Povečanje-integrin povezana kinaze ni kanonično daje NF-κB-povzročeni prednosti rasti v želodcu rakavih celic z aktiviranjem ERK1 /2

Višja-integrin povezana kinaze ni kanonično daje NF-κB-povzročeni prednosti rasti za želodčne rakave celice, ki jih aktiviranje ERK1 /2
Abstract
Ozadje
Povečana aktivnost ali izražanje-integrin povezana kinaze (Sorta), ki ureja celično adhezijo, migracije in proliferacije, vodi do onkogenezo. Identificirali smo molekularno osnovo za ureditev Sorta in njegovo alternativno vlogo pri dodelitvi ERK1 /2 /NF-κB posredovana prednosti rasti do želodca rakavih celic.
Rezultati
za zaviranje ILK s kratkimi Ostra RNA ali T315, določena domnevna inhibitor ILK, odpravijo NF-κB posredovana rast v človeških želodčnega raka celic AGS, snu-1, MKN45 in GES-1. Sorta spodbudila Ras dejavnost aktivirati c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /ribosomne ​​S6 kinaza /zaviralec κBα /NF-κB signalizacijo, ki bi omogočila oblikovanje IQ vsebuje motiv-GTPase aktivira protein 1 (IQGAP1) - Ras zapletena. Prisilna encimska ILK izraz spodbuja rast celic s pospeševanjem ERK1 /2 /NF-κB signalizacijo. aktivacije PI3K ali zmanjšan PTEN izraz dolgotrajno ERK1 /2 aktivacija z zaščito Sorta od-proteazomske posredovano degradacijo. C-terminalni del toplotnega šoka sorodni 70 vzajemno proteina, s HSP90 povezanimi E3 ubikvitina ligaze, posredovano ILK ubikvitinacije nadzor PI3Ky in hsp90-regulirano stabilizacijo ILK in signalizacije. Poleg celične rasti je opredeljena pot spodbuja migracijo celic in zmanjša občutljivost želodčnih rakavih celic z zdravili proti raku 5-fluorouracila in cisplatina. Poleg tega, eksogeni uporaba ESPG kot tudi prekomerno EGFR sprožil ILK- in IQGAP1-regulirano ERK1 /2 /NF-κB aktivacijo, rast celic in migracije.
Zaključek
Višja Sorta ni kanonično spodbuja ERK1 /2 /NF-κB aktiviranje in vodi k rasti želodčnih rakavih celic.
Ključne besede
ILK rast celic IQGAP1 ERK1 /2 NK-κB Ozadje
integrin- povezana kinaze (Sorta), ki je 59-kDa serin /treonin kinaze, direktno komunicira s citoplazemskega domeni β1 integrina [1]. Sorta obsega tri področja: N-terminal ankyrin (ANK) ponavlja, osrednji homologijo pleckstrin (PH) regijam podobnih področjih, ter kinaza domena C-terminal [2], [3]. -Integrin posredovano celično ekstracelularni matriks (ECM) proti sprijemanju ali rastne faktorje aktivirajo fosfatidil 3-kinaze (PI3K) fosforilacije membrane, vezan PI 4,5-bifosfat (PIP2) in ustvarjajo PI 3,4,5-trifosfat (PIP3) ki se veže na pH-podobno domeno ILK in aktivira ILK [4], [5]. Po aktivaciji ILK lahko C-terminalni kinaze domena ILK vežejo na različne proteine, vključno z AKT, affixin, P-Parvin, glikogen sintaza kinaza (GSK) -3β, calponin vsebujejo homologijo ILK-vezavni protein, 20-kDa regulatorni svetlobne verige miozin (LC20), se-miozin ciljanje podenote miozin lahke verige fosfataze (MYPT1), paxillin, a-NAC, in inhibitorjev protein fosfataze phi-1, Kepi in CPI-17 [2], [3] [6] [7]. N-terminalni ANK ponavlja posredujejo interakcijo Sorta z ILKAP, protein fosfataze 2C družinskega člana, in ščepcem, z LIM le-domene adapter beljakovin. Sorta se lahko šteje protein-PIP3 vzajemno dolvodno od PI3K; njeni učinki so blokirani s homolog fosfataze in tensin črta na kromosomu 10 (PTEN) [8], [9]. PTEN zatira tumorje, ki ga dephosphorylating PIP3 [10], [11]
ILK igra ključno vlogo pri uravnavanju različne celične procese, vključno s proliferacijo, preživetje, migracije, napredovanju celičnega ciklusa, in angiogenezo.; povečana aktivnost ali izražanje ILK vodi onkogenezo [2] [3]. Poleg zvezni svojim partnerskim beljakovine za celične procese, je ILK hipotezo, da se vključijo v znotrajceličnih signalov omrežja. Mehanično, ILK neposredno fosforilira AKT o Ser473 in GSK-3p na Ser9 [4], [9] za posredovanje β-catenin translokacijo in urejanje AP-1 izraz za tumorskih celic orožja [12]. aktivacije NF-κB je bistvenega pomena za-Sorta posredovano onkogenih procesov, kot so anti-apoptotske aktivnosti [13], spodbujanje preživetja [14], epitelijske-mezenhimskih prehodu [15], celične razširitev in odpornosti na apoptozo [16], angiogenezo [17 ], in migracije, invazija, in metastaze [18] - [20]. Poleg tega je za kanonično ureditvi IKKα in IKKß ga ILK /AKT poti je potrebna za aktivacijo NF-κB. Sprožiti migracije celic, lahko ILK aktivirati GTPases RAC majhen in CDC42 [21]. Poleg tega ILK ureja ERK1 /2 aktivacijo v myogenic diferenciacije [22]. Povečano izražanje microRNA-143 in microRNA-145, ki ciljajo na Sorta, zavira AKT in ERK1 /2 poti [23]. Vendar pa je molekularni mehanizem, osnovni-ILK posredovane aktivacije ERK1 /2 ostaja neznan.
