Un aumento della chinasi integrina-linked conferisce non canonicamente vantaggi della crescita di NF-kB-mediate a cellule di cancro gastrico attivando ERK1 /2

Un aumento della chinasi integrina-linked non canonicamente conferisce vantaggi della crescita di NF-kB-mediate da cellule di cancro gastrico da l'attivazione di ERK1 /2
Abstract
sfondo
aumento dell'attività o l'espressione della chinasi integrina-linked (ILK), che regola l'adesione cellulare, la migrazione e la proliferazione, porta alla oncogenesi. Abbiamo identificato le basi molecolari per la regolazione della ILK e il suo ruolo alternativo nel conferimento ERK1 /2 /NF-kB mediata vantaggi di crescita di cellule di cancro gastrico.
Risultati
ILK inibitrice con RNA breve forcina o T315, un putativo inibitore ILK, abolito NF-kB-mediata della crescita delle cellule di cancro gastrico AGS umani, SNU-1, MKN45, e GES-1. ILK stimolato l'attività di Ras per attivare la c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /ribosomiale S6 chinasi /inibitore della segnalazione κBα /NF-kB, facilitando la formazione del IQ motivo contenenti proteina gap 1 (IQGAP1) - complesso di Ras. Forzata espressione ILK enzimatico promosso la crescita delle cellule, facilitando ERK1 /2 /NF-kB di segnalazione. attivazione di PI3K o diminuita espressione di PTEN prolungata 2 attivazione /ERK1 proteggendo ILK dalla degradazione proteasoma-mediata. C-terminale di shock termico cognate 70 interagenti proteine, un E3 ubiquitina ligasi HSP90-associata, mediata ubiquitination ILK per il controllo e la stabilizzazione PI3K- ILK HSP90-regolata e di segnalazione. Oltre alla crescita cellulare, il percorso identificato promosso migrazione cellulare e riduce la sensibilità delle cellule di cancro gastrico al agenti antitumorali 5-fluorouracile e cisplatino. Inoltre, la somministrazione esogena di EGF, così come l'iperespressione di EGFR innescato ILK- e IQGAP1 regolata ERK1 /2 /NF-kB attivazione, la crescita cellulare e la migrazione.
Conclusione
Un aumento ILK non canonicamente promuove ERK1 /2 /attivazione di NF-kB e porta alla crescita delle cellule di cancro gastrico.
Parole
ILK crescita cellulare IQGAP1 ERK1 /2 NK-kB Sfondo
chinasi integrina-linked (ILK), un 59-kDa serina /treonina chinasi, interagisce direttamente con il dominio citoplasmatico di β1 dell'integrina [1]. ILK comprende tre domini: N-terminale ankyrin (ANK) ripete, una omologia pleckstrin centrale (PH) -come dominio, e un dominio chinasi C-terminale [2], [3]. matrice extracellulare delle cellule-integrina-mediata (ECM) di adesione o fattori di crescita attivano fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) di fosforilare di membrana PI 4,5-bisfosfato (PIP2) e generare PI 3,4,5-trifosfato (PIP3), che si lega al dominio PH-come ILK e attiva ILK [4], [5]. Dopo l'attivazione ILK, il dominio chinasi C-terminale del ILK può legarsi a diverse proteine, tra cui AKT, affixin, β-Parvin, glicogeno sintasi chinasi (GSK) -3β, calponin proteina ILK-binding omologia contenenti, il 20-kDa normativo catene leggere della miosina (LC20), la subunità miosina-targeting della miosina catena leggera fosfatasi (MYPT1), paxillina, α-NAC, e gli inibitori della proteina fosfatasi PHI-1, kepi, e CPI-17 [2], [3] , [6], [7]. Le ripetizioni ANK N-terminale mediano l'interazione di ILK con ILKAP, un membro della famiglia 2C proteina fosfatasi, e un pizzico, un dominio di sola proteina adattatrice LIM. ILK può essere considerato un PIP3 interagenti proteine ​​a valle di PI3K; i suoi effetti sono bloccati da fosfatasi e tensina omologo cancellato sul cromosoma 10 (PTEN) [8], [9]. PTEN sopprime i tumori defosforilando PIP3 [10], [11]
ILK svolge un ruolo fondamentale nel regolare vari processi cellulari, tra cui la proliferazione, la sopravvivenza, la migrazione, la progressione del ciclo cellulare, e l'angiogenesi.; aumento di attività o espressione di ILK porta alla oncogenesi [2], [3]. Oltre modulando le sue proteine ​​partner per i processi cellulari, ILK si ipotizza di essere coinvolto in una rete di trasduzione del segnale intracellulare. Meccanicamente, ILK fosforila direttamente AKT su ser473 e GSK-3β su ser9 [4], [9] per mediare β-catenina traslocazione e regolare AP-1 per la proliferazione delle cellule tumorali [12]. L'attivazione di NF-kB è essenziale per i processi oncogeni LATTIERO-CASEARI EU-mediata, come l'attività anti-apoptotica [13], la promozione di sopravvivenza [14], transizione epitelio-mesenchimale [15], ampliamento cellulare e resistenza all'apoptosi [16], l'angiogenesi [17 ], e la migrazione, l'invasione e metastasi [18] - [20]. Inoltre, l'attivazione di NF-kB è necessario per la regolamentazione canonica di IKKα e IKKß attraverso la via ILK /AKT. Per attivare la migrazione delle cellule, ILK può attivare la piccola GTPasi RAC e CDC42 [21]. Inoltre, ILK regola ERK1 /2 attivazione differenziamento miogenico [22]. espressione di microRNA-143 e microRNA-145 Maggiore, che prendono di mira ILK, inibisce AKT e ERK1 /2 vie [23]. Tuttavia, il sottostante meccanismo molecolare di attivazione ILK-mediata ERK1 /2 rimane sconosciuta.
