En økning i integrin-bundet kinase ikke-kanonisk overfører NF-kB-medierte vekst fordeler overfor magecancerceller ved å aktivere ERK1 /2

en økning i integrin-bundet kinase ikke-kanonisk overfører NF-kB-medierte vekst fordeler overfor magekreftceller etter aktivering ERK1 /2
Abstract
Bakgrunn
Økt aktivitet eller uttrykk for intebundet kinase (ILK), som regulerer celle adhesjon, migrasjon og spredning, fører til onkogenese. Vi identifiserte det molekylære grunnlag for regulering av ILK og dens alternative rolle i givende ERK1 /2 /NF-kB-mediert vekst fordeler overfor magekreftceller.
Resultater
inhibering ILK med kort hårnål RNA eller T315, en antatt ILK inhibitor, opphevet NF-kB-mediert veksten i de humane magecancerceller AGS, SNU-1, MKN45, og GES-1. ILK stimulert Ras aktivitet for å aktivere c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /ribosomal S6-kinase /hemmer av κBα /NF-kB-signalering ved å lette dannelsen av IQ-motivet holdige GTPase-aktiverende protein 1 (IQGAP1) - Ras kompleks. Tvunget enzymatisk ILK uttrykk fremmet cellevekst ved å tilrettelegge ERK1 /2 /NF-kB signalering. PI3K aktivering eller redusert ekspresjon PTEN forlenget ERK1 /2-aktivering ved å beskytte ILK fra proteasom-mediert degradering. C-terminalen av heat shock beslektet 70 i samspill protein, en HSP90-assosiert E3 ubiquitin ligase, mediert ILK ubiquitinering å kontrollere PI3K- og HSP90-regulert ILK stabilisering og signalering. I tillegg til cellevekst, den identifiserte pathway fremmet cellemigrering og redusert følsomhet av magekreftceller til anticancermidler 5-fluorouracil og cisplatin. I tillegg eksogene administrasjon av EGF samt overekspresjon av EGFR utløst ILK- og IQGAP1 regulert ERK1 /2 /NF-kB aktivering, cellevekst og migrasjon.
Konklusjon
En økning i ILK ikke-kanonisk fremmer ERK1 /2 /NF-kB-aktivering og fører til vekst av magekreftceller.
nøkkelord
ILK Cellevekst vekst~~POS=HEADCOMP IQGAP1 ERK1 /2 NK-kB Bakgrunn Inte
bundet kinase (ILK), et 59-kDa serin /treonin-kinase, kommuniserer direkte med det cytoplasmatiske domene av β1 integrin [1]. ILK består av tre domener: N-terminal (ankyrin ANK) gjentas, en sentral pleckstrin homologi (PH) -lignende domene og et C-terminal kinase domene [2], [3]. Integrin-mediert celle-ekstracellulære matriks (ECM) vedheft eller vekstfaktorer aktiverer fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) til å fosforylere membran-bundet PI 4,5-bifosfat (PIP2) og generere PI 3,4,5-trifosfat (PIP3), som bindes til PH-lignende domene av ILK og aktiverer ILK [4], [5]. Etter ILK aktivering, kan den C-terminale kinase domene av ILK bindes til forskjellige proteiner, inkludert AKT, affixin, β-Parvin, glykogen syntase kinase (GSK) -3β, calponin homologi holdige ILK-bindende protein, 20-kDa regulerende lette kjeder av myosin (LC20), myosin-målretting subenhet av myosinlettkjedefosfatase fosfatase (MYPT1), paxillin, α-NAC, og proteinfosfatasen inhibitorer PHI-1, Kepi, og KPI-17 [2], [3] , [6], [7]. Den N-terminale ANK gjentar megle samspillet av ILK med ILKAP, et protein fosfatase 2C familiemedlem, og klemme, en LIM domene-bare adapter protein. ILK kan betraktes som en PIP3-samspill protein nedstrøms PI3K; dens effekter er blokkert av fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom 10 (PTEN) [8], [9]. PTEN undertrykker svulster ved dephosphorylating PIP3 [10], [11]
ILK spiller en viktig rolle i å regulere ulike cellulære prosesser, herunder spredning, overlevelse, migrasjon, cellecyklusprogresjonen, og angiogenese.; økt aktivitet eller uttrykk for ILK fører til Oncogenesis [2], [3]. Foruten å modulere sine partnerproteiner for cellulære prosesser, er ILK antatt å være involvert i en intracellulær signaltransduksjon nettverk. Mekanistisk, ILK fosforylerer direkte AKT på Ser473 og GSK-3β på Ser9 [4], [9] for å mediere β-catenin translokasjon og regulere AP-1-ekspresjonen for tumorcelle-proliferasjon [12]. NF-kB-aktivering er nødvendig for ilk-mediert onkogene prosesser, slik som anti-apoptotiske aktivitet [13], overlevelse fremming [14], epitelial-mesenchymale overgang [15], cellulær forlengelse og motstand mot apoptose [16], angiogenese [17 ], og migrasjon, invasjon og metastasering [18] - [20]. I tillegg er NF-kB-aktivering er nødvendig for den kanoniske regulering av IKKα og IKKß ved ILK /AKT pathway. For å utløse cellemigrasjon, kan ILK aktivere den lille GTPases RAC og CDC42 [21]. Videre regulerer ILK ERK1 /2-aktivering i myogenic differensiering [22]. Økt uttrykk av mikroRNA-143 og mikroRNA-145, som målrette ILK, hemmer AKT og ERK1 /2 trasé [23]. Det gjenstår imidlertid den molekylære mekanismen som ligger bak ILK-mediert ERK1 /2-aktivering ukjent.
