vertės visuose mėginiuose. (C) Mirna genų tinklas rodo tarp 8 pagrindines miRNAs ir naviko susijusių genų jie prognozuojama reguliuoti santykius. Spalvos nurodyti komentuojami raiškos lygį; miRNAs ir genai.
Mirna-genų tinklas buvo surinkti siekiant nustatyti pagrindinius miRNAs, kurios reguliuoja naviku susijusio geno ekspresiją per naviko metastazių progresavimas tikslo. Kadangi coexpression moduliai tikriausiai atitinka biologinius kelius, mes sutelktas į coexpression modulius, kurie yra susiję su dideliu skaičiumi baltymų kodavimo genuose. Be to, NCBI RefSeq Išsamiau daugelio genų funkcijas, skirtas pagalbos mūsų identifikuoti GC susijusių genų. Naudojant šį metodą, mes būdingas miR-144 vaidmenį pilvaplėvės metastazavusio židinių GC. Be vėžio coexpression tinklo, PPN-144 yra prijungtas prie 6 baltymų kodavimo genų, kurie yra susiję naviko augimui ir metastazių (1c pav).
Reguliavimo funkcijas miR-144 skrandžio vėžio metastazių
ištirti miR- 144 funkcija, mes pirmiausia tikrinama ir miR-144 kiekį, kuris tam 6 žmogaus GC ląstelių linijų skydelyje. Kaip parodyta 2A pav, mes išrinkome AGS, kuriam būdinga aktyvinama miR-144, ir SNU-5, būdingas su downregulated miR-144, tolesnio tyrimo. AGS ląstelių linija buvo gauta iš skrandžio naviko fragmentų, kurie buvo rezekcijos iš paciento, kuris buvo gavęs jokių ankstesnis gydymas, o SNU-5 buvo gauta iš ascitas pacientų, sergančių blogai diferencijuotos karcinomos, skrandžio. 2 pav MIR-144 slopina GC ląstelių migraciją. (A) ekspresijos lygi miR-144 buvo tikrinami nuo 6 žmogaus GC ląstelių linijų, naudojant realaus laiko PGR metodą skydelyje. (B), migracija SNU-5 ląstelių gydomiems Pasaulis-144 imituoja buvo tikrinamas naudojant ne-Matrigel apdorotos transwell kamerą. (C), migracija AGS ląstelių gydomi Pasaulis-144 inhibitoriaus buvo tikrinamas naudojant ne-Matrigel apdorotos transwell kamerą. (*** P < 0,001).
Mūsų tyrime mes pastebėjo glaudų ryšį tarp Pasaulis-144 praradimo ir metastazių GC (1a ir C pav.) Atitinkamai, anksčiau atlikti tyrimai dokumentais Pasaulis-144-paremtą slopina vėžinių ląstelių migracijos ir invazijos į epitelio suragėjusių ląstelių karcinoma. Mes iškėlė hipotezę, kad Pasaulis-144 raiškos sugrąžinimu būtų slopinti vėžinių ląstelių migraciją. Tinka, kai įvedimas Pasaulis-144 raiškos slopino ląstelių migraciją į SNU-5 (2b pav.) Palyginti su SNU-5, AGS ląstelės turi santykinai aukštesnio lygio endogeninio miR-144 išraiška. Nenuostabu, kad slopinimas miR-144 padidinta AGS ląstelių migraciją (2c pav.) Iš tiesų, mes taip pat atliko invazijos tyrimą naudojant Matrigel gydytų transwell ir nėra jokio skirtumo invazine gebėjimas SNU-5 /AGS ląstelių po gydomiems Pasaulis-144 /anti-miR-144 (Duomenų nerodomas). Šie rezultatai iliustruoja, kad Pasaulis-144 vaidina svarbų vaidmenį migracijos bet ne invazija GC ląstelių.