La stimolazione delle cellule da fattori di crescita e citochine, nonché l'interazione cellulare con l'attività aumento ECM ILK [24]. Oltre alla regolazione molecolare del PI3K /PTEN da ILK, Aoyagi et al. ILK identificato come una nuova proteina heat shock proteine ​​cliente (HSP) 90 e ha scoperto che l'inibizione farmacologica HSP90 ha provocato il degrado ILK in maniera proteasoma-dipendente [25]. Inoltre, la HSP90 associata E3 ubiquitina ligasi C-terminale di shock termico cognate 70 interagenti proteine ​​(CHIP) fa sì che il degrado ILK [26]. Hashiramoto et al. ha dimostrato che HSP90 stabilizzato ILK e sostenuta AKT e ERK1 2 attivazione /[16]. Pertanto, ipotizziamo un rapporto tra stabilità ILK e l'attivazione dei suoi chinasi a valle. Ras /MAPK pathway di segnalazione è essenziale per la tumorigenesi [27]. espressione ILK L'aumento è legato al cancro ad alto grado gastrica [28], il cancro alla prostata [29], e il cancro polmonare non a piccole cellule [30], anche se le cellule in questi tumori comunemente porto mutazioni Ras [31] - [33]. Targeting ILK con siRNA diminuisce l'invasione cancro gastrico delle cellule, la proliferazione e la crescita attraverso un meccanismo sconosciuto [34]. Per quanto riguarda la possibilità che ILK agisce a monte di NF-kB, regolando IKKα [13], che è stata implicata nella tumorigenesi gastrica [35], ILK è speculato per attivare la crescita delle cellule attraverso un percorso di NF-kB-regolamentato. Utilizzando cellule di cancro gastrico (AGS, MKN45, e SNU-1), abbiamo studiato la regolazione molecolare di ILK e ha individuato un percorso non canonico di ERK1 /2 attivazione ILK-regolato per NF-kB mediata crescita gastrico delle cellule tumorali, la migrazione, e la sopravvivenza di promozione
. Risultati
attività ILK e di espressione sono essenziali per NF-kB mediata crescita cellulare
aumento dell'attività o l'espressione di ILK migliora tumorigenesi, promuovendo la crescita delle cellule [6]. RNAi-based ILK silenziamento attenua la crescita delle cellule del cancro gastrico [34], mentre sovraespressione ILK è legato alla tumorigenesi gastrica [28]. Nei tumori gastrici umani e noduli AGS-derivati ​​in topi BALB /c, Ki-67-positivo cellule proliferanti ILK coexpressed come dimostra la fluorescenza a base di immunocolorazione (Figura 1A) e immunocolorazione AEC-based (sui file 1: materiali e metodi supplementari; sui file 2: Figura S1) esperimenti. Per studiare i possibili meccanismi di crescita gastrico delle cellule tumorali ILK-mediata sottostante, diverse linee di cellule epiteliali gastriche sono stati caratterizzati secondo i loro tassi di crescita delle cellule differenti, che erano più elevati per le AGS e SNU-1 le cellule e inferiore per la MKN45 e le cellule GES-1 , e usato in questo studio (sui file 3: Figura S2A). Rispetto ai MKN45 cellule, i AGS e le cellule SNU-1 aveva anche elevati espressione ILK (sui file 3: Figura S2B e S2C). A shRNA basato lentivirale è stato usato per silenziare ILK
geneticamente nelle AGS, SNU-1, MKN45 e GES-1 gastriche cellule epiteliali (Figura 1B, pannello superiore) e in A549 e cellule di adenocarcinoma del polmone umano H1975, HK-2 renali prossimali tubulari cellule epiteliali umane e cellule THP-1 monociti umani (file aggiuntivo 3: Figura S2D). In queste cellule, ILK tacere in modo significativo (P
< 0,05) è diminuita la crescita delle cellule (Figura 1B; sui file 3: Figura S2E). Inoltre, trattando le cellule con l'inibitore ILK T315 [36] significativamente (P