Stimulering av celler av vekstfaktorer og cytokiner, samt celledelt vekselvirkning med ECM økning ILK aktivitet [24]. I tillegg til molekyl regulering av PI3K /PTEN av ILK, Aoyagi et al. identifisert ILK som en ny varmesjokkprotein (HSP) 90 klient-proteinet og funnet at farmakologisk inhibering av HSP90 resulterte i ILK nedbrytning i en proteasom-avhengig måte [25]. Videre HSP90-assosiert E3 ubiquitin ligase C-terminalen av heat shock beslektet 70 samspill protein (CHIP) forårsaker ILK degradering [26]. Hashiramoto et al. viste at HSP90 stabilisert ILK og vedvarende AKT og ERK1 /2 aktivisering [16]. Således spekulere vi et forhold mellom ILK stabilitet og aktivering av nedstrøms kinaser. Ras /MAPK-reaksjonsveien signalering er nødvendig for tumorigenesis [27]. Økt ILK ekspresjon er relatert til høy grad av magekreft, [28], prostatakreft [29], og ikke-småcellet lungekreft [30], selv om cellene i disse krefttyper som vanligvis havn Ras mutasjoner [31] - [33]. Målrette ILK med siRNA reduserer magekreft celle invasjon, spredning og vekst gjennom en ukjent mekanisme [34]. Når det gjelder muligheten for at ILK opptrer oppstrøms for NF-kB ved å regulere IKKα [13], som har vært implisert i mave tumorigenesis [35], er ILK spekulert for å aktivere cellevekst gjennom en NF-kB-regulert pathway. Ved hjelp av magekreftceller (AGS, MKN45, og SNU-1), studerte vi molekyl regulering av ILK og identifisert et ikke-kanonisk svei ILK regulert ERK1 /2 aktivisering for NF-kB-mediert magekreft cellevekst, migrasjon, og overlevelse opprykk.
Resultater
ILK aktivitet og uttrykk er avgjørende for NF-kB-mediert cellevekst
Økt aktivitet eller uttrykk for ILK forbedrer tumorigenesis ved å fremme cellevekst [6]. RNAi-baserte ILK stanse demper magekreft cellevekst [34], mens ILK overekspresjon er relatert til mage tumorigenesis [28]. I menneskelige mage svulster og AGS-avledet knuter i BALB /c mus, Ki-67-positive voksende celler koekspresjon ILK som demonstrert av fluorescens-basert farging (figur 1A) og AEC-baserte farging (tilleggsfiler 1: Tilleggs materialer og metoder , ytterligere fil 2: Figur S1) eksperimenter. For å undersøke mulige mekanismer underliggende ILK-mediert magekreft cellevekst, ble flere mage epiteliale cellelinjer karakterisert i henhold til deres ulike cellevekstrater, som var høyere for AGS og SNU-1 celler og lavere for MKN45 og GES-1 celler og anvendt i denne studien (Tilleggs fil 3: fig S2A). Sammenlignet med MKN45 cellene, AGS og SNU-1 celler hadde også forhøyet ILK uttrykk (tilleggsfiler 3: Figur S2B og S2C). En lentiviral basert shRNA ble anvendt for å dempe ILK
genetisk i AGS, SNU-1, MKN45, og GES-1 mage-epitelceller (figur 1B, øvre panel), så vel som i A549 og H1975 humane lunge adenokarsinomceller, HK-2 humane renale proksimale tubulære epitelceller, og THP-1 menneskelige monocyttiske celler (tilleggsfiler 3: Figur S2D). I disse cellene, ILK stanse signifikant (P
< 0,05) redusert cellevekst (figur 1B, tilleggsfiler 3: Figur S2E). Videre behandling av cellene med det ILK inhibitoren T315 [36] signifikant (P
