En stigning i integrin-linked kinase ikke-kanonisk bibringer NF-KB-medieret vækst fordele til gastriske cancerceller ved at aktivere ERK1 /2

en stigning i integrin-linked kinase ikke-kanonisk bibringer NF-KB-medieret vækst fordele til gastriske cancerceller ved aktivering ERK1 /2
Abstrakt
Baggrund
Forøget aktivitet eller ekspressionen af ​​integrin-koblet kinase (ILK), som regulerer celleadhæsion, migration og proliferation, fører til onkogenese. Vi identificerede den molekylære basis for regulering af ILK og dens alternative rolle i giver ERK1 /2 /NF-KB-medieret vækst fordele til mavens kræftceller.
Resultater
Inhibiting ILK med kort hårnål RNA eller T315, en formodet ILK inhibitor, afskaffede NF-KB-medieret væksten i de menneskelige gastric kræftceller AGS, SNU-1, MKN45, og GES-1. ILK stimuleret Ras aktivitet at aktivere c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /ribosomal S6 kinase /inhibitor af κBα /NF-KB-signalering ved at lette dannelsen af ​​IQ-motivet-holdige GTPase-aktiverende protein 1 (IQGAP1) - ras-kompleks. Tvungen enzymatisk ILK ekspression fremmes cellevækst ved at lette ERK1 /2 /NF-KB-signalering. PI3K-aktivering eller nedsat PTEN ekspression forlænget ERK1 /2-aktivering ved at beskytte ILK fra proteasom-medieret nedbrydning. C-terminalen af ​​varmechok beslægtede 70 interagerende protein, en HSP90-associeret E3 ubiquitin ligase, medieret ILK ubiquitinering at kontrollere PI3K- og HSP90-reguleret ILK stabilisering og signalering. Foruden cellevækst, den identificerede pathway fremmes cellevandring og reduceret følsomhed gastriske cancerceller til anticancermidler 5-fluoruracil og cisplatin. Derudover eksogen administration af EGF samt overekspression af EGFR udløst ILK- og IQGAP1-reguleret ERK1 /2 /NF-KB-aktivering, cellevækst, og migration.
Konklusion
En stigning i ILK ikke-kanonisk fremmer ERK1 /2 /NF-KB-aktivering og fører til vækst af gastriske cancerceller. Salg Nøgleord
ILK Cellevækst IQGAP1 ERK1 /2 NK-KB Baggrund
integrin-linked kinase (ILK), en 59-kDa serin /threonin-kinase, interagerer direkte med det cytoplasmatiske domæne af β1 integrin [1]. ILK består af tre domæner: N-terminal ankyrin (ANK) gentager, en central pleckstrin homologi (PH) -lignende domæne, og et C-terminalt kinasedomæne [2], [3]. Integrin-medieret celle-ekstracellulær matrix (ECM) adhæsions- eller vækstfaktorer aktivere phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) at phosphorylere membranbundet PI 4,5-bisphosphat (PIP2) og generere PI 3,4,5-triphosphat (PIP3), som binder til PH-lignende domæne af ILK og aktiverer ILK [4], [5]. Efter ILK aktivering, kan den C-terminale kinasedomæne ILK binde til forskellige proteiner, herunder AKT, affixin, β-Parvin, glycogensyntasekinase (GSK) -3β, calponin homologi-holdige ILK-bindende protein, 20-kDa regulerende lette kæder af myosin (LC20), myosin-subunit'en af ​​myosin let kæde phosphatase (MYPT1), paxillin, α-NAC, og proteinet phosphataseinhibitorer PHI-1, kepi, og CPI-17 [2], [3] [6], [7]. De N-terminale ANK gentagelser mægle interaktionen af ​​ILK med ILKAP, et protein fosfatase 2C familiemedlem, og knibe, en LIM domæne-only adapter protein. ILK kan betragtes som en PIP3-interagerende protein nedstrøms for PI3K; dens virkninger blokeres af phosphatase og tensin homolog slettet på kromosom 10 (PTEN) [8], [9]. PTEN undertrykker tumorer ved dephosphorylere PIP3 [10], [11]
ILK spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​forskellige cellulære processer, herunder spredning, overlevelse, migration, cellecyklusprogression, og angiogenese.; forøget aktivitet eller ekspression af ILK fører til onkogenese [2], [3]. Udover at modulere partnerlandene proteiner til cellulære processer, er ILK hypotese at være involveret i et intracellulært signaltransduktion netværk. Mekanistisk, ILK direkte phosphorylerer AKT på Ser473 og GSK-3β på Ser9 [4], [9] til at mediere β-catenin translokation og regulere AP-1 ekspression for tumorcelleproliferation [12]. NF-KB-aktivering er essentiel for ILK-medieret onkogene processer, såsom anti-apoptotisk aktivitet [13], overlevelse fremme [14], epithelial-mesenchymal overgang [15], cellulær udvidelse og modstandsdygtighed over for apoptose [16], angiogenese [17 ], og migration, invasion, og metastase [18] - [20]. Desuden er NF-KB-aktivering kræves til den kanoniske regulering af IKKα og IKKß af ILK /AKT pathway. For at udløse celle migration, kan ILK aktivere lille GTPaser RAC og cdc42 [21]. Endvidere ILK regulerer ERK1 /2-aktivering i myogene differentiering [22]. Øget ekspression af microRNA-143 og microRNA-145, som er målrettet ILK, hæmmer AKT og ERK1 /2 veje [23]. Men den molekylære mekanisme underliggende ILK-medieret ERK1 /2-aktivering forbliver ukendt.