Pasaulis-144 veikia RER išraišką
Per negimdinio išraiškos PPN-144 SNU-5 ląstelių, nustatėme ADAM12 , VCAN ir RER yra spėjamas Pasaulis-144 tikslai. Kaip parodyta 3A pav, PPN-144 išraiška smarkiai paveikė iRNR lygius ADAM12, VCAN ir susitiko. ADAM12, VCAN ir susitiko baltymų ekspresijos lygis taip pat buvo aptikta per Vakarų dėmė į vėžinių ląstelių transfektuotose Pasaulis-144 imituoja. Kaip parodyta 3B pav, tik RER baltymų kiekis buvo downregulated iki miR-144. Tai rodo, kad miR-144 paveikia RER išraiška tuo transkripcijos lygio, galbūt per skilimo arba destabilizacijos mRNR struktūros. Tačiau mes taip pat nustatė, kad ADAM12 ir VCAN baltymo koncentracija yra ne sumažėjo egzogeninės įvedimo PPN-144. Mes galvojome, kad iRNR ir baltymų koncentracija negali būti tiesiogiai koreliuoja, nes kitu pusinės. Mes taip pat manome, kad jie parodė, kad gali būti dėl to, kad miR-144 akivaizdoje, kad buvo nuolat represuoti vertimą vienu atveju, bet ne kitų. RER: Pasaulis-144 sąveika taip pat buvo įrodytas gyvenimo ląsteles RNR-CHIP tyrimu. Iš tiesų, endogeninė miR-144 buvo nustatyta, susijusios su endogeninio RER į anti-met, bet ne anti-IgG immunoprecipitates iš ląstelių (Fig.3C). 3 pav išraiška RER buvo reglamentuojama miR-144. (A), iRNR lygiai tariamų Pasaulis-144 tikslų buvo ištirti realaus laiko PGR SNU-5 ląstelių transfektuotose Pasaulis-144 imituoja arba miR-NC. (B), Baltymų koncentracija tariamų Pasaulis-144 tikslų buvo ištirti Imunoblotingo į SNU-5 ląstelių transfektuotose Pasaulis-144 imituoja arba miR-NC. (C)% įvesties atgautos RNR-Chip reakcijų iliustruoja pagal RER antikūnų sodrinimą. RNR-chip tyrimas Mir-144 atliekami anti-MET antikūnų nuo lizatuose ląstelių. RNR-chip su nonrelated IgG tarnavo kaip kontrolės. (D) schematinis vaizdas prognozuojamos Pasaulis-144 prijungimo vietos RER 3'UTR srities. (R) SNU-5 ląstelės buvo laikinai bendrai perkeltų Luc-MET 3'UTR srities ir miR-144 mimika. (F) AGS ląstelės buvo laikinai bendrai transfekuota su LUC-MET 3'UTR srities ir miR-144 inhibitoriaus. (G), mutavo PPN-144 prijungimo vietos ir RER 3'UTR srities panaikinta Mir-144-sukeltas liuciferazė veiklos slopinimą. Liuciferazė aktyvumas buvo matuojamas po 24 h ir normalizuotas bendrai perkeltų Renilla. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Naudojant bioinformatikos-analizę, pagrįstą, mes nustatė vieną mirna jungimosi vietos miR-144 į 3 'UTR RER iRNR (3D pav.) Norėdami išbandyti, jei Pasaulis-144 tiesiogiai jungiasi 3'-UTR RER mRNR, mes atliekame liuciferazės reporteris mėginiais SNU-5 ląstelių. PGR gautų fragmentai iš RER 3'UTR srities buvo įdėta į pGL3 valdymo vektorius Xba1 svetainėje (LUC-MET 3'UTR). Bendras transfekcija Luc-MET 3'UTR srities ir Pasaulis-144 imituoja į SNU-5 ląstelių, sumažėjo liuciferazės signalas (palyginti su miR-NC), patvirtinantis, kad privalomas miR-144 į RER 3'UTR srities turi tiesioginis slopinantis poveikis (3E pav.) Atvirkštinis eksperimentas, atliktas blokuoja endogeninio Pasaulis-144 gamybą su Pasaulis-144 inhibitoriaus AGS ląsteles, lėmė padidėjusios liuciferazės signalas (3F pav.) Mutavusių liuciferazė reporteris ne Mir-144 privalomą svetainėje taip pat buvo pastatytas (3D pav.) Mutacija mirna jungtyje panaikinta ir miR-144-medijuojamą liuciferazės veiklos (3G pav). Šie duomenys rodo, kad 1430-1436 pozicija RER 3'UTR srities yra kritinė Mir-144-tarpininkaujant genų reguliavimo.