< 0,05) e dose-dipendente crescita cellulare ritardata (Figura 1C) senza citotossicità (dati non mostrati). Inoltre, è diminuita formazione di colonie è stata osservata nelle cellule AGS LATTIERO-CASEARI EU-silenziata (sui file 3: Figura S2F). Così, silenziamento genico (sui file 3: Figura S2G) e metodi farmacologici (sui file 3: Figura S2H) per sopprimere l'attività ILK o sovraespressione portato ad arresto del ciclo cellulare al G 1 fase. Questi risultati dimostrano un ruolo di crescita di promozione della risma. Figura 1 espressione ILK è necessario per la crescita cellulare e l'attivazione di NF-kB. (A) Rappresentante di fluorescenza a base di colorazione immunoistochimica mostra la coexpression di ILK (
verde) e Ki-67 (
rosso) nei tumori gastrici umani e noduli AGS-derivati ​​in topi BALB /c. DAPI (blu
) è stato utilizzato per di contrasto nucleare. ILK + Ki-67 + cellule nelle sezioni di tessuto immunofluorescently colorate sono presentati come dot-trame di un'analisi FACS simile utilizzando il software TissueQuest. Le cellule sono state calcolate come percentuale e il numero di cellule delle cellule totali (cellule DAPI +) per campo. (B) Western blot dell'espressione ILK in cellule trasfettate con shRNAs di targeting ILK (shILK
) o un controllo luciferasi (shLuc
). β-actina è stato utilizzato come controllo interno. test a base di WST-8 mostra l'inibizione della crescita delle cellule in cellule LATTIERO-CASEARI EU-tacere. (C) L'effetto dose-dipendente del T315 inibitore ILK sulla inibizione della crescita delle cellule AGS. (D) Rappresentante di fluorescenza a base di colorazione immunoistochimica mostra la coexpression di ILK (
verde) e fosforilata di NF-kB Ser536 (
rosso) nei tumori gastrici umani e noduli AGS-derivati ​​nei topi. DAPI (blu
) è stato utilizzato per di contrasto nucleare. Dot-trame mostrano la coespressione di ILK e NF-kB Ser536. L'analisi di regressione (E) logistica ha mostrato una correlazione tra ILK, fosforilata NF-kB Ser536, e Ki-67 in 93 campioni di cancro gastrico testati. P
valori R-squared (R 2
) e sono illustrati. (F) EMSA dimostrando attivazione di NF-kB. assay giornalista (G) luciferasi mostra la proporzione attivazione di NF-kB per controllare Renilla luciferasi in cellule trattate con il NF-kB inibitore CAPE (25 mg /mL). (H) la crescita delle cellule di 25 mg /ml CAPE trattati con AGS. (I) l'attivazione di NF-kB in shLuc- o cellule shILK transfettate. (J) di NF-kB attivazione dopo 6 ore di trattamento T315 nelle cellule AGS. Per la crescita cellulare, formazione di colonie, e l'attività della luciferasi, i dati sono SD ± media da tre esperimenti indipendenti. * P
< 0.05, ** P
< 0,01, e *** P
< 0,001 rispetto al giorno 0 o relativo controllo. #P
≪ 0,05, ## P
< 0,01 e ### P
. ≪ 0,001 rispetto a shLuc
Per caratterizzare le caratteristiche di crescita delle cellule ILK-regolato, NF kB segnalazione è stata esaminata perché ILK può agire a monte di NF-kB, regolando IKKα [13]. Con immunostaining, la coespressione di ILK e fosforilata di NF-kB (Ser536) è stata osservata in umano e topo tessuti gastrici (Figura 1D), e la loro coexpression significativamente (P
< 0,01) e positivamente correlata con il numero di cellule proliferanti , che viene indicato da 55 casi triple-positivi del totale dei 93 campioni di cancro gastrico (Figura 1E; file aggiuntivo 4: Figura S3). Immunocolorazione per NF-kB traslocazione nucleare (sui file 3: Figura S2I), EMSA (Figura 1F), e promotore saggi (Figura 1G) hanno confermato l'attivazione costitutiva di NF-kB nelle cellule AGS, ma non nelle cellule MKN45. Trattare le cellule con la NF-kB inibitore CAPE significativamente (P
< 0,001) ridotto l'attivazione di NF-kB (Figura 1G) e la crescita delle cellule (Figura 1 H). In entrambi i casi ILK tacere (Figura 1I; sui file 3: Figura S2J) o il trattamento T315 (Figura 1 undecies) significativamente (P
< 0,05) fermato l'attività di NF-kB. Questi risultati hanno dimostrato che ILK è indispensabile per la crescita cellulare nelle linee cellulari testate perché facilita l'attivazione di NF-kB nei tumori gastrici.