Stimulering af celler ved vækstfaktorer og cytokiner såvel som cellulær interaktion med ECM stigning ILK aktivitet [24]. Udover den molekylære regulering af PI3K /PTEN af ILK, Aoyagi et al. identificeret ILK som ny varmechokprotein (HSP) 90 klient-protein og fandt, at farmakologisk inhibering HSP90 resulterede i ILK nedbrydning i en proteasom-afhængig måde [25]. Endvidere HSP90-associerede E3 ubiquitin ligase C-terminalen af ​​varmechok beslægtede 70 interagerende protein (CHIP) forårsager ILK nedbrydning [26]. Hashiramoto et al. viste, at HSP90 stabiliseret ILK og vedvarende AKT og ERK1 /2-aktivering [16]. Således har vi spekulere en sammenhæng mellem ILK stabilitet og aktivering af dens downstream kinaser. Ras /MAPK-vejen signalering er væsentlig for tumorigenese [27]. Øget ILK ekspression er relateret til high-grade gastrisk cancer [28], prostatacancer [29], og ikke-småcellet lungekræft [30], selv om cellerne i disse kræftformer almindeligvis harbor ras-mutationer [31] - [33]. Målretning ILK med siRNA nedsætter gastrisk cancercelleinvasion, proliferation og vækst gennem en ukendt mekanisme [34]. Med hensyn til muligheden for, at ILK virker opstrøms for NF-KB ved at regulere IKKα [13], som har været impliceret i gastrisk tumorigenese [35], er ILK spekuleret at aktivere cellevækst gennem en NF-KB-regulerede pathway. Brug af gastriske cancerceller (AGS, MKN45, og SNU-1), studerede vi den molekylære regulering af ILK og identificeret en ikke-kanonisk pathway af ILK-reguleret ERK1 /2-aktivering for NF-KB-medieret gastrisk cancercellevækst, migration, og overlevelse fremme.
Resultater Salg ILK aktivitet og ekspression er afgørende for NF-KB-medieret cellevækst
Forøget aktivitet eller ekspression af ILK forbedrer tumorigenese ved at fremme cellevækst [6]. RNAi-baserede ILK tavshed dæmper mavekræft cellevækst [34], mens ILK overekspression er relateret til gastrisk tumorigenese [28]. I humane gastriske tumorer og AGS-afledte knuder i BALB /c-mus, Ki-67-positive prolifererende celler co-udtrykt ILK som påvist af fluorescens-baserede immunfarvning (figur 1A) og AEC-baserede immunfarvning (Yderligere fil 1: Supplerende materialer og metoder; Yderligere fil 2: Figur S1) eksperimenter. For at undersøge de mulige mekanismer, der ligger ILK-medieret vækst mavekræft celle blev flere gastrisk epiteliale cellelinjer karakteriseret ved deres forskellige celle vækstrater, som var højere for den årlige vækstundersøgelse og SNU-1 celler og lavere for MKN45 og GES-1 celler og anvendt i denne undersøgelse (Yderligere fil 3: Figur S2A). I forhold til de MKN45 celler, de AGS og SNU-1 celler også havde forhøjede ILK udtryk (Ekstra fil 3: Figur S2B og S2C). En lentiviral-baserede shRNA blev anvendt til at lukke munden ILK
genetisk i AGS, SNU-1, MKN45, og GES-1 gastriske epitelceller (figur 1B, øvre panel) samt i A549 og H1975 human lunge-adenocarcinom-celler, HK-2 human renal proximale tubulære epitelceller, og THP-1 humane monocytiske celler (Yderligere fil 3: Figur S2D). I disse celler, ILK silencing signifikant (P
< 0,05) faldt cellevækst (figur 1B Yderligere fil 3: Figur S2E). Endvidere behandle celler med ILK inhibitoren T315 [36] signifikant (P