Stimulacijo celic z rastnimi faktorji in citokini, kot tudi mobilnega interakciji z povečanje ECM Sorta dejavnosti [24]. Poleg molekularno ureditvijo PI3K /PTEN ga ILK, Aoyagi sod. opredeljena ILK kot nov toplotni šok protein (HSP) 90 strank beljakovin in ugotovila, da farmakološko inhibicijo HSP90 povzročila degradacijo Sorta v proteazomske odvisnega način [25]. Poleg tega je HSP90 povezanimi E3 ubikvitin ligaze C-terminalni heat shock sorodni 70 interakcijo protein (chip) povzroča degradacijo ILK [26]. Hashiramoto sod. je pokazala, da hsp90 stabiliziran Sorta in trajno AKT in ERK1 /2 aktivacijo [16]. Tako smo špekulirati razmerje med stabilnostjo Sorta in aktiviranje njenih nadaljnjim kinaz. Ras /MAPK pot signalizacijo je bistvenega pomena za tumorigeneze [27]. Povečana ekspresija ILK se nanaša na visoke stopnje raka želodca [28], raka prostate [29] in nedrobnoceličnim pljučnim rakom [30], čeprav so celice v teh rakov pogosto pristanišče Ras mutacij [31] - [33]. Ciljanje Sorta z siRNA zmanjšuje raka želodca celično invazijo, proliferacijo in rast s pomočjo neznanega mehanizma [34]. Glede možnosti, da ILK deluje gorvodno od NF-κB z zakonsko ureditvijo IKKα [13], ki je bila vpletena v želodčnem tumorigeneze [35], je ILK razmišljal, da aktivirate rast celic prek NF-κB-reguliranega poti. Uporaba želodčne rakave celice (AGS, MKN45 in snu-1), smo proučevali molekularno ureditev Sorta in opredelila nekanoničen pot od-Sorta urejeno ERK1 /2 aktivacije za NF-κB posredovano rast želodčni rak celic, migracije, in preživetje napredovanje.
Rezultati
ILK aktivnost in izražanje so bistvenega pomena za NF-κB posredovano rast celic
povečano aktivnost ali ekspresijo Sorta povečuje tumorigeneze s spodbujanjem rasti celic [6]. Temelji na RNAi ILK dušenje zvoka zaduši rast želodčni rak celic [34], medtem ko je ILK prekomerno povezana z želodčno tumorigeneze [28]. V človeških želodčnih tumorjev in AGS-izpeljana gomoljev v BALB /c miši, Ki-67-pozitivne proliferirajoče celice hkrati izraženi Sorta, kot je razvidno iz tega, ki temelji na fluorescenčno imunskim barvanjem (slika 1A) in imunskim barvanjem temelji AEC (Dodatne datoteke 1: Dodatni materiali in metodami; Dodatna datoteka 2: Slika S1) eksperimenti. Da bi raziskali možnih mehanizmov temeljne rasti, Sorta posredovano želodčni rak celic, je bilo več želodčne epitelne celične linije značilna glede na njihove različne stopnje rasti celic, ki so bile višje za AGS in celic snu-1 in manjši za MKN45 in ges-1 celic in se uporablja v tej študiji (Dodatni datotek 3: Slika S2A). V primerjavi s celicami MKN45, letnem pregledu rasti in celic snu-1, prav tako so povišane Sorta izraz (Dodatne datoteke 3: Slika S2 in S2C). temelji lentivirusni shRNA A smo uporabili za utišanje ILK
genetsko v AGS, snu-1, MKN45 in GES-1 želodca epitelnih celic (slika 1B, zgornja plošča) kot tudi v A549 in H1975 humanega pljučnega adenokarcinoma celic HK-2 ledvičnih proksimalne cevaste epitelijskih celic človeških in THP-1 človeške monocitne celice (Dodatni datotek 3: Slika S2D). V teh celic, ILK bistveno utišanje (P
< 0,05) zmanjšala rast celic (slika 1B; Dodatna datoteka 3: Slika S2E). Poleg tega obdelavo celic z zaviralcem ILK T315 [36] pomembno (P