ILK regola l'attività di Ras facilitando il complesso di IQGAP1-Ras per controllare MAPK-attivato NF-kB
Poiché le cellule AGS porto PIK3CA KRAS
mutazioni [37]
e, abbiamo esaminato i possibili effetti regolatori della ILK sulla modulazione dell'attività di NF-kB da parte di questi 2 chinasi [38]. Utilizzando un kit di matrice umana fosfo-MAPK, abbiamo identificato 10 chinasi che sono stati più altamente espresso nelle cellule AGS che nelle cellule MKN45. Queste chinasi per lo più hanno agito a valle delle vie di segnalazione PI3K e MAPK (file aggiuntivo 5: Figura S4A). Con western blotting, abbiamo confermato un aumento della fosforilazione di AKT, ERK1 /2, e IκBα accompagnato da degrado IκBα nelle cellule AGS (Figura 2A). L'inibizione farmacologica di c-Raf, MEK1 /2 e PI3K significativamente (P
< 0,05) ha ridotto la crescita delle cellule (Figura 2B), IκBα fosforilazione (Ser32) e la degradazione (Figura 2C), e l'attività di NF-kB ( Figura 2D), che indica che sia PI3K- e Ras-attivazione di vie di segnalazione facilitato l'attivazione di NF-kB. Gli effetti di ILK sono stati ampiamente studiati per le sue interazioni con alla crescita cellulare e AKT NF-kB-associato [4], [9]. Sorprendentemente, ILK silenziamento non ha influenzato AKT e GSK-3β fosforilazione nelle AGS e le cellule SNU-1, ma marcatamente ridotta c-Raf e /2 attivazione di ERK1 in tutte le cellule testate (Figura 2E; sui file 5: Figura S4B). Senza AKT disattivazione, abbiamo valutato una via alternativa per l'attivazione di NF-kB attraverso un meccanismo che coinvolge MAPK /p90RSK /IκBα segnalazione [38]. L'atterramento di ILK
ridotto la fosforilazione multiplo di RSK (Thr573, Thr359 /Ser363 e Ser380) e IκBα fosforilazione (Ser32) ed ha aumentato l'accumulo IκBα (Figura 2E). L'inibizione MEK1 /2 ha provocato effetti simili (sui file 5: Figura S4C) e un arresto del ciclo cellulare al G 1 fase (sui file 5: Figura S4D). Un test di pull-down Ras rivelato che inibendo ILK causato Ras disattivazione senza compromettere la stabilità della proteina Ras (Figura 2F). Questi risultati hanno dimostrato un potenziale percorso non canonica per ILK di modulare NF-kB regolando segnalazione Ras /c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /IκBα. Figura 2 ILK-IQGAP1-Ras complesso sostiene l'attività di Ras per attivare c-Raf /MEK1 2 /ERK1 /2 /RSK /IκBα /NF-kB segnalazione /. (A) Western blot delle proteine ​​indicate nelle cellule AGS e MKN45. β-actina è stato utilizzato come controllo interno. le cellule trattate con AGS c-Raf inibitore GW5074, MEK1 /2 inibitori U0126 o PD98059, o inibitori PI3K LY294002 per 48 ore sono stati valutati per la loro crescita (B), la fosforilazione di IκBα a Ser32 (pIκBα
) e proteine ​​totali (C ), e l'attivazione di NF-kB (D). (E) In shLuc- o cellule shILK-trasfettate, macchie occidentali mostrano l'espressione delle proteine ​​indicate. β-actina è stato utilizzato come controllo interno. test di attivazione (F) Ras che mostra l'attività di Ras e di espressione della proteina in shLuc- e cellule AGS shILK transfettate. (G) Rappresentante di fluorescenza a base di colorazione immunoistochimica mostra la coexpression di ILK (
verde) e ERK1 fosforilata /2 Tyr202 /Thr204 (
rosso) nei tumori gastrici umani e noduli AGS-derivati ​​in topi BALB /c. DAPI (blu
) è stato utilizzato per di contrasto nucleare. Dot-trame mostrano la coespressione delle proteine ​​indicate. Nel controllo e le cellule AGS IQGAP1 siRNA-trasfettate a 48 h, l'espressione delle proteine ​​indicate (H), sono stati mostrati attivazione di NF-kB, e la crescita delle cellule (I). lisati proteici estratti da cellule non trattate AGS (J) o con shLuc e shILK trasfezione (L, M) sono stati immunoprecipitati (
IP) con IgG di controllo (C.
