Um aumento da quinase ligada a integrina não confere vantagens de crescimento canonicamente NF-kB mediada por células cancerosas para gástricas através da activação de ERK1 /2

Um aumento da quinase ligada-integrina não canonicamente confere vantagens de crescimento NF-kB mediadas para as células cancerosas gástricas ativando ERK1 /2 da arte abstracta
Fundo
atividade ou expressão da quinase ligada-integrina (ILK) Aumento , que regula a adesão celular, a migração, a proliferação e, conduz à oncogénese. Identificamos a base molecular para a regulação da ILK e seu papel alternativa em conferir ERK1 /2 /vantagens de crescimento NF-kB mediada às células cancerosas gástricas.
Resultados
ILK Inibidor com RNA curto hairpin ou T315, um putativo inibidor de ILK, aboliu NF-kB mediada do crescimento das células cancerosas gástricas AGS humanos, SNU-1, MKN45 e GES-1. ILK estimulou a actividade de Ras para activar o c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /ribossomal S6 quinase /inibidor de sinalização κBα /NF-kB, facilitando a formação da QI activadora de GTPase da proteína contendo o motivo 1 (IQGAP1) - complexo Ras. Forçado expressão de ILK enzimática promoveu o crescimento celular, facilitando sinalização ERK1 /2 /NF-kB. activação de PI3K ou diminuição da expressão de PTEN prolongada ERK1 2 activação /protegendo ILK da degradação mediada por proteassoma. C-terminal de choque térmico 70 cognato proteína interage, uma ligase E3 ubiquitina associada-HSP90, mediada ubiquitinação de ILK para controlar PI3K- e HSP90-regulada estabilização de ILK e sinalização. Além do crescimento celular, da via identificados promoveu a migração celular e diminuiu a sensibilidade de células de cancro gástrico para os agentes anti-cancro 5-f luorouracilo e cisplatina. Além disso, a administração exógena de EGF, bem como a sobre-expressão do EGFR e disparado ILK- IQGAP1-regulada ERK1 /2 /NF-kB activação, crescimento celular, e a migração.

Conclusão Um aumento de ILK não canonicamente promove ERK1 /2 /activação de NF-kB e leva ao crescimento de células de cancro gástrico.
crescimento celular de ILK IQGAP1 ERK1 /2 NK-kB fundo
quinase integrina ligada (ILK)
palavras-chave, um 59-kDa serina /treonina quinase, interage directamente com o domínio citoplasmático de integrina β1 [1]. ILK compreende três domínios: N-terminal de anquirina (ANK repetições), uma homologia plecstrina central (PH) -like domínio e um domínio de cinase de terminal-C [2], [3]. célula-matriz extracelular mediada por integrina (ECM) de adesão ou factores de crescimento activar fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) para fosforilar membrana de limite PI 4,5-bifosfato (PIP2) e gerar PI 3,4,5-trifosfato (PIP3), que se liga ao domínio PH tipo de ILK ILK activa e [4], [5]. Após a activação de ILK, o domínio de cinase de terminal-C de ILK pode ligar-se a várias proteínas, incluindo AKT, affixin, β-parvin, glicogénio sintase quinase (GSK) -3β, calponina proteína de ligação de ILK contendo homologia, a 20-kDa regulamentar cadeias leves de miosina (LC20), a subunidade de direccionamento miosina de fosfatase da miosina de cadeia leve (MYPT1), paxilina, α-NAC, e os inibidores de fosfatase de proteína Phi-1, kEPI, e IPC-17 [2], [3] , [6], [7]. As repetições ANK N-terminal mediar a interação de ILK com ILKAP, um membro da família 2C proteína fosfatase, e Pinch, uma proteína adaptadora só de domínio LIM. ILK pode ser considerado uma proteína que interage com PIP3 jusante de PI3K; seus efeitos são bloqueados por fosfatase e tensina homólogo excluída no cromossomo 10 (PTEN) [8], [9]. PTEN suprime tumores por desfosforilação PIP3 [10], [11]
ILK desempenha um papel essencial na regulação de vários processos celulares, incluindo a proliferação, a sobrevivência, a migração, a progressão do ciclo celular, e angiogénese.; aumento da actividade ou expressão de ILK conduz à oncogénese [2], [3]. Além de modular os seus parceiros proteínas de processos celulares, ILK-se a hipótese de ser envolvido numa rede de transdução de sinal intracelular. Mecanisticamente, ILK fosforila directamente sobre AKT Ser473 e GSK-3β em Ser9 [4], [9] para mediar β-catenina translocação e regular a expressão de AP-1 para a proliferação de células de tumor [12]. activação de NF-kB é essencial para os processos oncogénicos mediada por estirpe, tais como actividade anti-apoptótica [13], a promoção de sobrevivência [14], a transição epitelial-mesenquimal [15], extensão celular e resistência à apoptose [16], a angiogénese [17 ], e a migração, invasão e metástase [18] - [20]. Além disso, a activação de NF-kB é necessário para a regulação canónica de IKKα IKKß e pela via de ILK /AKT. Para provocar a migração de células, de ILK pode activar a RAC e GTPases pequenas CDC42 [21]. Além disso, de ILK regula a activação de ERK1 /2 em diferenciação miogénica [22]. O aumento da expressão de microRNA-143 e microARN-145, que têm como alvo de ILK, inibe AKT e ERK1 /2 vias [23]. No entanto, o mecanismo molecular subjacente de ILK mediada por activação de ERK1 /2 permanece desconhecida.