< 0,05) in rast upočasni celic (slika 1C) brez citotoksičnosti v odvisnosti od odmerka (podatki niso prikazani). Poleg tega se je zmanjšala nastanek kolonije so opazili, Sorta utihnile AGS celic (Dodatni datoteke 3: Slika S2F). Tako je gen utišanje (Dodatna datoteka 3: Slika S2G) in farmakološke metode (Dodatna datoteka 3: Slika S2H) zatreti Sorta dejavnosti ali čezmerno privedla do aretacije celičnega ciklusa na G 1 fazi. Ti rezultati kažejo vlogo rast spodbujajoči Sorta. Slika 1 ILK izraz je potrebna za rast celic in aktivacije NF-κB. (A) predstavnik, ki temelji na fluorescenčni Imunohistokemijsko prikazuje soizražanjem ILK (zelena
) in Ki-67 (rdeče
) v človeške želodčne tumorjev in AGS, pridobljenih gomoljev v BALB /c miši. DAPI (modra
) je bila uporabljena za jedrsko counterstaining. Sorta + Ki-67 + celic v odsekih immunofluorescently obarvanih tkiva so predstavljeni kot dot-parcele na FACS podobnih analiz z uporabo TissueQuest programske opreme. Celice smo izračunali kot odstotek in število celic celotnih celic (DAPI + celic) na tem področju. (B) Western blot za ILK ekspresijo v celicah, transfektiranih s shRNAs ciljanja ILK (shILK
) ali kontrolni luciferaza (shLuc
). β-aktin uporabimo kot notranjo kontrolo. Test temelji WST-8 kaže zaviranje rasti celic pri-ILK utišan celic. (C) učinek od odmerka odvisno T315 zaviralca ILK na zaviranje rasti AGS celic. (D) Zastopnik, ki temelji na fluorescenčni Imunohistokemijsko prikazuje soizražanjem Sorta (zelena
) in fosforiliran NF-κB Ser536 (rdeča
) v človeške želodčne tumorjev in AGS, pridobljene iz gomoljev pri miših. DAPI (modra
) je bila uporabljena za jedrsko counterstaining. V dot-parcele pokazati soizražanjem Sorta in NF-κB Ser536. (E) logistična regresijska analiza je pokazala korelacijo med Sorta, fosforiliran NF-κB Ser536 in Ki-67 v 93 želodca vzorcih raka testiranih. P
vrednost R-kvadrat (R
2
) in so prikazani. (F) EMSA dokazuje aktivacije NF-κB. (G) luciferaza reporter test kaže razmerje aktivacijskega NF-κB za uravnavanje Renilla luciferazo v celicah, obdelanih z NF-κB zaviralca CAPE (25 ug /ml). (H) Rast 25 ug /ml CAPE zdravljeni AGS celic. (I) aktiviranje NF-κB v shLuc- ali-shILK transfektirana celic. (J) NF-κB aktiviranje po 6 urah zdravljenja T315 v AGS celicah. Za celično rast, nastajanje kolonij in luciferazne aktivnosti, podatki so srednja vrednost ± SD iz treh neodvisnih poskusov. * P
< 0,05, ** P
< 0,01 in *** P
< 0,001 v primerjavi z 0 dnevu ali relativne nadzorom. #P
≪ 0,05, ## P
< 0,01 in ### P
. ≪ 0,001 v primerjavi s shLuc
Za opredelitev značilnosti rasti Sorta urejeno celic, NF-KB κB signalizacijo je preučiti, saj lahko ILK deluje gorvodno od NF-κB z zakonsko ureditvijo IKKα [13]. Z imunskim barvanjem je bilo opaziti soizražanjem Sorta in fosforilirata NF-κB (Ser536) v želodčnih tkivih človeka in miško (slika 1D), in njihovo značilno soizražanjem (P
< 0,01) in v pozitivni korelaciji s številom razraščajo celic , ki se kaže v 55 triple-pozitivnih primerov vseh 93 želodca osebkov rakom (slika 1E; Dodatna datotek 4: Slika S3). Imunskim barvanjem za NF-κB jedrske prenosom (Dodatni datoteke 3: Slika S2I), EMSA (slika 1F), in promotor testi (Slika 1G) potrdil konstitutivno aktivacije NF-κB v AGS celice, ne pa tudi v MKN45 celicah. Zdravljenje celice z NF-κB zaviralca CAPE značilno (P
< 0,001) zmanjša aktivacijo NF-κB (slika 1G) in rast celic (slika 1 H). Bodisi ILK utišati (slika 1I; Dodatna datoteka 3: Slika S2J) ali zdravljenje T315 (slika 1J) značilno (P
< 0,05) ustavil NF-κB dejavnost. Ti rezultati pokazali, da je ILK nujno potrebna za rast celic v celičnih linijah testiranih saj omogoča aktivacijo NF-κB v želodcu raka.