< 0,05) og doseavhengig retardert cellevekst (figur 1C) uten cytotoksisitet (data ikke vist). I tillegg reduseres ble observert kolonidannelse i ILK-forstummet AGS celler (tilleggsfiler 3: Figur S2F). Dermed genet Slå (tilleggsfiler 3: Figur S2G) og farmakologiske metoder (tilleggsfiler 3: Figur S2H) for å undertrykke ILK aktivitet eller overekspresjon førte til cellesyklus arrest på G 1 fase. Disse resultatene viser en vekstfremmende rolle ILK. Figur 1 ILK ekspresjon er nødvendig for cellevekst og NF-kB-aktivering. (A) Representative fluorescens-baserte immunhistokjemisk farging viser koekspresjon av ILK (grønn
) og Ki-67 (rød
) i humane gastriske tumorer og AGS-avledede knuter i BALB /c-mus. DAPI (blå
) ble benyttet for kjernefysisk kontra. ILK + Ki-67 + celler i immunofluorescently farget vevssnitt presenteres som dot-plott av en FACS lignende analyse ved hjelp TissueQuest programvare. Cellene ble beregnet som den prosentvise og celletallet av de totale celler (DAPI + celler) per felt. (B) Western blot av ILK uttrykk i celler transfektert med shRNAs målgruppe ILK (shILK
) eller en kontroll luciferase (shLuc
). β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. WST-8-baserte analysen viser inhiberingen av celleveksten i ilk-stilnet celler. (C) Den doseavhengige effekt av ILK inhibitoren T315 på hemming av AGS cellevekst. (D) Representant fluorescens-basert immunhistokjemisk farging viser koekspresjon av ILK (grønn
) og fosforylert NF-kB Ser536 (rød
) i menneskelige mage svulster og AGS-avledede knuter i mus. DAPI (blå
) ble benyttet for kjernefysisk kontra. Dot-plott viser koekspresjon av ILK og NF-kB Ser536. (E) Logistisk regresjonsanalyse viste en sammenheng mellom ILK, fosforylert NF-kB Ser536, og Ki-67 i 93 magekreft prøver testet. R-squared (R
2
) og P
verdier vises. (F) EMSA viser NF-kB-aktivering. (G) luciferase reporter-analysen viser aktiveringen forholdet mellom NF-kB for å styre Renilla luciferase i celler behandlet med NF-kB-inhibitor CAPE (25 ug /ml). (H) Vekst på 25 mikrogram /ml CAPE-behandlede AGS celler. (I) NF-kB-aktivering i shLuc- eller shILK-transfekterte celler. (J) NF-kB aktivering etter 6 timer med T315 behandling i AGS celler. For cellevekst, kolonidannelsen, og luciferaseaktiviteten, data er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P
< 0,05, ** P
< 0,01, og *** P
< 0,001 sammenlignet med Dag 0 eller relativ kontroll. #P
≪ 0,05, ## P
< 0,01, og ### P
. ≪ 0.001 sammenlignet med shLuc
å karakterisere funksjonene i ILK-regulert cellevekst, NF- kB signalisering ble undersøkt fordi ILK kan fungere på oppstrømsiden av NF-kB ved å regulere IKKα [13]. Ved farging, ble det koekspresjon av ILK og fosforylert NF-kB (Ser536) observert i humane og muse gastrisk vev (figur 1D), og deres koekspresjon signifikant (P
< 0,01) og positivt korrelert med antall prolifererende celler , som er angitt med 55 triple-positive tilfeller av de totale 93 magekreft prøver (figur 1E, ytterligere fil 4: Figur S3). Farging for NF-kB nukleær translokasjon (Tilleggs fil 3: Fig S2I), EMSA (figur 1F), og promoter-analyser (figur 1G) bekreftet konstitutiv aktivering av NF-kB i AGS-celler, men ikke i MKN45 cellene. Behandling av celler med NF-kB-inhibitor CAPE signifikant (P
< 0,001) redusert NF-kB-aktivering (figur 1G) og cellevekst (figur 1 H). Enten ILK stanse (Figur 1I, tilleggsfiler 3: Figur S2J) eller T315 behandling (figur 1J) signifikant (P
< 0,05) stoppet NF-kB aktivitet. Resultatene viste at ILK er uunnværlig for cellevekst i cellelinjene som ble testet fordi det letter NF-kB aktivering i mage kreft.