IgG) o con anticorpi contro ILK, IQGAP1, e Ras . Immunoblot (IB
) mostrano l'espressione di gente, IQGAP1, e Ras. (K) Rappresentante di fluorescenza a base di colorazione immunoistochimica mostra la coexpression di ILK (
verde), IQGAP1 (
rosso), e Ras (
rosso) nelle cellule AGS. DAPI (blu
) è stato utilizzato per di contrasto nucleare. Per la proliferazione e l'attività della luciferasi, i dati sono SD ± media da tre esperimenti indipendenti. ** P
< 0,01 e *** P
< 0,001 rispetto al controllo. triangolo verticale, maggiore espressione; triangolo rovesciato, diminuita espressione
ILK può modificare 2 attivazione /ERK1 sotto la crescita e la differenziazione cellulare [22].; Tuttavia, il regolamento molecolari connessi alla segnalazione Ras non è stata documentata [2], [3]. La coespressione di ILK e ERK1 fosforilata /2 (Tyr202 /Thr204) è stata dimostrata in tumori gastrici umani e noduli AGS-derivato in topi BALB /c (Figura 2G). ILK interagisce con IQGAP1 [7], un Ras GTPasi-attivando-come proteina che è dissimile da GAP, che trasforma Ras al suo stato inattivo. Perché IQGAP1 controlla segnalazione Ras /MAPK, è oncogeno [39], [40]. L'espressione di proteine ​​della famiglia IQGAP è rimasto invariato nelle AGS e MKN45 cellule, anche dopo ILK silenziamento (sui file 5: Figura S4E). Tuttavia, mettendo a tacere oncogeno IQGAP1, ma non IQGAP3, (sui file 5: Figura S4F-S4H) c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /segnalazione RSK (figura 2H), l'attività di NF-kB, e la crescita delle cellule efficacemente inibito ( Figura 2I). Eseguendo un test coimmunoprecipitation, abbiamo dimostrato un potenziale ILK harbouring complesso, IQGAP1, e Ras (figura 2J). Immunocolorazione ha confermato che è stato ILK coespressi a livelli simili a quelli di IQGAP1 e Ras (Figura 2K; sui file 6: Figura S5). In particolare, mettendo a tacere ILK interrotto il complesso IQGAP1-Ras (Figura 2L e 2M). Questi risultati hanno dimostrato che ILK facilitato la formazione del complesso IQGAP1-Ras di sostenere l'attività di Ras.
ILK enzimatica modula la formazione del IQGAP1-Ras complessi e /2-mediata crescita delle cellule ERK1
I nostri risultati hanno dimostrato che l'inibizione farmacologica ILK diminuita la crescita cellulare, indicando il ruolo essenziale della attività enzimatica della risma. Inoltre inibendo ILK dal approccio genetico interrotto IQGAP1 mediata segnalazione Ras. L'inibizione dell'attività ILK farmacologicamente con T315 (Figura 3A) o geneticamente trasfettando il ILK mutante enzimatica A262V [41] (Figura 3B) interrotto anche la formazione del complesso IQGAP1-Ras nelle cellule AGS. Tre regioni troncate di ILK (Figura 3C) sono stati overexpressed nelle MKN45 cellule per identificare il dominio essenziale per sostenere il complesso IQGAP1-Ras. saggi Coimmunoprecipitation dimostrato che ILK overexpressed costruisce ospitare PH e le regioni del dominio chinasi catalitica immunoprecipitati con IQGAP1 e Ras (Figura 3D). Pertanto, ILK solo chinasi dominio contenenti attiva ERK1 /2 (Figura 3E). Rispetto al ILK full-length (ILK 1-452), transfecting il ILK mutante kinase-dead A262V non ha attivato ERK1 /2 (Figura 3F). Ulteriori esperimenti hanno dimostrato che solo chinasi dominio contenenti ILK aumentato MEK1 /2-regolato l'attivazione di NF-kB (Figura 3G) seguito da MEK1 /2 e la crescita delle cellule di NF-kB-regolato (Figura 3H) nelle cellule MKN45. Questi risultati hanno dimostrato che ILK enzimatica mediata la formazione del complesso IQGAP1-Ras per attivare ERK1 /2 e crescita cellulare NF-kB-mediata. Figura 3 forzata espressione ILK facilita la crescita cellulare inducendo attivazione ERK1 /2 /NF-kB. lisati proteici estratti dalle cellule trattate con AGS T315 (A) o transfettate con Myc-DDK-tagged mutante ILKA262V (B) sono stati immunoprecipitati (IP
) con anticorpi contro ILK. Immunoblot (IB
) mostrano l'espressione di gente, IQGAP1, e Ras. I plasmidi basati su pcDNA3.1-Flag-ILK contenenti full-length ILK (LATTIERO-CASEARI EU
1 -452
), frammento 171-452 (ILK
171
-452
) , frammento 1-170 (ILK
1 -170
) (C), o Myc-DDK-tag ILKA262V mutante sono state trasfettate in MKN45 cellule. (D) Coimmunoprecipitation di bandiera con le proteine ​​indicate è mostrato utilizzando western blotting. Rispetto al pcDNA3.1-Flag (bandiera
) solo, macchie occidentali mostrano l'espressione di ERK1 fosforilata /2 a Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (E, F). β-actina è stato utilizzato come controllo interno. l'attivazione di NF-kB (G) e la crescita delle cellule (H) sono state rilevate anche in assenza o presenza di PD98059 e mantello. I dati sono SD ± media da tre esperimenti indipendenti. ** P
< 0,01 rispetto al controllo. ## P
< 0,01 rispetto al ILK1-452. triangolo verticale, maggiore espressione.