< 0,05) og dosisafhængigt retarderede cellevækst (figur 1C) uden cytotoksicitet (data ikke vist). Derudover faldt kolonidannelse blev observeret i ILK-lyddæmpet AGS celler (Yderligere fil 3: Figur S2F). Således gen silencing (Yderligere fil 3: Figur S2G) og farmakologiske metoder (Yderligere fil 3: Figur S2H) at undertrykke ILK aktivitet eller overekspression medført cellecyklusstop på G 1 fase. Disse resultater viser en vækstfremmende rolle ILK. Figur 1 ILK ekspression er nødvendig for cellevækst og NF-KB-aktivering. (A) repræsentant fluorescens-baserede immunhistokemisk farvning viser coekspression af ILK (grøn
) og Ki-67 (rød og) i humane gastriske tumorer og AGS-afledte knuder i BALB /c-mus. DAPI (blå og) blev anvendt til nuklear kontrastfarvning. ILK + Ki-67 + -celler i de immunofluorescently farvede vævssnit præsenteres som dot-plots af en FACS-lignende analyse ved hjælp TissueQuest software. Cellerne blev beregnet som procentdelen og celleantallet af de totale celler (DAPI + celler) i hvert felt. (B) Western blot af ILK udtryk i celler transficeret med shRNAs målretning ILK (shILK
) eller en kontrol luciferase (shLuc
). β-actin blev anvendt som en intern kontrol. WST-8-baseret assay viser inhiberingen af ​​cellevækst i ILK-lyddæmpet celler. (C) Den dosisafhængige virkning af ILK inhibitoren T315 på inhiberingen af ​​AGS cellevækst. (D) repræsentant fluorescens-baserede immunhistokemisk farvning viser coekspression af ILK (grøn
) og phosphorylerede NF-KB Ser536 (rød og) i humane gastriske tumorer og AGS-afledte knuder i mus. DAPI (blå og) blev anvendt til nuklear kontrastfarvning. Dot-plots viser coekspression af ILK og NF-KB Ser536. (E) Logistisk regressionsanalyse viste en sammenhæng mellem ILK, phosphoryleret NF-KB Ser536, og Ki-67 i 93 mavekræft prøver testet. P
værdier R-kvadreret (R
2
) og er vist. (F) EMSA demonstrerer NF-KB-aktivering. (G) Luciferase reporter assay viser aktiveringen forholdet mellem NF-KB til at styre Renilla luciferase i celler behandlet med NF-KB inhibitor CAPE (25 ug /ml). (H) Vækst på 25 ug /ml CAPE-behandlede AGS-celler. (I) NF-KB-aktivering i shLuc- eller shILK-transficerede celler. (J) NF-KB-aktivering efter 6 timers T315 behandling i AGS celler. For cellevækst, kolonidannelse, og luciferaseaktivitet, data er gennemsnit ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. * P
< 0,05, ** P
< 0,01, og *** P
< 0,001 sammenlignet med dag 0 eller relativ kontrol. #P
≪ 0,05, ## P
< 0,01, og ### P
. ≪ 0,001 sammenlignet med shLuc
at karakterisere funktionerne i ILK-reguleret cellevækst, NF KB-signalering blev undersøgt fordi ILK kan virke opstrøms for NF-KB ved at regulere IKKα [13]. Ved immunfarvning blev coekspression af ILK og phosphoryleret NF-KB (Ser536) observeret i mennesker og mus gastrisk væv (Figur 1D), og deres co-ekspression signifikant (P
< 0,01) og positivt korreleret med antallet af prolifererende celler , som er angivet med 55 triple-positive tilfælde af de samlede 93 mavekræft prøver (figur 1E, Ekstra fil 4: Figur S3). Immunfarvning for NF-KB nuklear translokation (Yderligere fil 3: Figur S2I), EMSA (figur 1F), og promotor- assays (figur 1G) bekræftede konstitutiv aktivering af NF-KB i AGS celler, men ikke i MKN45 celler. Behandling af celler med NF-KB-inhibitor CAPE signifikant (P
< 0,001) reducerede NF-KB-aktivering (figur 1G) og cellevækst (figur 1 H). Enten ILK silencing (Figur 1I, Ekstra fil 3: Figur S2J) eller T315 behandling (figur 1J) signifikant (P
< 0,05) stoppet NF-KB-aktivitet. Disse resultater viste, at ILK er uundværlig for cellevækst i de testede fordi den letter NF-KB-aktivering i gastriske cancere cellelinier.