ILK uravnava Ras aktivnost z olajšanjem kompleks IQGAP1-Ras nadzor-MAPK aktivira NF-κB
Ker AGS celice pristanišče PIK3CA
in Kras
mutacije [37], smo pregledali možne regulatorne učinke Sorta na modulacije NF-κB dejavnosti po teh 2 kinaz [38]. Uporaba Human fosfo-MAPK Array Kit, smo identificirali 10-kinaz, ki so bile višje izražene v AGS celicah kot v MKN45 celicah. Te kinaz večinoma delovali v smeri toka od signalnih poti PI3K in MAPK (Dodatni datotek 5: Slika S4A). Z Western blotting-om, smo potrdili povečano fosforilacijo AKT, ERK1 /2 in IκBα degradacije IκBα skupaj v AGS celic (slika 2A). Farmakološko inhibicijo c-Raf, MEK1 /2 in PI3K pomembno (P
< 0,05) manjša rast celic (slika 2B), IκBα fosforilacije (Ser32) in propadanje (slika 2C) in NF-κB aktivnost ( Slika 2D), kar kaže, da sta PI3Ky in Ras-aktiviranje signalnih poti pospešene aktivacije NF-κB. Učinki Sorta so obširno raziskan zaradi svojega sodelovanja z celične rasti in NF-κB-povezano AKT [4], [9]. Presenetljivo je, da ILK utišanje ni vplivalo AKT in GSK-3P fosforilacijo v letnem pregledu rasti in celic snu-1, vendar izrazito znižal c-Raf in ERK1 aktivacijo /2 v vseh celicah testiranih (slika 2E, dodatne datoteko 5: Slika S4B). Brez AKT onesposobitev, smo ocenili alternativno pot za aktivacijo NF-κB z mehanizmom, ki vključuje MAPK /p90RSK /IκBα signalizacijo [38]. Rasklapanje za Sorta
zmanjša večkratno fosforilacijo RSK (Thr573, Thr359 /Ser363 in Ser380) in IκBα fosforilacija (Ser32) in povečano IκBα kopičenje (slika 2e). Inhibicijo MEK1 /2 povzroča podobne učinke (Dodatna datoteka 5: Slika S4C) in zastoj celičnega ciklusa na G 1 faza (Dodatna datoteka 5: Slika S4D). RAS spustnem testa so pokazali, da inhibira ILK povzročil Ras deaktiviranje, ne da bi to vplivalo na obstojnost Ras proteina (slika 2F). Te ugotovitve pokazale potencialno nekanoničen pot za Sorta modulacije NF-κB z zakonsko ureditvijo Ras /c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /IκBα signalizacijo. Slika 2 ILK-IQGAP1-Ras kompleks ohranja Ras aktivnost za aktiviranje c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /RSK /IκBα /NF-κB signalizacijo. (A) Western blot izmed navedenih proteinov v AGS in MKN45 celic. β-aktin uporabimo kot notranjo kontrolo. AGS celice, ki se zdravijo z zaviralci c-Raf GW5074, MEK1 /2 zaviralci U0126 ali PD98059 ali PI3K zaviralec LY294002 za 48 ur, so ocenili njihovo rast (B), fosforilacijo IκBα na Ser32 (pIκBα
) in skupnih beljakovin (C ), ter da aktiviranje NF-κB (D). (E) shLuc- ali-shILK transfektiramo celice, zahodni blots kažejo ekspresijo navedenih proteinov. β-aktin uporabimo kot notranjo kontrolo. (F) Ras activation test pokazal Ras aktivnost in izražanje proteinov v shLuc- in-shILK transfekcije AGS celice. (G) predstavnika, ki temelji na fluorescence Imunohistokemijsko prikazuje soizražanjem Sorta (zelena
) in fosforilirano ERK1 /2 Tyr202 /Thr204 (rdeča
) v človeške želodčne tumorjev in AGS, pridobljene iz gomoljev v BALB /c miši. DAPI (modra
) je bila uporabljena za jedrsko counterstaining. V dot-ploskvah kažejo soizražanjem navedenih proteinov. Pri nadzoru in IQGAP1 siRNA-transfektiranih AGS celic v 48 urah, izraz navedenih proteinov (H), so bili prikazani aktiviranje NF-κB in rast celic (I). Beljakovinski lizati, pridobljeni iz neobdelanih AGS celic (J) ali z shLuc in shILK transfekciji (L, M) je bilo imuno (IP
) s kontrolno IgG (C. IgG
) ali s protitelesi proti Sorta, IQGAP1, in Ras . Immunoblots (IB
) kažejo izražanje Sorta, IQGAP1 in Ras. (K) predstavnika, ki temelji na fluorescence Imunohistokemijsko prikazuje soizražanjem Sorta (zelena
), IQGAP1 (rdeča
), in Ras (rdeča
) v AGS celicah. DAPI (modra
) je bila uporabljena za jedrsko counterstaining. Za orožja in luciferazne aktivnosti, podatki so srednja vrednost ± SD iz treh neodvisnih poskusov. ** P
< 0,01 in *** P