RER tarpininkauja Mir-144-sukeltas atsparumas migracijos
Naudojant realaus laiko PGR, susitiko ekspresijos lygis buvo nustatytas šešių žmogaus GC ląstelių linijų. Kaip parodyta, ląstelių linijas su "downregulated" Pasaulis-144 lygių turi didesnes sumas RER, palyginti su ląstelių linijų su "aktyvinama" Pasaulis-144 lygių (4a pav.) Naudojant neparametrinius bandymus, nustatėme reikšmingą atvirkštinę koreliaciją tarp RER mRNR ir Pasaulis-144 išraiška GC metastazavusiu mėginių (4b pav.) 4 pav RER moduliavimas sudaro už antimetastatic poveikio miR-144. (A), Western blot, rodančią RER ekspresiją žmogaus GC ląstelių linijų rinkinio. (B) reikšmingas atvirkštinis ryšys stebimas tarp Mir-144 ir susitiko raiškos lygių GC audinių (n = 52). (C) RER ir fosforilinarai Akt buvo nuslopintos priverstinio išraiška miR-144 ar siRNA-MET. (D e) PPN-144 ar siRNA-MET poveikis migracijos ir proliferacijos buvo nustatytas SNU-5 ląstelių. (F) taikyti RER ir fosforilinarai Akt buvo atkurta RER ekspresija Pasaulis-144 imituoja gydytiems SNU-5 ląstelių. (G h) PPN-144 poveikis kartu su MET-ORF ant migracijos ir proliferacijos SNU-5 ląstelių. (I), RER ir fosforilinto AKT buvo iki reguliuojama blokuoja miR-144 į AGS ląstelių. (J, k) kovos su miR-144 poveikis migracijos ir proliferacijos AGS ląstelių.
Met baltymų funkcijas kaip receptorių tirozino kinazės ir vaidina pagrindinį vaidmenį ląstelių augimą ir migracijos skatinimas transdukciją tarpląstelinio paskatų ląstelėje signalizacijos grandines. Žinomas komponentas ląstelėje signalizacijos technika yra PI3K (phosphoinositide 3-kinazės) kelias [20,21]. Kadangi Pasaulis-144 slopina RER išraiška, mes iškėlė hipotezę, kad Pasaulis-144 gali galiausiai sumažės Akt fosforilinimo ir aktyvacijos per sumažėjo RER signalizacijos. Taigi, mes išnagrinėjo akt fosforilinimo lygis po Pasaulis-144 raiškos ir stebėjo labai sumažėjo Akt fosforilinimo (4c pav.)
Mes nusprendėme ištirti, ar Pasaulis-144 sukelto RER downregulation turėjo įtakos vėžinių ląstelių migracijos ir proliferacijos poveikį. Mes perkeltų MIR-144 ir siRNA RER (siRNR-MET) ir SNU-5 ląstelių. Mobilusis migracija buvo įvertintas 16 val po transfekciją pagal transwell tyrimu, o ląstelių proliferacija buvo nustatytas per CCK-8. , Kaip parodyta Fig 4d ir E, transfekciją su miR-144 inhibuoja ląstelių migracija ir platinimo kaip palyginti su kontroline grupe. Be to, mažėja RER baltymų raišką naudojant siRNR taip pat sumažėjo naviko ląstelių migraciją ir proliferaciją.