ILK regulerer Ras-aktivitet ved at lette komplekset af IQGAP1-Ras at styre MAPK-aktiveret NF-KB
Fordi AGS celler havnen PIK3CA
og KRAS
mutationer [37], vi undersøgte mulige regulatoriske effekter af ILK på modulering af NF-KB-aktivitet ved disse 2 kinaser [38]. Ved hjælp af en human Phospho-MAPK Array Kit, vi identificeret 10 kinaser, der var mere højt udtrykte i AGS celler end i MKN45 celler. Disse kinaser meste handlet nedstrøms for PI3K og MAPK signalveje (Yderligere fil 5: Figur S4A). Ved western blotting, bekræftede vi en øget phosphorylering af AKT, ERK1 /2, og kBa ledsaget af kBa nedbrydning i AGS celler (figur 2A). Den farmakologiske inhibering af c-Raf, MEK1 /2, og PI3K signifikant (P
< 0,05) reduceret cellevækst (figur 2B), kBa phosphorylering (Ser32) og nedbrydning (Figur 2C), og NF-KB-aktivitet ( figur 2D), hvilket indikerer, at både PI3K- og Ras-aktivering signalveje lettet NF-KB-aktivering. Virkningerne af ILK er nøje undersøgt på grund af dens interaktioner med celle vækst- og NF-KB-associeret AKT [4], [9]. Overraskende havde ILK silencing ikke påvirke AKT og GSK-3β-phosphorylering i AGS og SNU-1-celler, men markant reduceret c-Raf og ERK1 /2-aktivering i alle testede celler (figur 2E; Supplerende fil 5: Figur s4b). Uden AKT deaktivering, vi vurderet en alternativ vej for at aktivere NF-KB gennem en mekanisme, der involverer MAPK /p90RSK /kBa signalering [38]. Den knockdown af ILK
reducerede multiple fosforylering af RSK (Thr573, Thr359 /Ser363 og Ser380) og kBa phosphorylering (Ser32) og øget kBa akkumulation (Figur 2E). Hæmmende MEK1 /2 forårsagede lignende virkninger (Yderligere fil 5: Figur S4C) og en cellecyklusstop på G 1 fase (Yderligere fil 5: Figur S4D). En Ras pull-down assay viste, at inhibering af ILK forårsaget Ras deaktivering uden at påvirke stabiliteten af ​​Ras-proteinet (figur 2F). Disse resultater viste en potentiel ikke-kanoniske vej for ILK til at modulere NF-KB ved at regulere Ras /c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /kBa signalering. Figur 2 ILK-IQGAP1-Ras kompleks opretholder Ras aktivitet at aktivere c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /RSK /kBa /NF-KB-signalering. (A) Western blot af de angivne proteiner i AGS og MKN45 celler. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. AGS celler behandlet med c-Raf inhibitor GW5074, MEK1 /2 hæmmere U0126 eller PD98059, eller PI3K-inhibitor LY294002 i 48 timer blev bedømt for deres vækst (B), phosphorylering af kBa på Ser32 (pIκBα
) og totalt protein (C ), og NF-KB-aktivering (D). (E) I shLuc- eller shILK-transficerede celler, western blots viser ekspression af de angivne proteiner. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. (F) Ras aktivering assay viser Ras-aktivitet og protein ekspression i shLuc- og shILK-transficerede AGS-celler. (G) repræsentant fluorescens-baserede immunhistokemisk farvning viser coekspression af ILK (grøn
) og phosphoryleret ERK1 /2 Tyr202 /Thr204 (rød og) i humane gastriske tumorer og AGS-afledte knuder i BALB /c-mus. DAPI (blå og) blev anvendt til nuklear kontrastfarvning. Dot-plots viser coekspression af de angivne proteiner. I kontrol og IQGAP1 siRNA-transficerede AGS-celler efter 48 timer, ekspressionen af ​​de angivne proteiner (H), blev vist NF-KB-aktivering, og cellevækst (I). Proteinlysater ekstraheret fra ubehandlede AGS celler (J) eller med shLuc og shILK transfektion (L, M) blev immunpræcipiteret (IP
) med kontrol-IgG (C. IgG
) eller med antistoffer mod ILK, IQGAP1, og Ras . Immunoblots (IB
) viser udtryk for ILK, IQGAP1, og Ras. (K) Repræsentant fluorescens-baserede immunhistokemisk farvning viser coekspression af ILK (grøn
), IQGAP1 (rød
), og Ras (rød
) i AGS celler. DAPI (blå og) blev anvendt til nuklear kontrastfarvning. For proliferation og luciferaseaktivitet, data er gennemsnit ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. ** P
< 0,01 og *** P
< 0,001 sammenlignet med kontrol. Upright trekant, øget udtryk; omvendt trekant, nedsat ekspression