attivazione PI3K e diminuita espressione PTEN facilitare ERK1 attivazione /2 /NF-kB stabilizzando ILK
Perché ILK dipende generazione PIP3 PI3K mediata per la sua attivazione [4], la crescita factor e integrina mediata attivazione di PI3K o una mutazione PI3K nelle cellule AGS [37] potrebbero contribuire a ilk espressione e di attivazione. Rispetto alla crescita delle cellule MKN45, la crescita delle cellule AGS era influenzata da elevati livelli di IL-6 [42], e l'espressione di b1 e β3 integrine non è aumentata (file aggiuntive 7: Figura S6). Abbiamo inoltre confermato che la generazione PIP3 è stata maggiore nelle cellule AGS PI3K-mutato (Figura 4A). Per esplorare le relazioni tra le vie PI3K, gente, e di segnalazione Ras, le cellule AGS sono stati trattati con la MEK1 /2, PI3K, gente, o Ras inibitore per le diverse durate. Al 6 ore dopo il trattamento, T315 leggermente inibita MEK1 /2 e ERK1 2 fosforilazione /(sui file 8: Figura S7). A 24 ore dopo il trattamento, l'inibizione di PI3K perturbato espressione gente, che è stata seguita da MEK1 24/2 /ERK1 /2 disattivazione h dopo il trattamento (Figura 4B). Tuttavia, Ras l'inibizione non disattivare AKT o ILK nelle cellule AGS, anche se Ras può mediare attivazione di PI3K [27]. Simile alle cellule AGS LATTIERO-CASEARI EU-tacere, sia MKN45 e le cellule AGS LY294002-stimolata hanno mostrato una ridotta attività di Ras (Figura 4C). L'inibitore di traduzione cycloheximide facilitato ILK downregulation LY294002-indotta (Figura 4D) e l'inibitore del proteasoma MG132 invertito l'effetto di cui sopra e ERK1 2 inattivazione /(Figura 4E). Il tumore soppressore fosfatasi PTEN regola negativamente PI3K /PDK1 /AKT segnalazione [10], [11] e ILK attività [8], [9], e le cellule AGS hanno mostrato una bassa espressione di PTEN (Figura 2A) [43]. L'espressione forzata di PTEN nelle cellule AGS attenuata non solo la fosforilazione costitutiva PDK1, AKT, e PAK1 ma espressione ILK anche inibita, ERK1 /2 fosforilazione (Figura 4F), e l'attivazione di NF-kB (Figura 4G). Questi risultati hanno indicato che l'attivazione PI3K e diminuita espressione PTEN stabilizzare ILK per regolare ERK1 attivazione /2 /NF-kB. Figura 4 attivazione PI3K e diminuita espressione PTEN facilitare ERK1 /2 /NF-kB attivazione attraverso la stabilizzazione ILK. (A) A PIP3 Mass ELISA Kit è stato utilizzato per determinare l'attività PI3K misurando la quantità di PIP3 estratto da AGS non trattate e cellule MKN45 e da cellule AGS trattati con LY294002 per 24 h. (B), le cellule AGS sono stati trattati con PD98059, LY294002, T315, o Ras inibitore FTI-277 per i tempi indicati. Western blot mostrano l'espressione delle proteine ​​indicate. β-actina è stato utilizzato come controllo interno. (C) Ras attività è stata rilevata in AGS, MKN45, e le cellule AGS LY294002-trattati dopo 24 ore. Western blot mostrano l'espressione delle proteine ​​indicate nelle cellule AGS pretrattate con l'inibitore di traduzione cicloesimide (CHX
) (D) o inibitore del proteasoma MG132 (E) per 0,5 ore e poi trattati con LY294002 per 24 h. PTEN è sovraespresso in cellule AGS utilizzando pcDNA3.1-GFP-PTEN (PTEN
). Western blot mostrano l'espressione delle proteine ​​indicate rispetto pcDNA3.1-GFP (
Vector) trasfezione (F), e l'attivazione di NF-kB (G) è stato anche determinato. Per chinasi e l'attività della luciferasi, i dati sono SD ± media da tre esperimenti indipendenti. * P
< 0.05, ** P
< 0,01, e *** P
< 0,001 rispetto al controllo. triangolo verticale, maggiore espressione; triangolo rovesciato, diminuita espressione.