Norėdami nustatyti, ar RER yra kritinė tarpininkas MIR-144 anketa poveikį ląstelių migracijos ir proliferacijos, mes pastatyti du RER ekspresijos vektorių. Vienas iš jų yra vienas atviras skaitymo rėmelis seką RER geno (RER-ORF), o kitas vektorius yra pilnas ilgis nukleotidas RER geno įskaitant 3'UTR seka (MET-pilnas ilgio). tada mes atliekame Vakarų dėmė ANALIZĖ 48 h po transfekciją MET-ORF /MET-pilnas ilgai į Pasaulis-144 imituoja gydytiems SNU-5 ląstelių (4f pav). Palyginti su neigiamos kontrolės grupės (tuščia vektorių), negimdinis išraiška MET-ORF žymiai padidino bendrą išraišką RER ir fosforilinto Akt. Be to, išraiška MET-ORF skatino migraciją ir proliferaciją GC ląstelių (4G ir H pav.) Padidėjusi RER atsisakyta Pasaulis-144 sukelto slopina ląstelių migraciją ir proliferaciją. Priešingai, baltymų lygis RER ir fosforilinto-AKT padidėjo AGS ląstelių gydytų su anti-Pasaulis-144 (4i paveikslą), ir blokuoti miR-144 taip pat skatino migraciją ir proliferaciją AGS ląstelių (4J, K pav.) Šie rezultatai rodo, kad RER yra kritinis taikiniu anti-migracijos poveikio PPN-144 žmogaus GC ląsteles.
Diskusijos
Šiame tyrime mes nustatėme nepersidengiantiems parašų nedaugeliui miRNAs ir genų kad yra nenormaliai išreikštas pilvaplėvės metastazinių audiniuose GC, palyginti suporuotiems pirminių audiniuose. Analizė Mirna ir genų ekspresijos profilius į Mirna-genų tinkle identifikuoti MIR-144 dėl esminių onkogeniniam kelius, pavyzdžiui, platinimo ir migracijos reguliatorius. GC pacientai peritoninės metastazių turėjo mažesnes Pasaulis-144 raiškos lygis, nei pacientams, be metastazių. Ši išvada yra kaltinamas MIR-144 kaip galimą naviko slopintuvas GC. Be to, miR-144 yra susijęs su metastazavimo mechanizmus. Mūsų rezultatai atitinka su ankstesnių tyrimų dėl miR-144 vaidmens vėžio dauginimosi, migracijos, ir invazijos [22,23]. Pasaulis-144 slopina vėžio ląstelių metastazes nukreipiant A disintegrin ir metaloproteinazės (Adomo) baltymų šeimos narys ADAMTS5. MicroRNA reguliacijos sutrikimas yra susijęs su padidėjusiu naviko invazijos ir metastazių, taip pat sumažino pacientų prognozei tam tikrų epitelio vėžio [24]. Mes taip pat tyrė Pasaulis-144 dereguliavimo vaidmenį GC. Mes tiriamas miR-144 išraiškos poveikį į SNU-5 ląstelių linijos, kaip ji yra būdingas mažas išraiška miR-144. Negimdinis išraiška miR-144 SNU-5 ląstelių rezultatų gilių fenotipo pokyčius, pavyzdžiui, sumažėjo migracija. Atvirkštinio eksperimentas, blokuoja ir miR-144 išraiška, buvo atliktas AGS ląstelių linija, kuri turi palyginti didelį vidinį lygį miR-144 išraiška. Slopinimas Pasaulis-144 raiškos lėmė padidėjusios AGS ląstelių migraciją.