ILK kan ændre ERK1 /2-aktivering under cellevækst og differentiering [22].; imidlertid har den molekylære regulering relateret til Ras-signalering ikke dokumenteret [2], [3]. Den coekspression af ILK og phosphoryleret ERK1 /2 (Tyr202 /Thr204) blev påvist i humane gastriske tumorer og AGS-afledte knuder i BALB /c-mus (Figur 2G). ILK interagerer med IQGAP1 [7], en Ras GTPase-aktiverende-lignende protein, der er forskellig fra GAP, der forvandler Ras til dets inaktive tilstand. Fordi IQGAP1 kontrollerer Ras /MAPK signalering, er det onkogen [39], [40]. Udtrykket af IQGAP familie proteiner var uændret i de AGS og MKN45 celler, selv efter ILK lyddæmpning (Yderligere fil 5: Figur S4E). Men tavshed onkogen IQGAP1, men ikke IQGAP3, (Yderligere fil 5: Figur S4F-S4H) effektivt hæmmede c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /RSK signalering (Figur 2H), NF-KB-aktivitet, og cellevækst ( Figur 2I). Ved at udføre en co-immunpræcipitationseksperimenter assay, demonstrerede vi en potentiel kompleks huser ILK, IQGAP1, og Ras (Figur 2J). Immunfarvning bekræftede, at ILK blev co-udtrykt på niveauer svarende til IQGAP1 og Ras (figur 2K; Supplerende fil 6: Figur S5). Især silencing ILK forstyrrede IQGAP1-Ras-kompleks (figur 2L og 2M). Disse resultater viste, at ILK lettet dannelsen af ​​IQGAP1-Ras-komplekset til at opretholde Ras-aktivitet.
Enzymatisk ILK modulerer dannelsen af ​​IQGAP1-Ras kompleks og ERK1 /2-medieret cellevækst
Vores resultater viste, at farmakologisk inhibering ILK nedsat cellevækst, hvilket indikerer den vigtige rolle, den enzymatiske aktivitet af ILK. Yderligere inhibere ILK af den genetiske fremgangsmåde forstyrret IQGAP1-medieret Ras-signalering. Inhiberende ILK aktivitet farmakologisk med T315 (figur 3A) eller genetisk ved transfektion den enzymatiske mutant ILK A262V [41] (figur 3B) også forstyrret dannelsen af ​​IQGAP1-Ras-komplekset i AGS-celler. Tre trunkerede regioner af ILK (figur 3C) blev overudtrykt i de MKN45 celler for at identificere domænet afgørende for at opretholde den IQGAP1-Ras-komplekset. Co-immunpræcipitationseksperimenter assays viste, at overudtrykt ILK konstruerer huser PH og katalytiske kinase domæne-regioner immunopræcipiteret med IQGAP1 og Ras (figur 3D). Derfor er det kun kinasedomæne-holdige ILK aktiveret ERK1 /2 (figur 3E). Sammenlignet med fuld-længde ILK (ILK 1-452), transfektion af kinase-døde mutant ILK A262V aktiverede ikke ERK1 /2 (figur 3F). Yderligere eksperimenter viste, at kun kinasedomæne-holdige ILK øget MEK1 /2-reguleret NF-KB-aktivering (figur 3G) efterfulgt af MEK1 /2- og NF-KB-reguleret cellevækst (figur 3H) i MKN45 celler. Disse resultater viste, at enzymatiske ILK medierede dannelsen af ​​IQGAP1-Ras-komplekset til at udløse ERK1 /2- og NF-KB-medieret cellevækst. Figur 3 Tvungen ILK ekspression letter cellevækst ved at inducere ERK1 /2 /NF-KB-aktivering. Proteinlysater ekstraheret fra AGS celler behandlet med T315 (A) eller transficeret med Myc-DDK-mærket mutant ILKA262V (B) blev immunpræcipiteret (IP
) med antistoffer mod ILK. Immunoblots (IB
) viser udtryk for ILK, IQGAP1, og Ras. Plasmider baseret på pcDNA3.1-Flag-ILK indeholder fuld længde ILK (ILK
1
-452
), fragment 171-452 (ILK
171
-452
) , fragment 1-170 (ILK
1
-170
) (C), eller Myc-DDK-mærket mutant ILKA262V blev transficeret ind MKN45 celler. (D) co-immunpræcipitationseksperimenter af Flag med de angivne proteiner er vist ved hjælp af Western blotting. Sammenlignet med pcDNA3.1-Flag (Flag
) kun, western blots viser ekspression af phosphoryleret ERK1 /2 ved Tyr202 /Thr204 (pErk1
/2
) (E, F). β-actin blev anvendt som en intern kontrol. NF-KB-aktivering (G) og cellevækst (H) blev også påvist i fraværet eller tilstedeværelsen af ​​PD98059 og CAPE. Data er gennemsnit ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. ** P
< 0,01 sammenlignet med kontrol. ## P
< 0,01 sammenlignet med ILK1-452. Opretstående trekant, forøget ekspression.