HSP90-associata E3 ligasi CHIP negativamente controlli stabilizzazione ILK, l'attivazione di ERK1 /2 /NF-kB, e la crescita delle cellule
Verificando ulteriormente il meccanismo alla base di destabilizzazione gente, i nostri risultati hanno dimostrato che l'inibizione AKT non ha influenzato la stabilità ILK, mentre l'inibizione di PI3K stabilità ILK colpiti (sui file 9: Figura S8). HSP90 è stato prossimo indagato perché può causare il degrado ILK [25]. Simile ai risultati di inibizione PI3K, shRNA-based (Figura 5A) o l'inibizione farmacologica di HSP90 (sui file 10: Figura S9A) in ritardo non solo PDK1 /AKT fosforilazione ma anche c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 2 attivazione /dopo degrado ILK. Inoltre, geneticamente o farmacologicamente inibendo HSP90 dal trattamento con 17-AAG o l'inibitore HDAC SAHA, che intrappola HSP90 e in uno stato enzimaticamente inattiva acetilata, attenuato l'attività di NF-kB (Figura 5B; sui file 10: Figura S9B) e la crescita delle cellule ( Figura 5C). Cotrattamento con MG132 salvato gli effetti della 17-AAG (Figura 5D) e SAHA sul degrado ILK e ERK1 2 inattivazione /(sui file 10: Figura S9C). Nei MKN45 cellule, il trattamento con MG132 aumentata espressione ILK, MEK1 /2 e ERK1 2 fosforilazione /(sui file 11: Figura S10), e l'attivazione di NF-kB (dati non riportati). Coimmunoprecipitation dimostrato la formazione del complesso HSP90-ILK (dati non mostrati). Utilizzando un approccio lentivirale basato su shRNA (Figura 5E), ligases HSP90 associati E3, tra cui CHIP, Cullin 4A, 4B e Cullin [26], [44], [45], sono stati esaminati per il loro ruolo nella degradazione ILK. I risultati hanno mostrato che solo silenziamento CHIP salvato degrado ILK e ERK1 2 inattivazione /(Figura 5F), NF-kB disattivazione (Figura 5G), e l'inibizione della crescita cellulare (Figura 5H) dopo l'inibizione farmacologica di PI3K e HSP90. CHIP è stato richiesto per ILK ubiquitinazione nelle cellule AGS LY294002 trattate (Figura 5I). Questi risultati hanno dimostrato che HSP90 segnalazione /CHIP regola stabilizzazione ILK PI3K-mediata e ERK1 2 attivazione ILK-regolato //NF-kB e facilita in tal modo la crescita delle cellule. Figura 5 CHIP determina ILK destabilizzazione, ERK1 /2 /NF-kB inattivazione, e l'inibizione della crescita cellulare dopo PI3K /HSP90 inattivazione. cellule AGS sono state trasfettate con shLuc o shHSP90 o pretrattati con la HSP90 inibitore 17-AAG (0,1 pM) per 48 h. Western blot mostrano l'espressione delle proteine ​​indicate (A), e l'attivazione di NF-kB (B) e la crescita cellulare (C) sono stati determinati. (D) MG132 pre-trattamento (0,5 h) invertito espressione ILK e ERK1 /2 fosforilata in Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) nelle cellule AGS 17-AAG-trattati. (E) CHIP, Cullin 4A, 4B e Cullin sono stati messi a tacere nelle cellule AGS di shRNAs. cellule shRNA transfettate sono stati trattati con LY294002 o 17-AAG per 24 h. Western Blotting mostrato l'espressione di ILK e ERK1 /2 fosforilata in Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (F), e l'attivazione di NF-kB (G) e la crescita delle cellule (H) sono stati anche determinati. (I) In shLuc- e le cellule AGS shCHIP transfettate trattati con LY294002, ILK stato immunoprecipitato, e la sua ubiquitinazione era sondato. Per l'analisi Western Blot, β-actina è stato utilizzato come controllo interno. Per l'attività luciferasi e la crescita delle cellule, i dati sono SD ± media da tre esperimenti indipendenti. ** P
< 0,01 e *** P
< 0,001 rispetto al controllo. ## P
< 0,01 e ### P
< 0,001 rispetto a shLuc o DMSO. NS: non significativo. triangolo verticale, maggiore espressione; triangolo rovesciato, diminuita espressione.
