Увеличение интегрина-сшитый киназы неканонически дает NF-kB-опосредованной преимущества роста к желудочному раковых клеток путем активации ERK1 /2

Увеличение интегрин-сшитый киназы неканонически дает NF-kB-опосредованной преимущества роста достигают клеток рака желудка путем активации ERK1 /2
абстрактном
фон
Повышенная активность или экспрессию интегрина-сшитый киназы (ИЛК) , который регулирует клеточную адгезию, миграцию и пролиферацию, приводит к онкогенеза. Мы определили молекулярную основу для регуляции ИЛК и его альтернативную роль в придании ERK1 /2 /NF-kB-опосредованной преимущества роста к клеток рака желудка.

Результаты Ингибирование ИЛК с коротким шпилька РНК или T315, предполагаемый ингибитор ILK, упразднены NF-kB-опосредованной рост человеческих клеток рака желудка AGS, СНУ-1, MKN45 и ГЭС-1. ИЛК стимулировали активность Ras, чтобы активировать C-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /рибосомальной S6 киназы /ингибитор сигнализации κBα /NF-kB путем содействия формированию IQ мотив содержащих ГТФазная-активирующий белок 1 (IQGAP1) - Рас-комплекс. Принудительный ферментативная выражение ILK способствовало росту клеток путем содействия ERK1 /2 /NF-кВ сигнализации. активация PI3K или снижение экспрессии PTEN длительной ERK1 2 активации /путем защиты ILK от деградации протеасомы-опосредованной. С-конец теплового шока родственно 70, взаимодействующей белок, ассоциированный с HSP90 E3 убиквитинлигазы, опосредованного ILK убихитинизация контролировать PI3K- и HSP90-регулируемой стабилизации ILK и сигнализации. В дополнение к росту клеток, идентифицированный путь способствовал миграции клеток и снижение чувствительности клеток рака желудка к противоопухолевые средства, 5-фторурацил и цисплатин. Кроме того, экзогенный введение EGF, а также избыточная экспрессия EGFR вызвали ILK- и IQGAP1 отрегулированный ERK1 /2 /NF-kB активации, рост клеток и миграции.
Вывод изображения Увеличение в ILK неканонически способствует ERK1 /2 /NF-kB активации и приводит к росту клеток рака желудка.
Ключевые слова
рост клеток ILK IQGAP1 ERK1 /2 NK-kB фона
Интегринзависимая связанных киназы (ИЛК), 59-кД серин /треонин киназа, непосредственно взаимодействует с цитоплазматическим доменом интегрина β 1 [1]. ILK состоит из трех доменов: N-концевого анкириновых (ANK) повторы, центральный pleckstrin гомологии (PH) -как домена, и С-концевой домен киназы [2], [3]. Интегринзависимая опосредованной клеточной внеклеточного матрикса (ECM) адгезии или факторы роста активации фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) фосфорилировать Мембраносвязанные PI 4,5-бисфосфат (PIP2) и генерировать PI 3,4,5-трифосфат (PIP3), который связывается с PH-подобного домена ИЛК и активирует ILK [4], [5]. После активации ИЛК, С-концевой домен киназы из ИЛК может связываться с различными белками, в том числе АКТ, affixin, бета-Парвин, гликоген-синтаза-киназы (GSK) -3 β, calponin гомологии, содержащие ИЛК-связывающего белка, 20-кДа регуляторная легкие цепи миозина (LC20), миозина нацеливания субъединица легкой цепи миозина фосфатазы (MYPT1), паксиллина, альфа-NAC, и ингибиторы белка фосфатазы PHI-1, кепи, и CPI-17 [2], [3] , [6], [7]. АНК повторы N-терминальные опосредуют взаимодействие ILK с ILKAP, член семейства белков 2C фосфатазы и прижимные, доменного только адаптер белка LIM. ILK можно считать PIP3-взаимодействующий белок PI3K вниз по течению; его эффекты блокируются фосфатазы и Тенсин гомолога удален на хромосоме 10 (PTEN) [8], [9]. PTEN подавляет опухоли с помощью dephosphorylating PIP3 [10], [11]
ILK играет жизненно важную роль в регуляции различных клеточных процессов, включая пролиферацию, выживание, миграцию, прогрессии клеточного цикла, и ангиогенез. повышенная активность или экспрессия ILK приводит к онкогенеза [2], [3]. Кроме того, модулируя ее партнерских белков для клеточных процессов, ILK гипотетически быть вовлечены в внутриклеточной передачи сигнала сети. Механически, ILK непосредственно фосфорилирует AKT на Ser473 и GSK-3 &beta на Ser9 [4], [9] посредничать β-катенина транслокацию и регламентировать AP-1 выражение для пролиферации опухолевых клеток [12]. активация NF-kB имеет важное значение для Ilk-опосредованной онкогенных процессов, таких как анти-апоптотической активности [13], продвижение выживаемости [14], эпителиально-мезенхимальных перехода [15], клеточного расширения и устойчивость к апоптозу [16], ангиогенеза [17 ], и миграция, вторжение, и метастазирование [18] - [20]. Кроме того, активация NF-kB необходима для канонического регулирования IKKα и IKKß по ИЛК /Akt пути. Для того, чтобы вызвать миграцию клеток, ILK может активировать небольшой ГТФаз RAC и Cdc42 [21]. Кроме того, ILK регулирует ERK1 2 активации /в миогенной дифференцировки [22]. Увеличение экспрессии микроРНК-143 и микроРНК-145, которые нацелены на ILK, ингибирует AKT и ERK1 2 пути /[23]. Однако, молекулярный механизм, лежащий в основе ILK-опосредованной активации ERK1 /2 остается неизвестной.