< 0,001 v primerjavi s kontrolo. Upright trikotnik, povečano izražanje; obrnjenem trikotniku, zmanjšano izražanje
Sorta se lahko spremeni ERK1 /2 aktiviranje pod celično rast in diferenciacijo [22].; Vendar pa ni dokumentirano molekulska ureditev povezana z Ras signaliziranju [2] [3]. Soizražanjem Sorta in fosforiliranega ERK1 /2 (Tyr202 /Thr204) je bila dokazana v človeških želodčnih tumorjev in AGS-izpeljana gomoljev v BALB /c miši (Slika 2G). Sorta komunicira z IQGAP1 [7], v Ras GTPase-aktiviranje podobne beljakovine, ki je povsem drugačno od DKP, ki se spreminja RAS na njeno neaktivno stanje. Ker IQGAP1 Nadzor Ras /MAPK signalizacijo, je onkogeni [39], [40]. Izraz IQGAP družinskih beljakovin je v letnem pregledu rasti in MKN45 celic nespremenjena tudi po Sorta utišanje (Dodatna datotek 5: Slika S4E). Vendar utišanje onkogenega IQGAP1, vendar ne IQGAP3 (Dodatna datoteka 5: Slika S4F-S4H) učinkovito inhibira c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /RSK signalizacijo (slika 2H), NF-κB dejavnost in rast celic ( Slika 2i). Z izvedbo coimmunoprecipitation testa smo pokazali potencialno kompleksno zatočišča Sorta, IQGAP1 in Ras (slika 2J). Imunskim barvanjem je potrdil, da je bil ILK hkrati izraženi na ravneh, ki so podobni tistim iz IQGAP1 in Ras (slika 2K; Dodatna datoteka 6: Slika S5). Predvsem, utišanje ILK prekinil IQGAP1-Ras kompleks (Slika 2L in 2M). Ti rezultati pokazali, da ILK omogočila nastanek kompleksa IQGAP1-Ras za ohranitev Ras dejavnost.
Encimska ILK modulira tvorbo IQGAP1-Ras kompleksno in ERK1 /2-posredovano rast celic
Naše ugotovitve je pokazala, da farmakološko inhibicijo Sorta je zmanjšala rast celic, kar kaže na pomembno vlogo encimskega Sorta. Dodatne zaviranjem ILK z genskim pristopom motena IQGAP1 posredovane Ras signalizacijo. Inhibicijo ILK aktivnost farmakološko z T315 (slika 3A) ali gensko s transfekcijo encimsko mutant ILK A262V [41] (slika 3B), moten tudi tvorbo kompleksa IQGAP1-Ras v AGS celicah. Tri okrnjenih regije Sorta (slika 3C) so bili izraženi pri celicah MKN45 opredeliti domeno bistveno za ohranjanje IQGAP1-Ras kompleks. Coimmunoprecipitation testi pokazali, da prekomerno ILK gradi zatočišča PH in katalizatorje kinaze domen regije imuno z IQGAP1 in Ras (slika 3D). Zato ILK le kinaze vsebuje domena aktivira ERK1 /2 (Slika 3E). V primerjavi z Sorta polne dolžine (ILK 1-452), transfektiranje na kinaze mrtev mutant Sorta A262V ni aktivirati ERK1 /2 (slika 3F). Dodatni poskusi pokazali, da le-kinaza, ki vsebujejo domena ILK povečala MEK1 /2-urejeno NF-κB aktivacijo (slika 3G), nato pa MEK1 /2- in NF-κB regulirane rast celic (slika 3 h) v MKN45 celicah. Ti rezultati so pokazali, da encimska ILK posredovano tvorbo kompleksa IQGAP1-Ras sproži ERK1 /2- in NF-κB posredovanega rast celic. Slika 3 Prisilna ILK izraz pospešuje rast celic, tako da spodbujajo aktivacijo ERK1 /2 /NF-κB. Beljakovinski lizati, pridobljeni iz AGS celic, ki so se zdravili z T315 (A) ali transfekciji z myc-DDK označijo mutant ILKA262V (B) je bilo imuno (IP
) s protitelesi proti Sorta. Immunoblots (IB
) kažejo izražanje Sorta, IQGAP1 in Ras. Plazmidi, ki temeljijo na pcDNA3.1-zastave-Sorta, ki vsebujejo Sorta celovečerni (Sorta
1
-452
), fragment 171-452 (Sorta
171
-452
) smo fragment 1-170 (Sorta
1
-170
) (C), ali myc-DDK označijo mutant ILKA262V transfektirali v MKN45 celice. (D) Coimmunoprecipitation zastave z navedenimi proteinov je prikazano z metodo Western blot. V primerjavi z pcDNA3.1-Flag (Flag
) le, zahodni blots kažejo izražanje fosforiliranega ERK1 /2 na Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (E, F). β-aktin uporabimo kot notranjo kontrolo. NF-κB aktivacijo (G) in rast celic (H) so bile odkrite tudi v odsotnosti ali prisotnosti PD98059 in CAPE. Podatki so povprečje ± SD iz treh neodvisnih eksperimentov. ** P
< 0,01 v primerjavi s kontrolo. ## P
< 0.01 v primerjavi z ILK1-452. Upright trikotnik, povečano izražanje.