PI3K-aktivering og nedsat PTEN ekspression lette ERK1 /2 /NF-KB-aktivering ved at stabilisere ILK
Fordi ILK er afhængig af PI3K-medieret PIP3 generation til dens aktivering [4], vækstfaktor- og integrin-medieret PI3K aktivering eller et PI3K mutation i AGS celler [37] kunne bidrage til ILK udtryk og aktivering. Sammenlignet med væksten i de MKN45 celler, væksten af ​​AGS celler var upåvirket af forhøjede IL-6 niveauer [42], og udtryk for p1 og p3 integriner steg ikke (Yderligere fil 7: Figur S6). Vi bekræftede endvidere, at PIP3 generation var højere i PI3K-muterede AGS celler (figur 4A). At undersøge sammenhængen mellem de PI3K, ILK, og Ras signalveje blev AGS celler behandlet med MEK1 /2, PI3K, ILK, eller Ras-inhibitor til forskellig varighed. Ved 6 timer efter behandling, T315 svagt inhiberet MEK1 /2 og ERK1 /2 phosphorylering (Yderligere fil 8: Figur S7). 24 timer efter behandling, PI3K inhibering forstyrret ILK ekspression, som blev efterfulgt af MEK1 /2 /ERK1 /2 deaktivering 24 timer efter behandling (figur 4B). Men Ras inhibering ikke deaktivere AKT eller ILK i AGS celler, selv om Ras kan mediere PI3K-aktivering [27]. Svarende til ILK-lyddæmpet AGS celler, viste både MKN45 og LY294002-stimulerede AGS celler reduceret Ras aktivitet (figur 4C). Oversættelsen inhibitor cycloheximid lettet LY294002-induceret ILK nedregulering (figur 4D) og proteasominhibitor MG132 vendt den førnævnte effekt og ERK1 /2-inaktivering (fig 4E). Tumor suppressor phosphatase PTEN regulerer negativt PI3K /PDK1 /AKT signalering [10], [11] og ILK aktivitet [8], [9], og de AGS celler udviste en lav ekspression af PTEN (figur 2A) [43]. Den tvungne ekspression af PTEN i AGS celler ikke blot svækkede den konstitutive phosphorylering af PDK1, AKT, og PAK1 men også inhiberede ILK ekspression, ERK1 /2 phosphorylering (fig 4F), og NF-KB-aktivering (figur 4G). Disse resultater indikerede, at PI3K-aktivering og nedsat PTEN ekspression stabilisere ILK at regulere ERK1 /2 /NF-KB-aktivering. Figur 4 PI3K-aktivering og nedsat PTEN ekspression lette ERK1 /2 /NF-KB-aktivering gennem ILK stabilisering. (A) A PIP3 Mass ELISA Kit blev anvendt til bestemmelse PI3K-aktivitet ved at måle mængden af ​​PIP3 ekstraheret fra ubehandlede AGS og MKN45 celler og fra AGS celler behandlet med LY294002 i 24 timer. (B) AGS-celler blev behandlet med PD98059, LY294002, T315, eller Ras-inhibitor FTI-277 i de angivne tidsrum. Western blots viser ekspression af de angivne proteiner. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. (C) Ras aktivitet blev detekteret i AGS, MKN45, og LY294002-behandlede AGS celler efter 24 timer. Western blots viser ekspression af de angivne proteiner i AGS celler forbehandlet med oversættelsen inhibitoren cycloheximid (CHX
) (D) eller proteasominhibitor MG132 (E) i 0,5 time og derefter behandlet med LY294002 i 24 timer. PTEN blev overudtrykt i AGS celler ved hjælp pcDNA3.1-GFP-PTEN (PTEN
). Western blots viser ekspression af de angivne proteiner sammenlignet med pcDNA3.1-GFP (Vector
) transfektion (F), og NF-KB-aktivering (G) blev også bestemt. For kinase og luciferaseaktivitet, data er gennemsnit ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. * P
< 0,05, ** P
< 0,01, og *** P
< 0,001 sammenlignet med kontrol. Upright trekant, øget udtryk; omvendt trekant, nedsat udtryk.