Стимуляции клеток факторами роста и цитокинов, а также клеточного взаимодействия с увеличением ЕСМ ILK активности [24]. В дополнение к молекулярной регуляции PI3K /PTEN по ИЛК, Аояги и др. определили ИЛК как новый белок теплового шока клиента белка (HSP) 90, и обнаружили, что их фармакологически ингибирования HSP90, приводит к деградации ИЛК в протеосомного-зависимым способом [25]. Кроме того, HSP90, ассоциированных с Е3 убиквитинлигаза С-конец теплового шока родственного 70 взаимодействующий белок (ЧИП) приводит к деградации ILK [26]. Хаширамото и др. Показано, что HSP90 стабилизировались ILK и устойчивый АКТ и ERK1 активации /2 [16]. Таким образом, мы предполагаем, связь между стабильностью ИЛК и активации его вниз по течению киназ. Ras /МАРК сигнальный путь имеет важное значение для онкогенеза [27]. Повышенная экспрессия ILK связана с высокосортного рака желудка [28], рака предстательной железы [29], и немелкоклеточного рака легкого [30], хотя клетки в этих раков обычно питают Ras мутации [31] - [33]. Ориентация ILK с миРНК уменьшает инвазию раковых клеток желудка, пролиферации и роста за счет неизвестного механизма [34]. Что касается возможности того, что ILK действует перед NF-кВ путем регулирования IKKα [13], который был замешан в желудочном онкогенеза [35], ILK предположил для активации роста клеток через NF-kB-регулируемом пути. Использование клеток рака желудка (AGS, MKN45 и СНУ-1), мы изучили молекулярную регулирования ILK и определил неканоничной тропу ILK регулируемой активации ERK1 /2 для NF-kB-опосредованной роста клеток желудка, миграции, и выживание продвижение
.
Результаты ILK активность и выражение имеют важное значение для NF-kB-опосредованной рост клеток
повышение активности или экспрессии ILK усиливает туморогенез путем стимулирования роста клеток [6]. RNAi основе ILK глушителей затухает рост раковых клеток желудка [34], в то время как ILK избыточная экспрессия связана с желудочным онкогенеза [28]. В опухоли желудка человека и AGS происхождения конкреций в BALB /с мышей, Ki-67-положительных пролиферирующих клеток коэкспрессируются ILK, как продемонстрированные флуоресценции на основе иммуноокрашивания (рис 1А) и AEC на основе иммуноокрашивания (дополнительный файл 1: Дополнительные материалы и методы; Дополнительный файл 2: Рисунок S1) эксперименты. Для того, чтобы исследовать возможные механизмы, лежащие рост клеток желудка ILK опосредованной, несколько желудочные эпителиальные клеточные линии были охарактеризованы в соответствии с их различными скоростями роста клеток, которые были выше для АГС и SNU-1 клеток и ниже для MKN45 и ГЭС-1 клеток , и использовали в этом исследовании (дополнительный файл 3: Рисунок S2A). По сравнению с MKN45 клетками, АГС и клеток СНУ-1 также была повышенная экспрессия ILK (дополнительный файл 3: Рисунок s2b и S2C). Лентивирусного основе shRNA использовалась для подавления ILK
генетически в АГС, СНУ-1, MKN45, и ГЭС-1 эпителиальных клеток желудка (Фигура 1В, верхняя панель), а также в А549 и H1975 клеток аденокарциномы легкого человека, HK-2 человека почечных проксимальных канальцев эпителиальные клетки, и THP-1 клеток человека моноцитов (дополнительный файл 3: Рисунок S2D). В этих клетках, ИЛК значительно глушителей (Р
≪ 0,05) пониженный рост клеток (Фигура 1В; Дополнительный файл 3: Рисунок S2E). Кроме того, обработки клеток с ингибитором ИЛК T315 [36] существенно (Р