ILK regulerer Ras aktivitet ved å tilrettelegge kompleks av IQGAP1-Ras å kontrollere MAPK-aktivert NF-kB
Fordi AGS celler havnen PIK3CA Hotell og KRAS
mutasjoner [37] undersøkte vi mulige regulatoriske virkningene av ILK på modulering av NF-kB aktivitet av disse 2 kinaser [38]. Ved hjelp av en menneskelig Phospho-MAPK Array Kit, identifiserte vi 10 kinaser som ble mer høyt uttrykt i AGS celler enn i MKN45 celler. Disse kinaser stort sett handlet nedstrøms av PI3K og MAPK signalveier (Tilleggs fil 5: Figur S4A). Ved western blotting, bekreftet vi økt fosforylering av AKT, ERK1 /2, og IκBα ledsaget av IκBα nedbrytning i AGS cellene (Figur 2A). Den farmakologiske inhibering av c-Raf, MEK1 /2, og PI3K signifikant (P
< 0,05) redusert vekst celle (figur 2B), IκBα fosforylering (Ser32) og nedbrytning (figur 2C), og NF-kB aktivitet ( Figur 2D), noe som indikerer at både PI3K- og Ras-aktivering av signalveier tilrettelagt NF-kB-aktivering. Effektene av ILK har blitt mye studert på grunn av dens interaksjon med celle vekst- og NF-kB-assosiert AKT [4], [9]. Overraskende, ILK lyddemping ikke påvirke AKT og GSK-3β fosforylering i AGS og SNU-1 celler, men kraftig redusert c-Raf og ERK1 /2 aktivering i alle celler som ble testet (figur 2E, ytterligere fil 5: Figur S4B). Uten AKT deaktivering, evaluert vi en alternativ vei for å aktivere NF-kB via en mekanisme som involverer MAPK /p90RSK /IκBα signaliserer [38]. Knockdown av ILK
redusert multippel fosforylering av RSK (Thr573, Thr359 /Ser363 og Ser380) og IκBα fosforylering (Ser32) og økt IκBα akkumulering (figur 2E). Hemme MEK1 /2 forårsaket lignende effekter (tilleggsfiler 5: Figur S4C) og en cellesyklus arrest på G 1 fase (tilleggsfiler 5: Figur S4D). En Ras pull-down-analysen viste at inhibering ILK forårsaket Ras deaktivering uten å påvirke stabiliteten av Ras-proteinet (figur 2F). Disse funnene viste en potensiell ikke-kanoniske vei for ILK å modulere NF-kB ved å regulere Ras /c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /IκBα signalering. Figur 2 ILK-IQGAP1-Ras kompleks opprett Ras aktivitet for å aktivere c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /RSK /IκBα /NF-kB signalering. (A) Western blot av de angitte proteiner i AGS og MKN45 celler. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. AGS-celler behandlet med c-Raf inhibitor GW5074, MEK1 /2 inhibitorer U0126 eller PD98059, eller PI3K-inhibitor LY294002 i 48 timer ble evaluert for deres vekst (B), fosforylering av IκBα ved Ser32 (pIκBα
) og totalt protein (C- ), og NF-kB-aktivering (D). (E) I shLuc- eller shILK-transfekterte celler, vestlige blotter viser uttrykket av de angitte proteiner. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. (F) Ras aktiveringstest som viser Ras-aktivitet og protein ekspresjon i shLuc- og shILK-transfekterte celler AGS. (G) Representative fluorescens-baserte immunhistokjemisk farging som viser koekspresjon av ILK (grønn
) og fosforylert ERK1 /2 Tyr202 /Thr204 (rød
) i humane gastriske tumorer og AGS-avledede knuter i BALB /c-mus. DAPI (blå
) ble benyttet for kjernefysisk kontra. Dot-plott viser koekspresjon av de angitte proteiner. I kontroll og IQGAP1 siRNA-transfekterte AGS-celler etter 48 timer, ekspresjonen av de angitte proteiner (H), NF-kB-aktivering og cellevekst (I) ble vist. Protein lysates hentet fra ubehandlede AGS celler (J) eller med shLuc og shILK transfeksjon (L, M) ble immunoutfelt (IP
) med kontroll IgG (C. IgG
) eller med antistoffer mot ILK, IQGAP1, og Ras . Immunoblotter (IB
) viser uttrykket av ILK, IQGAP1, og Ras. (K) Representant fluorescens-basert immunhistokjemisk farging viser koekspresjon av ILK (grønn
), IQGAP1 (rød
), og Ras (rød
) i AGS celler. DAPI (blå
) ble benyttet for kjernefysisk kontra. For spredning og luciferaseaktiviteten, data er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. ** P
< 0,01 og *** P