Ištirti už Pasaulis-144 priklausomų mechanizmą sumažėjo migracijos GC, mes nustatė tariamą tikslus Mir-144 kaip pranašavo Mirna-genų tinklą. Pasaulis-144 raiška gali sumažinti RER išraišką tiek mRNR ir baltymų koncentracijos ir atitinkamai liuciferazės Reporter tyrimai parodė, kad Pasaulis-144, gali tiesiogiai bendrauti su RER 3'UTR srities. Mes tada įvertino RER raiškos lygį per 52 GC pacientų kohortos ir nustatė, kad Pasaulis-144 lygiai atvirkščiai koreliuoja su RER išraiška. Dėl šios priežasties, mes iškėlė hipotezę, kad Pasaulis-144 slopina GC tumorigenezei nukreipiant RER išraiška. RER, taip pat buvo aprašyta kaip ir miR-34a /c taikinio kitų ląstelinių modelių ir yra žinoma, kad skatinti peristaltiką ir invazinė auglio ląstelių gebėjimą. Padidėjusi RER yra glaudžiai koreliuoja su naviko invazijos ir pacientų prognozei GC [6]. GC RER raiška yra nepriklausoma prognostinis faktorius ir galimas narkotikų taikiniu. Be to, RER raiška gali nuspėti, kurios pacientai gali pasinaudoti tikslingai gydyti RER inhibitorių [25]. Mūsų tyrime RER išraiška buvo reikšmingai susijęs su GC diferenciacijos, TNM ir metastazių [26]. Mes nustatėme, kad pokyčiai ląstelių proliferaciją ir migraciją per miR-144 gali būti daromas per RER raiškos reguliavimas. ir miR-144 represijos veda prie padidėjusio Met, kurie gali paaiškinti metastazes fenotipą miR-144 išeikvotiems ląstelių. Įdomu, PPN-144 įtakoja hepatocitų augimo faktoriaus (HGF) signalizavimo sistema. HGF, kaip RER ligando, gali sukelti RER aktyvaciją epitelio ląstelių. Nors RER raiškos negalėjo visiškai atkurti GC tumorogeninį savybes, GC ląstelių migracija ir plitimas buvo dalinai atstatyti po RER raiškos. Todėl, PPN-144 gali reguliuoti kitus genus GC ląsteles. Ankstesni tyrimai parodė, kad RER gali sukelti GC tumorigenezei per iš PI3K keliu aktyvacijos. Šiame tyrime mes nustatėme, kad Pasaulis-144 žymiai susilpnintas Akt fosforilinimo ir kad Akt fosforilinimo buvo visiškai atkurta raiškos RER. Mūsų rezultatai rodo, kad Pasaulis-144 reglamentuoja Akt fosforilinimo per RER reguliavimo GC.
Taigi, mūsų tyrimo nustatė už lygis sumažėjo miR-144 matyti GC metastazavusiu audinių pagrindą. Pasaulis-144 buvo nustatyta, kaip galimą naviko slopintuvas GC ir buvo susijęs su GC metastazių mechanizmus. Be to, PPN-144 slopina GC tumorigenezei nukreipiant RER, o vėliau, The PI3K /Akt kelias. Mūsų žiniomis, tai pirmas kartas, Pasaulis-144 buvo įrodyta, kad nukreipti RER GC ląsteles. Todėl tolesni tyrimai, nagrinėjantys vėžio vaidmenį PPN-144 gali prisidėti prie naujų terapinių strategijų GC plėtrai.
Pastabos
birželis Liu Hui Xue prisidėjo vienodai prie šio darbo.
Deklaracijų
Padėka
Šis tyrimas parėmė Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos (dotacijos Nr 81.201.897). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį.
Konkuruojančių interesų
Autoriai deklaruoja, kad jie neturi jokių konkuruojančių interesų.
Autorių indėlį
JL atlikti molekulinės biologijos studijas. HX parengė rankraštį. JZ atliko bioinformatikos analizę. Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Asociacija buvimas /nebuvimas ir įjungimo /išjungimo modelių Helicobacter pylori oipA geno su pepsinė opa ir skrandžio vėžio riziką: metaanalizė
• Ryšys tarp žarnyno hormonų ir gliukozės homeostazės po BARIATRIC surgery