≪ 0,05) и дозозависимо замедление роста клеток (рис 1C) без цитотоксичности (данные не показаны). Кроме того, снижение образования колоний наблюдалось в ILK-притихли клетках AGS (дополнительный файл 3: Рисунок S2F). Таким образом, ген глушителей (Дополнительный файл 3: Рисунок S2G) и фармакологические методы (Дополнительный файл 3: Рисунок S2H) для подавления ILK активности или избыточной экспрессии привело к остановке клеточного цикла в G <югу> 1 фазы. Эти результаты показывают, роль стимуляции роста в ИЛК. Выражение ILK Рисунок 1 необходим для роста клеток и их активации NF-kB. (A) Представитель флуоресценция на основе иммуногистохимического окрашивания показывает коэкспрессия ILK (зеленый
) и Ki-67 (красный)
в опухоли желудка человека и АГС-производных конкреций в BALB /с мышей. DAPI (синий
) был использован для ядерной counterstaining. ИЛК + Ki-67 + клеток в секциях immunofluorescently окрашенными ткани представлены как дот-графики для FACS-анализа, как с помощью программного обеспечения TissueQuest. Клетки были вычислены как процент, а количество клеток от общего количества клеток (DAPI + клеток) на поле. (В) Вестерн-блот экспрессии ILK в клетках, трансфицированных shRNAs таргетингом ILK (shILK
) или контрольный люциферазы (shLuc
). β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. WST-8 на основе анализа показано ингибирование роста клеток в Ilk-притихли клеток. (C) в зависимости от дозы действие ингибитора ИЛК T315 на ингибирование роста клеток AGS. (D) Представитель флуоресценция на основе иммуногистохимического окрашивания показывает коэкспрессия ILK (зеленый
) и фосфорилированного NF-кВ Ser536 (красная
) в опухоли желудка человека и АГС-узелков, полученных у мышей. DAPI (синий
) был использован для ядерной counterstaining. Дот-графики показывают коэкспрессия ILK и NF-kB Ser536. (E) Логистический регрессионный анализ показал корреляцию между ILK, фосфорилированного NF-кВ Ser536 и Ki-67 в 93 образцах рака желудка тестируемых. R-квадрат (R страница 2) и P
значения отображаются. (F) EMSA демонстрирует активацию NF-kB. (G), люциферазы анализ показывает соотношение активации NF-kB, чтобы контролировать Renilla люциферазы в клетках, обработанных с NF-kB ингибитором накидка (25 мкг /мл). (Н) Рост 25 мкг /мл CAPE-обработанных клетках AGS. (I) активации NF-kB в shLuc- или shILK-трансфецированных клеток. (J), NF-kB активации через 6 часов лечения T315 в AGS клетках. Для роста клеток, образование колоний и активность люциферазы, данные представляют собой среднее ± SD трех независимых экспериментов. * P &
л; 0,05, ** P &
л; 0,01 и *** P
&л; 0,001 по сравнению с днем ​​0 или относительным контролем. #P
&Л; 0,05, ## P
&л; 0,01 и ### P
&л;. По сравнению с 0,001 shLuc
Чтобы охарактеризовать особенности роста ILK регулируемых клеток, NF- сигнализации кВ была рассмотрена, поскольку ILK может действовать выше по потоку от NF-кВ путем регулирования IKKα [13]. Иммунным окрашиванием, наблюдалась Коэкспрессия ИЛК и фосфорилируется NF-kB (Ser536) в желудочных тканях человека и мыши (рис 1D), и их значительно коэкспрессия (Р
≪ 0,01) и положительно коррелирует с количеством пролиферирующих клеток , который обозначается 55 трипл-положительных случаев из общего числа 93 образцов рака желудка (рис 1E, дополнительные файловые 4: Рисунок S3). Иммуноокрашивание для NF-kB ядерной транслокации (дополнительный файл 3: Рисунок S2i), EMSA (рис 1F), и промотор анализы (рис 1G) подтвердили конститутивной активации NF-kB в AGS клетках, но не в клетках MKN45. Лечение клеток с NF-kB ингибитором CAPE значительно (P &
л; 0,001) снижение NF-kB активации (рис 1G) и рост клеток (рис 1H). Либо ILK глушителей (Рисунок 1I; Дополнительный файл 3: Рисунок S2J) или лечение T315 (рис 1J) в значительной степени (P &
л; 0,05) остановлен NF-kB активность. Эти результаты показали, что ИЛК является необходимым условием для роста клеток в клеточных линиях, так как он облегчает активацию NF-kB в рака желудка.