< 0,001 sammenlignet med kontrollgruppen. Oppreist trekant, økt uttrykk; omvendt trekant, redusert uttrykk
ILK kan endre ERK1 /2 aktivisering etter cellevekst og differensiering [22].; imidlertid, har den molekylære regulering relatert til Ras-signalisering ikke blitt dokumentert [2], [3]. Den koekspresjon av ILK og fosforylert ERK1 /2 (Tyr202 /Thr204) ble påvist i humane mage-tumorer og AGS-avledet knuter i BALB /c-mus (figur 2G). ILK samhandler med IQGAP1 [7], en Ras GTPase aktiverende-lignende protein som er ulik fra GAP, som forvandler Ras til inaktiv tilstand. Fordi IQGAP1 styrer Ras /MAPK-signalisering, er det onkogene [39], [40]. Uttrykket av IQGAP familie proteiner var uendret i AGS og MKN45 celler, selv etter ILK lyddemping (tilleggsfiler 5: Figur S4E). Men stanse onkogene IQGAP1, men ikke IQGAP3, (tilleggsfiler 5: Figur s4F-S4H) effektivt hemmet c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /RSK signale (figur 2 H), NF-kB aktivitet, og cellevekst ( Figur 2I). Ved å utføre en coimmunoprecipitation analysen, viste vi en potensiell kompleks husing ILK, IQGAP1, og Ras (figur 2J). Farging bekreftet at ILK ble koekspresjon på nivåer som ligner på IQGAP1 og Ras (figur 2K, ytterligere fil 6: Figur S5). Spesielt stanse ILK forstyrret IQGAP1-Ras kompleks (Figur 2L og 2M). Disse resultatene viste at ILK lettes dannelsen av IQGAP1-Ras-komplekset for å opprettholde Ras aktivitet.
Enzymatisk ILK modulerer dannelsen av IQGAP1-Ras-komplekset og ERK1 /2-mediert cellevekst
Våre funn viste at farmakologisk inhibering ILK redusert cellevekst, noe som indikerer vesentlig rolle av den enzymatiske aktiviteten til ILK. Videre hemme ILK av genetisk tilnærming forstyrret IQGAP1-mediert Ras signalering. Inhiberende aktivitet ILK farmakologisk med T315 (figur 3A), eller genetisk ved transfeksjon av den enzymatiske mutant ILK A262V [41] (figur 3B) også påvirket dannelsen av IQGAP1-Ras kompleks i AGS cellene. Tre avkortede regioner av ILK (figur 3C) ble overuttrykt i MKN45 cellene til å identifisere domenet avgjørende for å opprettholde den IQGAP1-Ras kompleks. Coimmunoprecipitation analyser viste at uttrykt ILK konstruerer husing PH og katalytiske kinase domene regioner immunoutfelt med IQGAP1 og Ras (Figur 3D). Derfor bare kinase domene som inneholder ILK aktivert ERK1 /2 (Figur 3E). Sammenlignet med den helaftens ILK (ILK 1-452), trans kinase-døde mutant ILK A262V ikke aktivere ERK1 /2 (figur 3F). Ytterligere eksperimenter viste at bare kinase domene-inneholdende ILK øket MEK1 /2-regulert NF-kB-aktivering (figur 3G) etterfulgt av MEK1 /2- og NF-kB-regulert cellevekst (figur 3 H) i de MKN45 cellene. Disse resultatene viste at enzymatisk ILK mediert dannelsen av IQGAP1-Ras-komplekset for å utløse ERK1 /2- og NF-kB-mediert cellevekst. Figur 3 Tvungen ILK uttrykk forenkler cellevekst ved å fremkalle ERK1 /2 /NF-kB aktivering. Protein lysater ekstrahert fra AGS-celler behandlet med T315 (A), eller transfektert med Myc-DDK-taggede mutant ILKA262V (B) ble immunoutfelt (IP
) med antistoffer mot ILK. Immunoblotter (IB
) viser uttrykket av ILK, IQGAP1, og Ras. Plasmider basert på pcDNA3.1-Flag-ILK inneholder full-lengde ILK (ILK
1 -452
), fragment 171-452 (ILK
171
-452
) , fragment 1-170 (ILK
1 -170
) (C), eller Myc-DDK-merket mutant ILKA262V ble transfektert inn MKN45 celler. (D) Coimmunoprecipitation av flagg med de angitte proteiner som er vist ved hjelp av western-blotting. Sammenlignet med pcDNA3.1-Flag (Flag
) bare, vestlige blotter viser uttrykket av fosforylert ERK1 /2 på Tyr202 /Thr204 (pErk1 Twitter /2
) (E, F). β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. NF-kB-aktivering (G) og cellevekst (H) ble også påvist i fravær eller nærvær av PD98059 og CAPE. Dataene er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. ** P
< 0,01 sammenlignet med kontroll. ## P
< 0,01 sammenlignet med ILK1-452. Stående trekant, økt ekspresjon.