Aktivacije PI3K in zmanjšala PTEN izraz olajšanje ERK1 /2 /NF-κB aktivacijo s stabilizacijo Sorta
Ker Sorta je odvisna od-PI3K posredovano generacije PIP3 za njeno aktiviranje [4], rast Factor in-integrin posredovane aktivacije PI3K ali PI3K mutacije v AGS celic [37] bi lahko prispevala k Sorta izražanja in aktivacijo. V primerjavi z rastjo MKN45 celic, je bilo izpostavljeno povišani IL-6 stopenj [42], in izražanje β1 in p3 integrinov ni povečala (Dodatni datotek 7: Slika S6) se je rast v AGS celic. Mi še potrdil, da je generacija PIP3 višja v-PI3K mutiral AGS celic (slika 4A). Raziskati odnose med PI3K, Sorta, in Ras signalne poti, so AGS celice zdravijo z MEK1 /2, PI3K, Sorta, ali Ras inhibitor za trajajo različno dolgo. Na 6 ur po obdelavi, T315 nekoliko zaviral MEK1 /2 in ERK1 /2 fosforilacijo (Dodatne datoteko 8: Slika S7). V 24 urah po zdravljenju, PI3K zaviranje moten ILK izraz, ki je sledila MEK1 /2 /ERK1 /deaktiviranje 2 24 ur po zdravljenju (slika 4B). Vendar zaviranja Ras ni izključiti AKT ali Sorta v AGS celicah, čeprav se lahko Ras posredovanje aktivacije PI3K [27]. Podobno kot pri-Sorta utišani AGS celic, tako MKN45 in LY294002 spodbudila AGS celice so kazali zmanjšano aktivnost Ras (slika 4C). inhibitor prevod cikloheksimid olajšati-LY294002 povzroča ILK downregulation The (slika 4D) in zaviralec proteasoma MG132 obrnil omenjeni učinek in ERK1 /2 inaktivacijo (slika 4e). Tumor poka fosfataze PTEN negativno uravnava PI3K /PDK1 /AKT signalizacijo [10], [11] in Sorta dejavnosti [8], [9], in AGS celice pokazal nizko izražanje PTEN (slika 2A) [43]. Prisilno izraz PTEN v AGS celicah oslabljen ne le konstitutivno fosforilacijo PDK1, AKT, in PAK1 ampak tudi zavrla ILK izražanje, ERK1 /2 fosforilacijsko (Slika 4F), in aktivacije NF-κB (slika 4G). Ti rezultati so pokazali, da aktiviranje PI3K in zmanjšala PTEN izraz stabilizacijo Sorta za urejanje ERK1 /2 /NF-κB aktivacijo. Slika 4 aktivacije PI3K in zmanjšala PTEN izraz olajšanje ERK1 /2 /NF-κB aktivacijo preko stabilizacije Sorta. (A) PIP3 Mass ELISA kit je bila uporabljena za določitev PI3K aktivnosti z merjenjem količine PIP3 pridobljene iz neobdelanega AGS in MKN45 celic in iz AGS celicah, obdelanih s LY294002 24 h. (B) AGS celice so zdravili z PD98059, LY294002, T315, ali Ras inhibitorjev FTI-277 za navedene čase. Zahodnih blots kažejo ekspresijo navedenih proteinov. β-aktin uporabimo kot notranjo kontrolo. (C) Ras aktivnost je bila odkrita v letnem pregledu rasti, MKN45 in AGS celic LY294002 obdelan po 24 urah. Zahodnih blots kažejo ekspresijo navedenih proteinov v celicah AGS predhodno obdelane z zaviralcem prevajanje cikloheksimid (CHK
) (d) ali inhibitorjev proteasoma MG132 (E) za 0,5 h in nato obdelamo z LY294002 24 h. PTEN so izraženi pri AGS celicah z uporabo pcDNA3.1-GFP-PTEN (PTEN
). Zahodnih blots kažejo ekspresijo navedenih proteinov v primerjavi z pcDNA3.1-GFP (Vector
) transfekciji (F), in je bila določena tudi NF-κB aktivacijo (G). Za kinaze in luciferazne aktivnosti, podatki so srednja vrednost ± SD iz treh neodvisnih poskusov. * P
< 0,05, ** P
< 0,01 in *** P
< 0,001 v primerjavi s kontrolo. Upright trikotnik, povečano izražanje; obrnjenem trikotniku, zmanjšano izražanje.