A estimulação das células por factores de crescimento e citocinas, bem como a interacção celular com a actividade de ILK aumento ECM [24]. Além da regulação molecular de PI3K /PTEN por ILK, Aoyagi et al. ILK identificado como uma proteína cliente novo proteína de choque térmico (HSP) 90 e verificaram que inibir farmacologicamente HSP90 resultou na degradação de ILK numa forma dependente de proteassoma [25]. Além disso, a HSP90-associado ubiquitina-ligase E3 C-terminal de cognato de choque térmico 70 interagindo proteína (chip) provoca a degradação de ILK [26]. Hashiramoto et ai. demonstraram que a HSP90 estabilizado de ILK e sustentada AKT e ERK1 2 activação /[16]. Assim, especula-se uma relação entre a estabilidade de ILK e a activação das suas quinases a jusante. a sinalização da via Ras /MAPK é essencial para a tumorigénese [27]. O aumento da expressão de ILK está relacionada com cancro de alto grau gástrica [28], o cancro da próstata [29], e cancro do pulmão de células não pequenas [30], embora as células nestes cancros geralmente abrigam mutações de Ras [31] - [33]. Segmentação ILK com siRNA diminui invasão câncer gástrico celular, proliferação e crescimento por meio de um mecanismo desconhecido [34]. No que respeita à possibilidade de que a ILK actua a montante de NF-kB através da regulação IKKα [13], que tem sido implicada em tumorigénese gástrica [35], de ILK é especulado para activar o crescimento de células através de uma via de NF-kB-regulado. Usando células de cancro gástrico (AGS, MKN45, e SNU-1), estudou-se a regulação molecular de ILK e identificada uma via não-canónica de ERK1 /2 activação regulada-ILK para o crescimento de células de cancro gástrico NF-kB mediada por, migração, e sobrevivência promoção.

resultados da actividade de ILK e expressão são essenciais para o aumento da atividade crescimento celular
NF-kB mediada ou expressão de ILK aumenta tumorigênese, promovendo o crescimento celular [6]. À base de RNAi silenciamento de ILK atenua o crescimento de células de cancro gástrico [34], enquanto que a sobre-expressão de ILK está relacionada com a tumorigénese gástrica [28]. Em tumores gástricos humanos e nódulos AGS-derivados em ratinhos BALB /c, Ki-67-positivo células em proliferação de ILK co-expressa como demonstrado pela baseados em fluorescência imunocoloração (Figura 1A) e imunocoloração à base de AEC (arquivo adicional 1: Materiais e métodos suplementares; arquivo adicionais 2: Figura S1) experimentos. Para investigar os possíveis mecanismos de crescimento de células de câncer gástrico mediada por ILK subjacente, várias linhas de células epiteliais gástricas foram caracterizados de acordo com suas taxas de crescimento de células diferentes, que foram maiores para os AGS e células SNU-1 e menor para o MKN45 e células GES-1 e utilizado neste estudo (arquivo adicionais 3: Figura S2A). Em comparação com as células MKN45, os AGS e células SNU-1 também elevados expressão ILK (arquivo adicionais 3: Figura S2B e S2C). Um shRNA baseado no lentivírus foi usada para silenciar ILK
geneticamente nas AGS, SNU-1, MKN45, e GES-1, células epiteliais gástricas (Figura 1b, painel superior), bem como em A549 e células de adenocarcinoma do pulmão humano H1975, HK-2 células renais proximais humanas epiteliais tubulares e THP-1 células monocíticas humanas (arquivo adicional 3: Figura S2D). Nestas células, o silenciamento de ILK significativamente (P
< 0,05) diminuiu o crescimento das células (Figura 1B; arquivo adicional 3: Figura S2E). Além disso, o tratamento de células com o inibidor de ILK T315 [36] de forma significativa (P