ИЛК регулирует активность Ras, облегчив комплекс IQGAP1-Ras для управления МАРК-активированный NF-kB
Поскольку AGS клетки гавани PIK3CA
и Крас
мутации [37], мы рассмотрели возможные регуляторные эффекты ILK на модуляции активности NF-kB от этих 2-киназ [38]. Использование массива Kit Человеческая фосфо-МАРК, мы определили 10 киназ, которые были более высоким уровнем экспрессии в AGS клетках, чем в клетках MKN45. Эти киназ в основном действовали ниже по потоку от сигнальных путей PI3K и МАРК (дополнительный файл 5: Рисунок S4A). Вестерн-блоттингом, мы подтвердили повышенную фосфорилирования AKT, ERK1 /2 и IκBα сопровождается ухудшением IκBα в AGS клетках (Фигура 2А). Фармакологическое ингибирование с-Raf, MEK1 /2 и PI3K значительно (P &
л; 0,05) снижение роста клеток (Фигура 2В), IκBα фосфорилирования (Ser32) и деградации (рис 2С), и активность NF-kB ( Рисунок 2D), что указывает, что оба PI3K- и Рас-активирующий сигнальные пути облегченные активации NF-kB. Эффекты ILK были широко изучены из-за его взаимодействия с клеточной growth- и NF-kB-ассоциированной AKT [4], [9]. Удивительно, но ILK глушителей не влияет на AKT и GSK-3 β фосфорилирования в AGS и клеток СНУ-1, но заметно снижается с-Raf и ERK1 активации /2 во всех клетках тестируемых (Рисунок 2E; Дополнительный файл 5: Рисунок S4B). Без АКТ дезактивацию, мы оценили альтернативный путь для активации NF-kB через механизм с участием сигнализации МАРК /p90RSK /IκBα [38]. Нокдаун ILK
уменьшил многократный фосфорилирования RSK (Thr573, Thr359 /Ser363 и Ser380) и IκBα фосфорилирования (Ser32) и увеличение накопления IκBα (рис 2E). Ингибирование MEK1 /2 вызвало аналогичные эффекты (Дополнительный файл 5: Рисунок S4C) и арест клеточного цикла в G <югу> 1 фаза (Дополнительный файл 5: Рисунок S4D). Выпадающий анализ показал, что Ras ингибирования ILK вызвало Рас дезактивацию, не влияя на стабильность белка Ras (рис 2F). Эти результаты показали потенциальную неканоничной путь для ILK модулировать NF-kB, регулируя передачу сигналов Ras /C-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /IκBα. Рисунок 2-ILK IQGAP1-Ras комплекс поддерживает активность Ras для активации с-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /RSK /IκBα /NF-кВ сигнализации. (А) Вестерн-блот указанных белков в AGS и MKN45 клетках. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. Клетки AGS, обработанных ингибитором с-Raf GW5074, MEK1 /2 ингибитора U0126 или PD98059, или ингибитор PI3K LY294002 в течение 48 ч были оценены для их роста (B), фосфорилирование IκBα на Ser32 (pIκBα
) и общего белка (C ), и активация NF-kB (D). (E) В shLuc- или shILK трансфецированные клетки, западные помарки показывают экспрессию указанных белков. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. (F) Ras анализ активации показывает активность РАС и экспрессию белка в shLuc- и shILK трансфецированные клетки AGS. (G) представителя флуоресценции на основе иммуногистохимического окрашивания, показывающий коэкспрессия ILK (зеленый) и
фосфорилированные ERK1 /2 Tyr202 /Thr204 (красная
) в опухоли желудка человека и АГС-производных конкреций в BALB /с мышей. DAPI (синий
) был использован для ядерной counterstaining. Дот-графики показывают коэкспрессия указанных белков. В контроле и IQGAP1 миРНК-трансфецированных клеток AGS через 48 ч, экспрессия указанных белков (H), были показаны активации NF-kB, и рост клеток (I). Белковые лизаты, извлеченные из необработанных AGS клеток (J) или с shLuc и shILK трансфекцией (L, M) были иммунопреципитации (IP)
с контрольной IgG (C. IgG
) или с антителами против ILK, IQGAP1, и Ras , Иммуноблоты (IB)
показать экспрессию ILK, IQGAP1 и Рас. (K), репрезентативной флуоресценции на основе иммуногистохимического окрашивания, показывающий коэкспрессия ILK (зеленый
), IQGAP1 (красный
), и Ras (красный
) в AGS клетках. DAPI (синий
) был использован для ядерной counterstaining. Для пролиферации и активности люциферазы, данные представляют собой среднее ± SD трех независимых экспериментов. ** Р &
л; 0,01 и *** Р
&л; 0,001 по сравнению с контролем. Вертикально треугольник, повышенная экспрессия; перевернутый треугольник, снижение экспрессии