hsp90 povezano E3 ligaza CHIP negativno kontrole stabilizacija ILK, ERK1 /2 /NF-κB aktiviranje in rast celic
Z dodatno preverjanje mehanizma osnovno Sorta destabilizacijo, naši rezultati so pokazali, da zaviranje AKT ni vplival Sorta stabilnost, medtem ko je zaviranje PI3K stabilnost prizadete Sorta (Dodatni datoteke 9: Slika S8). Hsp90 je naslednja preiskava, saj lahko povzročijo razgradnjo Sorta [25]. Podobno rezultati inhibicije PI3K, ki temelji na shRNA (slika 5A) ali farmakološki inhibicijo HSP90 (Dodatna datoteka 10: Slika S9A) zamudo, ne samo PDK1 /AKT fosforilacijo, ampak tudi c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 aktivacije po Sorta razgradnje. Poleg tega gensko ali farmakološko inhibicije HSP90 zdravljenje z 17-AAG ali inhibitor HDAC Saha, ki pasti HSP90 v acetiliranih, encimsko neaktivnem stanju, oslabljen NF-κB aktivnosti (slika 5B; Dodatna datotek 10: Slika S9B) in rast celic ( slika 5C). Sočasnim zdravljenjem z MG132 rešil učinke 17-AAG (Slika 5D) in SAHA na degradacijo Sorta in ERK1 /2 inaktivacije (Dodatni datoteko 10: Slika S9C). V celicah MKN45, zdravljenje z MG132 povečala Sorta izraz, MEK1 /2 in ERK1 /2 fosforilacijo (Dodatne datoteko 11: Slika S10), in aktiviranje NF-κB (podatki niso prikazani). Coimmunoprecipitation dokazali tvorbo hsp90-ILK kompleks (podatki niso prikazani). Uporaba shRNA pristop, ki temelji lentivirusni (slika 5e), hsp90, povezane E3 ligaze, vključno CHIP, cullin 4A in cullin 4B [26], [44], [45], so bili pregledani za svoje vloge v degradacijo Sorta. Rezultati so pokazali, da je le utišati CHIP rešil propadanja Sorta in ERK1 /2 inaktivacijo (Slika 5F), NF-κB deaktivacijo (Slika 5G) in zaviranje rasti celic (Slika 5h) po farmakološko inhibicijo PI3K in HSP90. CHIP je potrebna za Sorta ubikvitinacije v AGS celic LY294002 obdelan (Slika 5i). Ti rezultati pokazali, da hsp90 /CHIP signalizacijo ureja stabilizacijo Sorta-PI3K posredovano in-Sorta urejeno ERK1 /2 /NF-κB aktivacijo in s tem pospešuje rast celic. Slika 5 CHIP določa Sorta destabilizacijo, ERK1 /2 /NF-κB inaktivacijo, zaviranje rasti celic po PI3K /HSP90 deaktivacijo. AGS celice smo transfektirali z shLuc ali shHSP90 ali obdelali s HSP90 inhibitor 17-AAG (0,1 um) za 48 ur. Zahodnih blots kažejo ekspresijo navedenih proteinov (A), in smo določili tudi NF-κB aktivacijo (B) in rast celic (C). (D) MG132 predobdelavo (0,5 h) obrnila Sorta izražanja in fosforilirano ERK1 /2 na Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) v 17-AAG-zdravljenih AGS celic. (E) CHIP, cullin 4A in cullin 4B bili utišani v AGS celic z shRNAs. shRNA-transficirane celice so bili zdravljeni z LY294002 ali 17-AAG 24 h. Western blot pokazala ekspresijo ILK in fosforiliranega ERK1 /2 na Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (F), in smo določili tudi NF-κB aktivacijo (G) in rast celic (H). (I) V shLuc- in shCHIP-transfekciji celic AGS zdravljenih z LY294002 je ILK imuno, in njegovo ubiquitylation bilo zaznati. Za zahodni analizo blot, je β-aktina uporablja kot notranje kontrole. Za luciferazno aktivnost in celične rasti, podatki so povprečje ± SD iz treh neodvisnih eksperimentov. ** P
< 0,01 in *** P
< 0,001 v primerjavi s kontrolo. ## P
< 0,01 in ### P
< 0,001 v primerjavi s shLuc ali DMSO. NS: ni pomembno. Upright trikotnik, povečano izražanje; obrnjenem trikotniku, zmanjšano izražanje.