HSP90-associeret E3 ligase CHIP negativt styrer ILK stabilisering, ERK1 /2 /NF-KB-aktivering, og cellevækst
Ved yderligere at kontrollere den mekanisme underliggende ILK destabilisering, vores resultater viste, at AKT hæmning påvirkede ikke ILK stabilitet, mens PI3K hæmning påvirket ILK stabilitet (Yderligere fil 9: Figur S8). HSP90 blev dernæst undersøgt, fordi det kan forårsage ILK nedbrydning [25]. Svarende til resultaterne af PI3K-inhibering, shRNA-baserede (figur 5A) eller farmakologisk inhibering af HSP90 (Supplerende fil 10: Figur S9A) forsinkede ikke kun PDK1 /AKT phosphorylering men også c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2-aktivering efter ILK nedbrydning. Desuden genetisk eller farmakologisk hæmme HSP90 ved behandling med 17-AAG eller HDAC-hæmmer SAHA, der fælder HSP90 i en acetyleret, enzymatisk inaktiv tilstand, svækket NF-KB-aktivitet (figur 5B, Ekstra fil 10: Figur S9B) og cellevækst ( figur 5C). Samtidig behandling med MG132 reddet virkningerne af 17-AAG (figur 5D) og SAHA på ILK nedbrydning og ERK1 /2 inaktivering (Yderligere fil 10: Figur S9C). I de MKN45 celler, behandling med MG132 forøget ILK ekspression, MEK1 /2 og ERK1 /2 phosphorylering (Yderligere fil 11: Figur S10), og NF-KB-aktivering (data ikke vist). Co-immunpræcipitationseksperimenter demonstreret dannelsen af ​​HSP90-ILK kompleks (data ikke vist). Ved hjælp af en lentiviral-baserede shRNA tilgang (figur 5E), HSP90-associerede E3 ligaser, herunder CHIP, cullin 4A, og Cullin 4B [26], [44], [45], blev undersøgt for deres roller i ILK nedbrydning. Resultaterne viste, at kun silencing CHIP reddet ILK nedbrydning og ERK1 /2-inaktivering (fig 5F), NF-KB deaktivering (figur 5G), og cellevækstinhiberingen (figur 5H) efter den farmakologiske inhibering af PI3K og HSP90. CHIP var nødvendig for ILK ubiquitinering i LY294002-behandlede AGS celler (Figur 5I). Disse resultater viste, at HSP90 /CHIP signalering regulerer PI3K-medieret ILK stabilisering og ILK-reguleret ERK1 /2 /NF-KB-aktivering og letter således cellevækst. Figur 5 CHIP bestemmer ILK destabilisering, ERK1 /2 /NF-KB-inaktivering, og cellevækstinhiberingen efter PI3K /HSP90 inaktivering. AGS-celler blev transficeret med shLuc eller shHSP90 eller forbehandlet med HSP90 inhibitor 17-AAG (0,1 uM) i 48 timer. Western blots viser ekspression af de angivne proteiner (A), og NF-KB-aktivering (B) og cellevækst (C) blev også bestemt. (D) MG132 forbehandling (0,5 h) vendt ILK udtryk og phosphoryleret ERK1 /2 ved Tyr202 /Thr204 (pErk1
/2
) i 17-AAG-behandlede AGS celler. (E) CHIP, cullin 4A, og Cullin 4B blev stille i AGS celler ved shRNAs. shRNA-transficerede celler blev behandlet med LY294002 eller 17-AAG i 24 timer. Western blotting viste ekspressionen af ​​ILK og phosphoryleret ERK1 /2 ved Tyr202 /Thr204 (pErk1
/2
) (F), og NF-KB-aktivering (G) og cellevækst (H) blev også bestemt. (I) I shLuc- og shCHIP-transficerede AGS celler behandlet med LY294002, ILK blev immunopræcipiteret, og dens ubiquitylering blev probet. Til Western blot-analyse blev β-actin anvendt som en intern kontrol. For luciferaseaktivitet og cellevækst, data er gennemsnit ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. ** P
< 0,01 og *** P
< 0,001 sammenlignet med kontrol. ## P
< 0,01 og ### P
< 0,001 sammenlignet med shLuc eller DMSO. NS: ikke signifikant. Upright trekant, øget udtryk; omvendt trekant, nedsat ekspression.