< 0,05) e dependente da dose, o crescimento das células retardado (Figura 1C) sem citotoxicidade (dados não apresentados). Além disso, diminuição da formação de colónias foi observada em células AGS silenciou-ILK (arquivo adicionais 3: Figura S2F). Assim, o silenciamento do gene (arquivo adicionais 3: Figura S2G) e métodos farmacológicos (arquivo adicionais 3: Figura S2H) para suprimir a actividade de ILK ou superexpressão levou à interrupção do ciclo celular no G 1 fase. Estes resultados mostram um papel de promoção do crescimento de ILK. A Figura 1 é necessária a expressão de ILK para o crescimento celular e a activação de NF-kB. (A) coloração imuno-histoquímica com base em fluorescência representativas mostra a co-expressão de ILK (verde
) e Ki-67 (
vermelho) em tumores gástricos humanos e nódulos AGS-derivados em ratinhos BALB /c. DAPI (azul e) foi utilizado para contracoloração nuclear. ILK + Ki-67 + células nas secções de tecido imunofluorescência manchadas são apresentados como ponto-parcelas de uma análise FACS-like usando software TissueQuest. As células foram calculados como a percentagem de células e o número do total de células (células + DAPI) por campo. (B) Western blot de expressão ILK em células transfectadas com shRNAs segmentação ILK (shILK
) ou um controle de luciferase (shLuc
). β-actina foi utilizado como um controlo interno. ensaio à base de WST-8 mostra a inibição do crescimento celular em células silenciados-ILK. (C) O efeito dependente da dose do inibidor de ILK T315 na inibição do crescimento das células AGS. (D) coloração imuno-histoquímica com base em fluorescência Representante mostra a co-expressão de ILK (verde
) e fosforilada NF-kB Ser536 (vermelho e) em tumores gástricos humanos e nódulos AGS-derivados em ratos. DAPI (azul e) foi utilizado para contracoloração nuclear. O ponto-parcelas mostrar a co-expressão de ILK e NF-kB Ser536. A análise de regressão (E) logística mostrou uma correlação entre ILK, fosforilada NF-kB Ser536 e Ki-67 em 93 espécimes testados com câncer gástrico. Os valores de P
R-quadrado (R Página 2
) e são mostrados. (F) EMSA demonstrando a activação de NF-kB. ensaio de repórter de (L) da luciferase mostra a relação entre a activação de NF-kB para controlar Renilla luciferase em células tratadas com o inibidor de NF-kB CABO (25 ug /mL). (H) O crescimento de células /AGS-tratados CAPE mL 25 ug. (I), a activação de NF-kB em células transfectadas ou shLuc--shILK. (J) a activação do NF-kB depois de 6 h de tratamento T315 em células AGS. Para o crescimento de células, a formação de colónias, e a actividade da luciferase, os dados são média ± SD de três experiências independentes. * P Art < 0,05, ** P Art < 0,01 e P *** Art < 0,001 comparado com o Dia 0 ou relativo controle. #P Art < 0,05, ## P Art < 0,01 e ### P
. ≪ 0,001 comparado com shLuc
Para caracterizar as características de crescimento celular regulada por ILK, NF- sinalização kB foi examinada por causa de ILK pode actuar a montante do NF-kB através da regulação IKKα [13]. Por imunocoloração, observou-se a co-expressão de ILK e fosforilada de NF-kB (Ser536) nos tecidos gástricos humanos e de ratinho (Figura 1D), e sua co-expressão significativamente (P
< 0,01) e positivamente correlacionada com o número de células em proliferação , que é indicado por 55 casos triple-positivos do total de 93 amostras de cancro gástrico (Figura 1E; arquivo adicional 4: Figura S3). A imunocoloração para a translocação nuclear de NF-kB (arquivo adicional 3: Figura S2I), a EMSA (Figura 1F), e o promotor de ensaios (Figura 1G) confirmou a activação constitutiva do NF-kB em células AGS, mas não nas células MKN45. Tratar as células com o inibidor de NF-kB CABO significativamente (P
< 0,001) reduziu a activação de NF-kB (Figura 1G) e crescimento celular (Figura 1H). Ou ILK silenciando (Figura 1I; arquivo adicionais 3: Figura S2J) ou tratamento T315 (Figura 1J) significativamente (P Art < 0,05) parou a atividade NF-kB. Estes resultados demonstraram que a ILK é indispensável para o crescimento celular nas linhas de células testadas, porque facilita a activação de NF-kB em cancros gástricos.