ILK может модифицировать ERK1 2 активации /при росте и дифференциации [22] клеток. Тем не менее, молекулярная регуляция связана с сигнализацией Ras не было зарегистрировано [2], [3]. Коэкспрессия ILK и фосфорилированного ERK1 /2 (Tyr202 /Thr204) была продемонстрирована в опухолях желудка человека и AGS полученных узелки в BALB /с мышей (рис 2G). ILK взаимодействует с IQGAP1 [7], в Рас-ГТФ-активирующий-подобный белок, который отличается от GAP, преобразующей Ras в неактивное состояние. Поскольку IQGAP1 контролирует передачу сигналов Ras /MAPK, это онкогенными [39], [40]. Экспрессия белков семейства IQGAP был неизменным в AGS и MKN45 клеток, даже после того, как ILK глушителей (дополнительный файл 5: Рисунок S4E). Тем не менее, глушителей онкогенного IQGAP1, но не IQGAP3, (Дополнительный файл 5: Рисунок S4F-S4H) эффективно ингибирует C-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /сигнализации RSK (Рисунок 2H), NF-kB активность и рост клеток ( Рисунок 2I). Выполняя анализ коиммунопреципитации, мы продемонстрировали потенциальную комплексную укрывательство ILK, IQGAP1 и Рас (рис 2J). Иммунологическое подтвердил, что ILK был коэкспрессируются на уровнях, аналогичных IQGAP1 и Ras (рисунок 2K; Дополнительный файл 6: Рисунок S5). Следует отметить, что глушителей ILK нарушило комплекс IQGAP1-Ras (рис 2L и 2M). Эти результаты показали, что ILK способствовали формированию комплекса IQGAP1-Рас, чтобы поддерживать активность Ras.
Ферментативный ILK модулирует образование IQGAP1-Ras комплекса и ERK1 /2-опосредованного роста клеток
Наши результаты показали, что фармакологически ингибирования ILK пониженный рост клеток, что указывает на существенную роль ферментативной активности ИЛК. Кроме ингибирования ILK путем генетического подхода нарушается IQGAP1-опосредованную передачу сигналов Ras. Ингибирование ILK активность фармакологически с T315 (фиг.3А) или генетически трансфекцией ферментативную мутантный ILK <суб> A262V [41] (фигура 3В) также нарушается образование комплекса IQGAP1-Ras в клетках AGS. Три усеченные области ILK (рис 3C) были избыточно экспрессируется в клетках MKN45 идентифицировать домен, необходимую для поддержания комплекса IQGAP1-Рас. Коиммунопреципитации анализы показали, что суперэкспрессированный ILK конструирует укрывательство PH и каталитические участки домена киназы иммунопреципитации с IQGAP1 и Ras (Рис 3D). Таким образом, только киназы домен-содержащий ИЛК активированный ERK1 /2 (рисунок 3e). По сравнению с полноразмерным ILK (ILK <суб> 1-452), трансфекцией киназы умершей мутантный ILK <суб> A262V не активировал ERK1 /2 (рис 3F). Дополнительные эксперименты показали, что только киназа домен, содержащий ILK увеличилась MEK1 /2-регулируемую активацию NF-кВ (рис 3G), а затем MEK1 /2- и NF-kB-регулируемого роста клеток (рис 3Н) в клетках MKN45. Эти результаты показали, что ферментативная ИЛК опосредованное образование комплекса IQGAP1-Ras, чтобы вызвать ERK1 /2- и NF-kB-опосредованной рост клеток. Рисунок 3 Усиленный выражение ИЛК способствует росту клеток путем индукции активации ERK1 /2 /NF-kB. Белковые лизаты, извлеченные из AGS клеток, обработанных T315 (а) или трансфецированных Мус-ДДК-меченный мутант ILKA262V (В) подвергали иммунопреципитации (IP
) с антителами против ИЛК. Иммуноблоты (IB)
показать экспрессию ILK, IQGAP1 и Рас. Плазмиды на основе pcDNA3.1-Flag-ИЛК, содержащие полноразмерную ILK (ИЛК
1
-452
), фрагмент 171-452 (ILK
171
-452
) , фрагмент 1-170 (ILK
1
-170
) (C), или Мус-ДДК-меченого мутант ILKA262V трансфицировали в MKN45 клетки. (D) коиммунопреципитации флаговых с указанными белками показано с помощью вестерн-блоттинга. По сравнению с pcDNA3.1-Flag (Флаг
) только, западные помарки показывают экспрессию фосфорилированного ERK1 /2 в Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (E, F). β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. активации NF-kB (G) и рост клеток (H) были также обнаружены в отсутствии или присутствии PD98059 и мысом. Данные представляют собой среднее ± SD трех независимых экспериментов. ** Р &
л; 0,01 по сравнению с контролем. ## P
&л; 0,01 по сравнению с ILK1-452. Вертикально треугольник, увеличение экспрессии.