PI3K /HSP90 /CHIP /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-KB-signalering bidrager til celle migration og følsomhed over for 5-FU og cisplatin
Øget ILK aktivitet eller ekspression kan regulere onkogen processer, herunder celleproliferation, migration og overlevelse [3], [6]. Vi studerede den potentielle inddragelse af identificerede PI3K /HSP90 /CHIP /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-KB-signalvejen i celle vækst fordele. Sammenlignet med MKN45 celler viste AGS celler øget vandrende aktivitet; dog ILK eller IQGAP1 silencing signifikant (P
< 0,001) afskaffede celle migration (Yderligere fil 12: Figur S11A). Farmakologisk blokerer PI3K /HSP90 /ILK /MEK1 /2 /NF-KB-signalering i AGS celler også signifikant (P
< 0,001) svækkede den vandrende evne (Yderligere fil 12: Figur S11B), og CHIP knockdown betydeligt vendt hæmmende virkninger forårsaget af hæmning af PI3K og HSP90 (figur 6A, Ekstra fil 12: Figur S11C). Anticancermidlerne 5-FU og cisplatin er almindeligt anvendt til behandling af gastriske cancere [46]. Behandling af AGS celler med 5-FU eller cisplatin, især efter ILK eller IQGAP1 dæmpning, forårsagede øget modtagelighed for apoptose (figur 6B). T315 øget følsomhed af AGS celler til 5-FU og cisplatin (Yderligere fil 12: Figur S11D). Farmakologisk hæmning PI3K /HSP90 /ILK /MEK1 /2 /NF-KB-signalering også sensibiliserede de AGS celler til 5-FU-induceret apoptose (figur 6C), hvorimod CHIP lyddæmpning retarderet de synergistiske virkninger af LY294002 og 17-AAG på 5-FU -induceret apoptose (fig 6D). I modsætning hertil overekspression af ILK indeholdende en katalytisk kinasedomæne, herunder ILK 1-452 og ILK 171-452, forstærkede MEK1 /2 /NF-KB-regulerede cellemigration (figur 6E) og celleoverlevelse efter behandling med 5-FU (fig 6F). Disse resultater indikerede de fælles virkninger af ILK og IQGAP1 på ERK1 /2 /NF-KB-aktivering for cellevandring og overlevelse. Figur 6 PI3K /HSP90 /CHIP /ILK /ERK1 /2 /NF-KB-signalering bestemmer cellemigrering og styrer følsomhed over for de anticancermidler 5-FU og cisplatin. (A) Migration aktivitet blev testet i shLuc- eller shCHIP-transficerede AGS celler behandlet med LY294002 (25 uM) og 17-AAG (0,2 uM) i 12 timer. shLuc, kontrol siRNA, eller DMSO blev anvendt som negative kontroller. Antallet af migrerede celler i den observerede felt er vist. PI-farvning efterfulgt af flowcytometri analyse viste 5-FU, eller cisplatin-induceret apoptose i 2 dage i shILK- eller siIQGAP1-transficerede AGS-celler (B), AGS celler forbehandlet med de angivne inhibitorer i 0,5 time (C), og shLuc- eller shCHIP-transficerede AGS celler behandlet med LY294002 eller 17-AAG (D). shLuc, kontrol siRNA, eller DMSO blev anvendt som negative kontroller. Plasmider baseret på pcDNA3.1-Flag-ILK indeholder fuld længde ILK (ILK
1
-452
), fragment 171-452 (ILK
171
-452
) eller et fragment 1-170 (ILK
1
-170
) blev transficeret ind MKN45 celler. Sammenlignet med pcDNA3.1-Flag (Flag
) kun, celle migration (E) og apoptose induceret af 5-FU (5 uM) (F) blev påvist i fravær eller tilstedeværelse af PD98059 og CAPE. Data er gennemsnit ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. * P
< 0,05, ** P
< 0,01 og *** P
< 0,001 sammenlignet med kontrol. #P
≪ 0,05, ## P
< 0,01, og ### P
< 0,001 sammenlignet med kontrol.

• Kombinerede funktioner baseret på MT1-MMP udtryk, CD11b + immunocytter tæthed og LNR forudsige kliniske resultater af mavekræft
• Karakteristik af Epstein-Barr-virus-varianter associeret med gastrisk karcinom i det sydlige Tunesien