PI3K /HSP90 /CHIP /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-kB segnalazione contribuisce alla cellula la migrazione e la sensibilità di 5-FU e cisplatino
aumento dell'attività ILK o l'espressione potrebbe regolare oncogeno processi, tra cui la proliferazione cellulare, la migrazione e la sopravvivenza [3], [6]. Abbiamo studiato il potenziale coinvolgimento della PI3K identificato /HSP90 /CHIP /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-kB percorso di segnalazione in vantaggi crescita cellulare. Rispetto ai MKN45 cellule, le cellule AGS hanno mostrato un aumento di attività migratoria; tuttavia, ILK o IQGAP1 tacere in modo significativo (P
< 0,001) abolito la migrazione delle cellule (sui file 12: Figura S11A). Farmacologicamente blocco PI3K /HSP90 /ILK /MEK1 /2 /segnalazione NF-kB nelle cellule AGS significativamente (P
< 0,001) attenuato la capacità migratoria (sui file 12: Figura S11B), e CHIP atterramento sensibilmente invertito la effetti inibitori causati dalla inibizione della PI3K e HSP90 (figura 6A; file aggiuntivo 12: Figura S11C). Gli agenti antitumorali 5-FU e cisplatino sono comunemente utilizzati nel trattamento dei tumori gastrici [46]. Trattare le cellule AGS con 5-FU o cisplatino, in particolare dopo ILK o IQGAP1 silenziamento, causato un aumento della suscettibilità all'apoptosi (Figura 6B). T315 ha aumentato la sensibilità delle cellule AGS a 5-FU e cisplatino (sui file 12: Figura S11D). Farmacologicamente inibendo PI3K /HSP90 /ILK /MEK1 /2 /NF-kB segnalazione anche sensibilizzato le cellule AGS a 5-FU-indotta l'apoptosi (figura 6C), mentre CHIP silenziamento ritardato gli effetti sinergici di LY294002 e 17-AAG, il 5-FU apoptosi indotta (Figura 6D). Al contrario, la sovraespressione di ILK contenente un dominio chinasi catalitica, tra cui ILK 1-452 e ILK 171-452, migliorato MEK1 /2 /NF-kB-regolato la migrazione cellulare (Figura 6E) e cellula di sopravvivenza dopo il trattamento con 5-FU (Figura 6F). Questi risultati hanno indicato gli effetti comuni di ILK e IQGAP1 su ERK1 attivazione /2 /NF-kB per la migrazione e la sopravvivenza cellulare. Figura 6 PI3K /HSP90 /CHIP /ILK /ERK1 /2 /NF-kB segnalazione determina la migrazione delle cellule e controlla la suscettibilità agli agenti antitumorali 5-FU e cisplatino. (A) L'attività di migrazione è stato testato in shLuc- o cellule AGS shCHIP transfettate trattati con LY294002 (25 mM) e 17-AAG (0,2 pM) per 12 h. shLuc, il controllo siRNA o DMSO sono stati utilizzati come controlli negativi. vengono visualizzati il ​​numero di cellule migrate nel campo osservato. colorazione PI seguita da citometria a flusso analisi ha mostrato 5-FU o apoptosi indotta da cisplatino per 2 giorni in shILK- o cellule AGS siIQGAP1 transfettate (B), le cellule AGS pretrattate con gli inibitori indicati per 0,5 h (C), e shLuc- o shCHIP transfettate cellule AGS trattati con LY294002 o 17-AAG (D). shLuc, il controllo siRNA o DMSO sono stati utilizzati come controlli negativi. I plasmidi basati su pcDNA3.1-Flag-ILK contenenti full-length ILK (LATTIERO-CASEARI EU
1 -452
), frammento 171-452 (ILK
171
-452
) , o un frammento di 1-170 (ILK
1 -170
) sono state trasfettate in MKN45 cellule. Rispetto al pcDNA3.1-Flag (bandiera
) solo, migrazione cellulare (E) e l'apoptosi indotta da 5-FU (5 micron) (F) sono stati rilevati in assenza o presenza di PD98059 e mantello. I dati sono SD ± media da tre esperimenti indipendenti. * P
< 0.05, ** P
< 0,01 e *** P
< 0,001 rispetto al controllo. #P
≪ 0,05, ## P
< 0,01 e ### P
< 0,001 rispetto al controllo. NS:. Non significativo
segnalazione EGFR regola ILK /IQGAP1 per attivare la migrazione ERK1 /2, NF-kB, e delle cellule e la proliferazione
Per verificare il ruolo di IQGAP1 mediata attivazione ILK /ERK1 /2 e NF-kB β-actina è stato utilizzato come controllo interno. β-actina è stato utilizzato come controllo interno. β-actina è stato utilizzato come controllo interno. β-actina è stato utilizzato come controllo interno. β-actina è stato utilizzato come controllo interno. β-actina è stato utilizzato come controllo interno. β-actina è stato utilizzato come controllo interno. β-actina è stato utilizzato come controllo interno. β-actina è stato utilizzato come controllo interno. β-actina è stato utilizzato come controllo interno.

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