Активации PI3K и снижение экспрессии PTEN облегчить ERK1 /2 /NF-kB активации путем стабилизации ILK
Поскольку ИЛК зависит от поколения PIP3 PI3K-опосредованного для его активации [4], рост факторизации и интегрин-опосредованной активации PI3K или мутация PI3K в AGS клетках [37] может способствовать ILK экспрессии и активации. По сравнению с ростом клеток MKN45, рост клеток AGS не влиял повышенных IL-6 уровней [42], а также экспрессии β 1 и β 3 интегринов не увеличивался (дополнительный файл 7: Рисунок S6). Кроме того, мы подтвердили, что поколение PIP3 был выше в PI3K-мутировали клетки AGS (фиг.4А). Для того, чтобы исследовать отношения между PI3K, иже и Ras сигнальных путей, АГС клетки обрабатывали с MEK1 /2, ингибитор PI3K, ILK или Ras для различных длительностей. Через 6 ч после обработки, T315 слегка тормозится MEK1 /2 и ERK1 2 фосфорилирования /(дополнительный файл 8: Рисунок S7). Через 24 часа после обработки, PI3K торможение нарушается экспрессия ILK, за которым последовали MEK1 /2 /ERK1 /2 деактивация 24 ч после обработки (рис 4В). Однако ингибирование Ras не дезактивировать AKT или ILK в AGS клетках, хотя Ras может опосредовать активацию PI3K [27]. Подобно Ilk-притихли клетки AGS, как MKN45 и LY294002-стимулированные клетки AGS показали снижение активности Ras (Рис 4C). Ингибитор перевод циклогексимид облегчило LY294002 индуцированной ILK деактивация (рис 4D) и ингибитор протеасом MG132 отменил вышеупомянутый эффект и ERK1 инактивацию /2 (рис 4д). Опухолевый супрессор фосфатазы PTEN негативно регулирует PI3K /PDK1 /Akt сигнализации [10], [11] и ILK активность [8], [9], и AGS клетки проявляли низкую экспрессию PTEN (рис 2А) [43]. Принудительная экспрессия PTEN в AGS клетках не только ослабляется учредительный фосфорилирования PDK1, AKT и PAK1, но и угнетается выражение ILK, ERK1 /2 фосфорилирования (рис 4F), а также активации NF-kB (рис 4G). Эти результаты показали, что активация PI3K и снижение экспрессии PTEN стабилизации ILK регулирования ERK1 /2 /NF-kB активации. Рисунок 4 активации PI3K и снижение экспрессии PTEN облегчают ERK1 /2 /NF-kB активации за счет стабилизации ILK. (A) PIP3 Масс-ELISA набор был использован для определения PI3K активности путем измерения количества PIP3 извлеченную из необработанных AGS и клеток MKN45 и из клеток, обработанных AGS LY294002 в течение 24 ч. (В) AGS клетки обрабатывали PD98059, LY294002, T315, или ингибитор Рас FTI-277 в течение указанных промежутков времени. Вестерн-блоты показывают экспрессию указанных белков. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. (C) Ras активность была обнаружена в AGS, MKN45 и LY294002 обработанных AGS клеток через 24 ч. Вестерн-блоты показывают экспрессию указанных белков в клетках AGS, предварительно обработанных ингибитором перевода циклогексимид (СНХ
) (D) или ингибитор протеасом, MG132 (Е) в течение 0,5 ч, а затем обрабатывали LY294002 в течение 24 ч. PTEN был избыточно экспрессируется в клетках AGS с помощью pcDNA3.1-GFP-PTEN (PTEN
). Вестерн-блоты показывают экспрессию указанных белков по сравнению с pcDNA3.1-GFP (Вектор)
трансфекцией (F), а также определяли активации NF-kB (G). Для киназы и активность люциферазы, данные представляют собой среднее ± SD трех независимых экспериментов. * Р &
л; 0,05, ** Р &
л; 0,01, *** Р и
&л; 0,001 по сравнению с контролем. Вертикально треугольник, повышенная экспрессия; перевернутый треугольник, сниженную экспрессию.