PI3K-aktivering og redusert PTEN ekspresjon lette ERK1 /2 /NF-kB-aktivering ved å stabil ILK
Fordi ILK er avhengig av PI3K-mediert PIP3 generasjon for sin aktivering [4], vekstfaktor og inte-mediert PI3K aktivering eller en PI3K mutasjon i AGS celler [37] kunne bidra til ilk uttrykk og aktivering. Sammenlignet med veksten av de MKN45 celler, vekst av AGS-celler var upåvirket ved forhøyede IL-6-nivåer [42], og ekspresjonen av ß1 og P3 griner økte ikke (Tilleggs fil 7: Figur S6). Vi videre bekreftet at PIP3 generasjon var høyere i PI3K-mutert AGS celler (figur 4A). For å utforske forholdet mellom de PI3K, ilk, og Ras signalveier ble AGS cellene behandlet med MEK1 /2, PI3K, ILK eller Ras inhibitor for ulike varigheter. På 6 timer etter behandling, T315 litt hemmet MEK1 /2 og ERK1 /2 fosforylering (tilleggsfiler 8: Figur S7). Ved 24 timer etter behandling, PI3K inhibering forstyrret ILK ekspresjon, noe som ble etterfulgt av MEK1 /2 /ERK1 /2 deaktive- 24 timer etter behandlingen (figur 4B). Imidlertid gjorde Ras hemming ikke deaktivere AKT eller ILK i AGS celler, selv om Ras kan megle PI3K aktivering [27]. I likhet med ILK-forstummet AGS celler, viste både MKN45 og LY294002 stimulerte AGS cellene reduseres Ras aktivitet (figur 4C). Oversettelsen inhibitor cycloheximide tilrettelagt LY294002-indusert ILK downregulation (figur 4D) og proteasominhibitor MG132 snudd den nevnte effekt og ERK1 /2 inaktivering (figur 4E). Den tumor suppressor fosfatase PTEN regulerer negativt PI3K /PDK1 /AKT signalering [10], [11] og ILK aktivitet [8], [9], og de AGS cellene oppviste en lav ekspresjon av PTEN (figur 2A) [43]. Tvungen uttrykk for PTEN i AGS cellene ikke bare svekket den konstituerende fosforylering av PDK1, AKT, og PAK1 men også hemmet ILK uttrykk, ERK1 /2 fosforylering (figur 4F), og NF-kB aktivering (figur 4G). Disse resultatene indikerte at PI3K aktivering og redusert PTEN uttrykk stabilisere ILK for å regulere ERK1 /2 /NF-kB-aktivering. Figur 4 PI3K-aktivering og redusert PTEN ekspresjon lette ERK1 /2 /NF-kB-aktivering gjennom ILK stabilisering. (A) En PIP3 Masse ELISA-kit ble anvendt for å bestemme PI3K-aktivitet ved å måle mengden av PIP3 ekstrahert fra ubehandlede AGS og MKN45 celler og fra AGS-celler behandlet med LY294002 i 24 timer. (B) AGS-celler ble behandlet med PD98059, LY294002, T315, eller Ras-inhibitor FTI-277 i de angitte tidsrom. Western blot viser ekspresjonen av de angitte proteiner. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. (C) Ras-aktivitet ble påvist i AGS, MKN45, og LY294002-behandlede AGS-celler etter 24 timer. Western blot viser ekspresjonen av de angitte proteiner i AGS-celler forbehandlet med oversettelse inhibitor cykloheksimid (CHX
) (D) eller proteasominhibitor MG132 (E) i 0,5 timer og deretter behandlet med LY294002 i 24 timer. PTEN ble overexpressed i AGS celler ved hjelp pcDNA3.1-GFP-PTEN (PTEN
). Western blot viser ekspresjonen av de angitte proteiner sammenlignet med pcDNA3.1-GFP (Vector
) transfeksjon (F), og NF-kB-aktivering (G) ble også bestemt. For kinase og luciferase-aktivitet, data er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P
< 0,05, ** P
< 0,01, og *** P
< 0,001 sammenlignet med kontrollgruppen. Oppreist trekant, økt uttrykk; omvendt trekant, redusert uttrykk.