PI3K /hsp90 /CHIP /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-κB signalizacijo prispeva k celične migracije in občutljivost za 5-FU in cisplatina PODJETJA
Povečana Sorta dejavnost ali izraz mogli urediti onkogeni postopki, vključno celično proliferacijo, migracijo in preživetje [3], [6]. Raziskovali smo morebitno udeležbo na opredeljenem PI3K /hsp90 /CHIP /Sorta /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-κB signalne poti v prednosti rasti celic. V primerjavi s celicami MKN45, je pokazala AGS celice povečal migracijski dejavnosti; Vendar ILK ali IQGAP1 bistveno utišanje (P
< 0,001) odpraviti celične migracije (Dodatni datotek 12: Slika S11A). Farmakološko blokiranje PI3K /hsp90 /Sorta /MEK1 /2 /NF-κB signalizacije v AGS celicah tudi značilno (P
< 0,001) oslabljen migracijska sposobnost (dodatne datoteke 12: Slika S11B), in CHIP rasklapanje precej obrne zaviralni učinki, ki jih inhibicijo PI3K in HSP90 povzročene (slika 6A; Dodatni datotek 12: Slika S11C). So agenti proti raku 5-FU in cisplatina se običajno uporabljajo za zdravljenje želodčnih raka [46]. Obdelavo AGS celice s 5-FU in cisplatina, zlasti po Sorta ali IQGAP1 utišanje, povzroča povečano občutljivost za apoptozo (slika 6B). T315 povečana občutljivost AGS celic za 5-FU in cisplatina (Dodatni datoteke 12: Slika S11D). Farmakološko inhibicijo PI3K /hsp90 /ILK /MEK1 /2 /NF-κB signalizacijo občutljivi tudi letni pregled rasti celic za 5-FU-inducirane apoptoze (slika 6c), medtem ko CHIP utišanje zaostal sinergijske učinke LY294002 in 17-AAG na 5-FU inducirano apoptozo (slika 6D). V nasprotju s čezmernim Sorta vsebuje pospeševalni kinaze domeno, vključno Sorta 1-452 in ILK 171-452, okrepljeno MEK1 /2 /NF-κB regulirane celične migracije (slika 6E) in celično preživetje po zdravljenje s 5-FU (Slika 6F). Ti rezultati kažejo skupne učinke Sorta in IQGAP1 na ERK1 aktivaciji /2 /NF-κB za migracijo celic in preživetje. Slika 6 PI3K /hsp90 /CHIP /ILK /ERK1 /2 /NF-κB signalizacijo določa migracijo celic in nadzoruje dovzetnost do zdravili proti raku 5-FU in cisplatin. (A) migracije aktivnost smo testirali v shLuc- ali shCHIP-transfektiranih celic AGS zdravljenih s LY294002 (25 uM) in 17-AAG (0,2 uM) za 12 ur. shLuc, nadzor siRNA ali DMSO smo uporabili kot negativni kontroli. Število preseljenih celic v opazovanem področju so prikazani. PI obarvanje sledi pretočno citometrijo analiza je pokazala, 5-FU ali-cisplatin inducirano apoptozo za 2 dni v shILK- ali siIQGAP1-transfekciji AGS celic (B), AGS celice predhodno obdelane z navedenimi zaviralci 0,5 ure (C), in shLuc- ali shCHIP-transfektirali AGS celice, obdelane z LY294002 ali 17-AAG (D). shLuc, nadzor siRNA ali DMSO smo uporabili kot negativni kontroli. Plazmidi, ki temeljijo na pcDNA3.1-zastave-Sorta, ki vsebujejo Sorta celovečerni (Sorta
1
-452
), fragment 171-452 (Sorta
171
-452
) ali fragment 1-170 (Sorta
1
-170
) transfektirali v MKN45 celice. V primerjavi z pcDNA3.1-Flag (Flag
) le, celične migracije (E) in apoptozo s 5-FU (5 uM) (F) inducirane bili odkriti v odsotnosti ali prisotnosti PD98059 in CAPE. Podatki so povprečje ± SD iz treh neodvisnih eksperimentov. * P
< 0,05, ** P
< 0,01 in *** P
< 0,001 v primerjavi s kontrolo. #P
≪ 0,05, ## P
< 0,01 in ### P
< 0,001 v primerjavi s kontrolo. * P
< * P
< ** P
< * P
<

• Kombinirane funkcije, ki temeljijo na MT1-MMP izražanja, CD11b + immunocytes gostota in LNR napovedati klinične rezultate rakom želodca
• Značilnosti Epstein Barr virus variante, povezano z rakom želodca v južni Tuniziji