HSP90-ассоциированный E3 лигаза CHIP отрицательно контролирует стабилизации ILK, активация ERK1 /2 /NF-kB, и рост клеток
Путем дальнейшего уточнения механизма, лежащего ILK дестабилизацию, наши результаты показали, что ингибирование AKT не влияет на ILK стабильность, в то время как ингибирование PI3K стабильность влияет ILK (дополнительный файл 9: Рисунок S8). HSP90 был рядом исследовано, потому что это может привести к деградации ILK [25]. Подобно результатам PI3K торможения, shRNA на основе (рис 5А) или фармакологического ингибирования HSP90 (Дополнительный файл 10: Рисунок S9A) задержка не только PDK1 /Akt фосфорилирования, но и с-Raf /MEK1 /2 /ERK1 2 активации /после ILK деградация. Кроме того, генетически или фармакологически ингибирования HSP90 обработкой 17-AAG или ингибитора HDAC SAHA, который улавливает HSP90 в ацетилированного, ферментативно неактивного состояния, ослабляется активность NF-kB (Рисунок 5В; Дополнительный файл 10: Рисунок S9B) и роста клеток ( Рисунок 5С). Cotreatment с MG132 спасли эффекты 17-AAG (рис 5D) и САХА по деградации ILK и ERK1 инактивация /2 (дополнительный файл 10: Рисунок S9C). В MKN45 клетках, лечение MG132 увеличилось ILK экспрессию, MEK1 /2 и ERK1 2 фосфорилирования /(дополнительный файл 11: Рисунок S10), и активации NF-kB (данные не показаны). Коиммунопреципитации продемонстрировали образование HSP90-ИЛК комплекса (данные не показаны). Использование Lentiviral на основе shRNA подхода (рис 5E), HSP90-ассоциированные E3 лигазы, включая CHIP, Cullin 4А, 4В и Cullin [26], [44], [45], были исследованы на их роли в деградации ILK. Результаты показали, что только глушителей CHIP спасена деградации ILK и ERK1 инактивацию /2 (рис 5f), NF-kB дезактивацию (рис 5г) и ингибирование роста клеток (рис 5Н) после того, как фармакологического ингибирования PI3K и HSP90. CHIP требовалось для ILK убихитинизация в LY294002 клетках, обработанных AGS (рис 5i). Эти результаты показывают, что HSP90 сигнализации /CHIP регулирует PI3K-опосредованной стабилизации ILK и ILK регулируемых ERK1 /2 активации /NF-кВ и, таким образом, способствует росту клеток. Рисунок 5 CHIP определяет ILK дестабилизацию, ERK1 /2 /NF-kB инактивация, и рост клеток торможение после инактивации PI3K /HSP90. AGS клетки трансфицировали shLuc или shHSP90 или предварительно обрабатывают с HSP90 ингибитором 17-AAG (0,1 мкМ) в течение 48 ч. Вестерн-блоты показывают экспрессию указанных белков (А), а также были определены активации NF-kB (Б) и роста клеток (С). (D) MG132 предварительной обработки (0,5 ч) обратное ILK экспрессию и фосфорилированный ERK1 /2 в Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) в 17-AAG-обработанных клетках AGS. (E) CHIP, Cullin 4А и 4Б Cullin замолчали в AGS клетках по shRNAs. shRNA-трансфицированные клетки обрабатывали LY294002 или 17-AAG в течение 24 ч. Вестерн-блоттинг показал экспрессию ILK и фосфорилированного ERK1 /2 в Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (F), а также были определены активации NF-kB (G) и рост клеток (H). (I) В shLuc- и shCHIP-трансфицированных клетках AGS, обработанных LY294002, ILK был иммуноосажденного, и его убиквитилирование зондировали. Для Вестерн-блоттинга, β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. Для активности люциферазы и роста клеток, данные представляют собой среднее ± SD трех независимых экспериментов. ** Р &
л; 0,01 и *** Р
&л; 0,001 по сравнению с контролем. ## P
&л; 0,01 и ### P
&л; 0,001 по сравнению с shLuc или ДМСО. NS: не имеет существенного значения. Вертикально треугольник, повышенная экспрессия; перевернутый треугольник, снижение экспрессии.