HSP90-forbundet E3 ligase CHIP negativt kontroller ILK stabilisering, ERK1 /2 /NF-kB aktivering, og cellevekst
Ved ytterligere verifisere mekanisme underliggende ILK destabilisering, våre resultater viste at AKT hemming påvirket ikke ILK stabilitet, mens PI3K hemming påvirkes ILK stabilitet (tilleggsfiler 9: Figur S8). HSP90 ble neste undersøkt fordi det kan føre til ILK degradering [25]. I likhet med resultatene av PI3K-hemming, shRNA-baserte (figur 5A) eller farmakologisk hemning av HSP90 (Tilleggs fil 10: Fig S9A) forsinket ikke bare PDK1 /AKT-fosforylering men også c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 aktivisering etter ILK degradering. Videre genetisk eller farmakologisk hemming HSP90 ved behandling med 17-AAG eller HDAC hemmer Saha, som feller HSP90 i en acetylert, enzymatisk inaktivt, dempes NF-kB aktivitet (figur 5B, tilleggsfiler 10: Figur S9B) og cellevekst ( Figur 5C). Cotreatment med MG132 reddet effekten av 17-AAG (figur 5D) og Saha på ILK nedbrytning og ERK1 /2 inaktivering (tilleggsfiler 10: Figur S9C). I MKN45 celler, behandling med MG132 øket ekspresjon ILK, MEK1 /2 og ERK1 /2 fosforylering (Tilleggs fil 11: Fig S10), og NF-kB-aktivering (data ikke vist). Coimmunoprecipitation demonstrerte dannelsen av HSP90-ILK kompleks (data ikke vist). Ved hjelp av en lentiviral basert shRNA tilnærming (figur 5E), HSP90-forbundet E3 ligaser, inkludert CHIP, Cullin 4A, og Cullin 4B [26], [44], [45], ble undersøkt for sine roller i ILK degradering. Resultatene viste at kun tie CHIP reddet ILK nedbrytning og ERK1 /2-inaktivering (figur 5F), NF-kB deaktivering (figur 5G), og hemming av cellevekst (figur 5H) etter den farmakologiske hemming av PI3K og HSP90. CHIP var nødvendig for ILK ubiquitinering i LY294002 behandlet AGS celler (Figur 5i). Disse resultatene viste at HSP90 /CHIP signale regulerer PI3K-mediert ILK stabilisering og ILK-regulert ERK1 /2 /NF-kB-aktivering og dermed muliggjør cellevekst. Figur 5 CHIP bestemmer ILK destabilisering, ERK1 /2 /NF-kB inaktivering, og hemming av cellevekst etter PI3K /HSP90 inaktivering. AGS-celler ble transfektert med shLuc eller shHSP90 eller forbehandlet med HSP90-inhibitor 17-AAG (0,1 pM) i 48 timer. Western blot viser ekspresjonen av de angitte proteiner (A), og NF-kB-aktivering (B) og cellevekst (C) ble også bestemt. (D) MG132 forbehandling (0,5 timer) reversert ILK uttrykk og fosforylert ERK1 /2 på Tyr202 /Thr204 (pErk1 Twitter /2
) i 17-AAG-behandlede AGS celler. (E) CHIP, Cullin 4A, og Cullin 4B ble helt stille på tribunen i AGS celler ved shRNAs. shRNA-transfekterte celler ble behandlet med LY294002 eller 17-AAG i 24 timer. Western blotting viste ekspresjon av ILK og fosforylert ERK1 /2 ved Tyr202 /Thr204 (pErk1
/2
) (F), og NF-kB-aktivering (G) og cellevekst (H) ble også bestemt. (I) I shLuc- og shCHIP-transfekterte celler behandlet med AGS LY294002, ILK ble immunopresipitert, og dens ubiquitylation ble probet. For western blot-analyse, ble β-actin anvendt som en intern kontroll. For luciferase-aktivitet og cellevekst, data er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. ** P
< 0,01 og *** P
< 0,001 sammenlignet med kontrollgruppen. ## P
< 0,01 og ### P
< 0,001 sammenlignet med shLuc eller DMSO. NS: ikke signifikant. Oppreist trekant, økt uttrykk; omvendt trekant, redusert uttrykk.