PI3K /HSP90 /CHIP /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-kB сигнализации способствует миграции клеток и чувствительность к 5-ФУ и цисплатин
Повышенная ILK активность или экспрессию может регулировать онкогенными процессы, в том числе пролиферацию клеток, миграцию и выживание [3], [6]. Мы изучили возможное участие выявленных PI3K /HSP90 /CHIP /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-kB сигнального пути в преимуществах роста клеток. По сравнению с MKN45 клетками, АГС клетки показали увеличение миграционной активности; Тем не менее, ILK или IQGAP1 значительно глушителей (P &
лт; 0,001) отменило клеточную миграцию (дополнительный файл 12: Рисунок S11A). Фармакологически блокирование PI3K /HSP90 /ILK /MEK1 /2 /сигнализацию NF-kB в клетках AGS также значительно (P &
л; 0,001) ослабляется миграционная способность (Дополнительный файл 12: Рисунок S11B) и CHIP значительно нокдаун отменил ингибирующие эффекты, вызываемые ингибированием PI3K и HSP90 (рисунок 6А; Дополнительный файл 12: Рисунок S11C). Противоопухолевые агенты, 5-ФУ и цисплатин обычно используются при лечении рака желудка [46]. Лечение АГС клеток с 5-ФУ или цисплатин, особенно после ИЛК или IQGAP1 глушителей, вызвало повышенную восприимчивость к апоптозу (фиг.6В). T315 повышает чувствительность клеток AGS 5-ФУ и цисплатин (дополнительный файл 12: Рисунок S11D). Фармакологически ингибирования PI3K /HSP90 /ILK /MEK1 /2 /NF-kB сигнализации также сенсибилизированные АГС клетки 5-FU-индуцированного апоптоза (рис 6в), в то время как CHIP глушителей тормозится синергетические эффекты LY294002 и 17-AAG 5-ФУ индуцированная апоптоз (рис 6D). В отличие от этого, сверхэкспрессия ИЛК, содержащего каталитический домен киназы, включая ИЛК <суб> 1-452 и ИЛК <суб> 171-452, усиливается MEK1 /2 /NF-kB регулируемой клеточной миграции (рис 6E) и клеточной выживаемости после того, как лечение с 5-ФУ (рис 6f). Эти результаты указывают на общие эффекты ILK и IQGAP1 на ERK1 активации /2 /NF-kB для миграции клеток и выживания. Рисунок 6 PI3K /HSP90 /CHIP /ILK /ERK1 /2 /NF-kB сигнализации определяет клеточную миграцию и контролирует восприимчивость к противоопухолевым агентам 5-ФУ и цисплатин. (А) активность миграции была протестирована в shLuc- или shCHIP-трансфицированных клетках AGS, обработанных LY294002 (25 мкМ) и 17-AAG (0,2 мкМ) в течение 12 ч. shLuc, контроль миРНК, или ДМСО использовали в качестве отрицательного контроля. Число мигрировавших клеток в наблюдаемом поле показаны. PI окрашивания с последующим анализом методом проточной цитометрии показал 5-буду- или цисплатин-индуцированную апоптозу в течение 2-х дней в shILK- или siIQGAP1-трансфицированных клетках AGS (В), AGS клетки, предварительно обработанные с указанными ингибиторами в течение 0,5 ч (С), и shLuc- или shCHIP трансфецированные клетки AGS, обработанных LY294002 или 17-AAG (D). shLuc, контроль миРНК, или ДМСО использовали в качестве отрицательного контроля. Плазмиды на основе pcDNA3.1-Flag-ИЛК, содержащие полноразмерную ILK (ИЛК
1
-452
), фрагмент 171-452 (ILK
171
-452
) , или фрагмент 1-170 (ILK
1
-170
) трансфицировали в MKN45 клетки. По сравнению с pcDNA3.1-Flag (Флаг
) только, миграция клеток (Е) и апоптоз, индуцированный 5-ФУ (5 мкМ) (F) были обнаружены в отсутствие или в присутствии PD98059 и мысом. Данные представляют собой среднее ± SD трех независимых экспериментов. * Р &
л; 0,05, ** Р &
л; 0,01 и *** Р
&л; 0,001 по сравнению с контролем. #P
≪ 0,05, Р ##
≪ 0,01, и ### Р
&л; 0,001 по сравнению с контролем. NS:. Не имеет существенного значения
EGFR сигнализации регулирует ILK /IQGAP1 для активации ERK1 /2, NF-kB, и клеточную миграцию и пролиферацию
Чтобы проверить роль ILK /IQGAP1-опосредованной ERK1 /2 и NF-kB активации мы исследовали EGF сигнализацию /EGFR, как описано ранее [47], [48]. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля.

• Комбинированные функции, основанные на MT1-MMP экспрессии, плотность CD11b + иммуноцитов и LNR предсказывают клиниче…
• Характеристики вируса Эпштейна-Барра варианты, связанные с раком желудка в Южной Тунисе