PI3K /HSP90 /CHIP /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-kB signalering bidrar til cellemigrasjon og følsomhet for 5-FU og cisplatin
Økt ILK aktivitet eller uttrykk kan regulere onkogene prosesser, blant annet celleformering, migrering, og overlevelse [3], [6]. Vi studerte potensialet involvering av de identifiserte PI3K /HSP90 /CHIP /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-kB signalveien i cellevekst fordeler. Sammenlignet med MKN45 celler, viste de AGS cellene økt trekkfugl aktivitet; Men ILK eller IQGAP1 stanse signifikant (P
< 0,001) avskaffet celle migrasjon (tilleggsfiler 12: Figur S11A). Farmakologisk blokkering PI3K /HSP90 /ILK /MEK1 /2 /NF-kB signalering i AGS cellene også signifikant (P
< 0,001) dempes den vandrende evne (tilleggsfiler 12: Figur S11B), og CHIP knockdown betydelig reversert inhibitoriske effekter forårsaket av hemning av PI3K og HSP90 (figur 6A, ytterligere fil 12: fig S11C). Anticancermidlene 5-FU og cisplatin anvendes vanligvis i behandlingen av gastriske cancere [46]. Behandling av AGS celler med 5-FU eller cisplatin, spesielt etter ILK eller IQGAP1 stanse, forårsaket økt mottakelighet for apoptose (figur 6B). T315 økte følsomheten av AGS celler til 5-FU og cisplatin (tilleggsfiler 12: Figur S11D). Farmakologisk hemme PI3K /HSP90 /ILK /MEK1 /2 /NF-kB signale også sensitivisert de AGS celler til 5-FU-indusert apoptose (figur 6C), mens CHIP stanse tilbakestående synergieffekter av LY294002 og 17-AAG på 5-FU indusert apoptose (figur 6D). I motsetning til dette overekspresjon av ILK inneholdende en katalytisk kinase domene, blant annet ILK 1-452 og ILK 171-452, forsterket MEK1 /2 /NF-kB-regulerte celle migrasjon (figur 6E) og celleoverlevelse etter behandling med 5-FU (figur 6F). Disse resultatene indikerer de felles virkninger av ILK og IQGAP1 på ERK1 /2 /NF-kB-aktivering av cellemigrering og overlevelse. Figur 6 PI3K /HSP90 /CHIP /ILK /ERK1 /2 /NF-kB signale bestemmer cellemigrasjon og kontrollerer følsomheten til cytostatika 5-FU og cisplatin. (A) Migrering aktivitet ble testet i shLuc- eller shCHIP-transfekterte celler behandlet med AGS LY294002 (25 pM) og 17-AAG (0,2 pM) i 12 timer. shLuc, kontroll siRNA eller DMSO ble anvendt som negative kontroller. Antallet migrerte celler i den observerte feltet vises. PI farging etterfulgt av strømningscytometri-analyse viste 5-fram eller cisplatin-indusert apoptose i 2 dager i shILK- eller siIQGAP1-transfekterte AGS-celler (B), AGS-celler forbehandlet med de angitte inhibitorer i 0,5 timer (C), og shLuc- eller shCHIP-transfekterte celler behandlet med AGS LY294002 eller 17-AAG (D). shLuc, kontroll siRNA eller DMSO ble anvendt som negative kontroller. Plasmider basert på pcDNA3.1-Flag-ILK inneholder full-lengde ILK (ILK
1 -452
), fragment 171-452 (ILK
171
-452
) eller fragment 1-170 (ILK
1 -170
) ble transfektert inn MKN45 celler. Sammenlignet med pcDNA3.1-Flag (Flag
) bare, cellemigrasjon (E) og apoptose indusert av 5-FU (5 mm) (F) ble påvist i fravær eller nærvær av PD98059 og CAPE. Dataene er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P
< 0,05, ** P
< 0,01 og *** P
< 0,001 sammenlignet med kontrollgruppen. #P
≪ 0,05, ## P
< 0,01, og ### P
< 0,001 sammenlignet med kontrollgruppen. NS. Uvesentlig
EGFR signale regulerer ILK /IQGAP1 å aktivere ERK1 /2, NF-kB, og celle migrasjon og spredning
å bekrefte rollen som ILK /IQGAP1-mediert ERK1 /2 og NF-kB aktivering β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll.

• Kombinerte funksjoner basert på MT1-MMP uttrykk, CD11b + immunocyttene tetthet og LNR forutsi klinisk utfall av magekreft
• Kjennetegn på Epstein Barr-virus varianter assosiert med gastrisk karsinom i Sør-Tunisia