ILK regula a actividade do RAS, facilitando o complexo de IQGAP1-Ras activado para controlar-MAPK NF-kB
Como as células AGS abrigar PIK3CA Comprar e KRAS
mutações [37], examinamos possíveis efeitos reguladores de ILK na modulação da atividade de NF-kB por estes 2 cinases [38]. Utilizando um kit de matriz humana Phospho-MAPK, foram identificados 10 quinases que foram mais altamente expresso nas células AGS do que nas células MKN45. Estas quinases principalmente agiu jusante das vias de sinalização PI3K e MAPK (arquivo adicional 5: Figura S4A). Por transferência de Western, constatou-se um aumento da fosforilação de AKT, ERK1 /2, e IκBα acompanhado por degradação IκBα nas células AGS (Figura 2A). A inibição farmacológica da c-Raf, MEK1 /2, e PI3K significativamente (P <
; 0,05) o crescimento de células reduzidos (Figura 2B), IκBα fosforilação (Ser32) e degradação (Figura 2C), e a actividade de NF-kB ( Figura 2D), indicando que tanto PI3K- e Ras-activação de vias de sinalização facilitaram a activação de NF-kB. Os efeitos da ILK têm sido amplamente estudados por causa de suas interações com growth- celular e AKT NF-kB-associado [4], [9]. Surpreendentemente, ILK silenciamento não afetou AKT e fosforilação GSK-3β nas AGS e células SNU-1, mas marcadamente reduzida c-Raf e ERK1 /2 ativação em todas as células testadas (Figura 2E; arquivo adicionais 5: Figura S4B). Sem desactivação AKT, avaliou-se uma via alternativa para activar o NF-kB através de um mecanismo que envolve a MAPK /p90RSK /IκBα sinalização [38]. O knockdown de ILK
reduziu a fosforilação múltiplo de RSK (Thr573, Thr359 /Ser363 e Ser380) e fosforilação IκBα (Ser32) e aumentou a acumulação IκBα (Figura 2E). Inibindo MEK1 /2 causou efeitos semelhantes (arquivo adicionais 5: Figura S4C) e uma paragem do ciclo celular no G 1 fase (arquivo adicionais 5: Figura S4D). Um ensaio suspenso Ras revelou que a inibição de ILK causada Ras desactivação sem afectar a estabilidade da proteína Ras (Figura 2F). Estes achados demonstram um potencial via não-canônico para ILK para modular a NF-kB através da regulação de sinalização Ras /c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /IκBα. Figura 2 ILK-IQGAP1-Ras complexo sustenta a actividade do RAS para activar c-Raf /2 /ERK1 sinalização MEK1 //2 /RSK /IκBα /NF-kB. (A) Western blot das proteínas indicadas em células AGS e MKN45. β-actina foi utilizado como um controlo interno. AGS células tratadas com inibidor de c-Raf GW5074, MEK1 /2 ou inibidores U0126, PD98059 ou inibidor de PI3K LY294002 durante 48 h foram avaliados para o seu crescimento (B), a fosforilação de Ser32 a IκBα (pIκBα
) e proteína total (C ), e a activação de NF-kB (D). (E) Em shLuc- ou células transfectadas com shILK, Western blots mostram a expressão das proteínas indicadas. β-actina foi utilizado como um controlo interno. ensaio de activação (F) Ras mostrando atividade Ras e expressão de proteínas em células shLuc- e AGS transfectadas-shILK. (G) A coloração por fluorescência representativas à base de imuno-histoquímica mostra a co-expressão de ILK (
verde) e ERK1 /2 Tyr202 /Thr204 (vermelho e) em tumores gástricos humanos e nódulos AGS-derivados em ratinhos BALB /c. DAPI (azul e) foi utilizado para contracoloração nuclear. O ponto-parcelas mostrar a co-expressão das proteínas indicadas. Em células AGS IQGAP1 siRNA-transfectadas e de controlo às 48 h, a expressão das proteínas indicadas (H), foram mostradas a activação de NF-kB, e o crescimento celular (I). Os lisados ​​de proteína extraída a partir de células não tratadas AGS (J) ou com shLuc e transfecção shILK (L, M) foram imunoprecipitados (IP
) com IgG de controlo (IgG de C.
) ou com anticorpos contra a ILK, IQGAP1, e Ras . Imunotransfer�cias (IB
) mostram a expressão de ILK, IQGAP1, e Ras. (K) coloração imuno-histoquímica com base em fluorescência Representante mostrando a co-expressão de ILK (
verde), IQGAP1 (vermelho e) e Ras (vermelho e) nas células AGS. DAPI (azul e) foi utilizado para contracoloração nuclear. Para a proliferação e a actividade da luciferase, os dados são média ± SD de três experiências independentes. ** P
< 0,01 e *** P
< 0,001 comparado com o controlo. triângulo na vertical, o aumento da expressão; triângulo invertido, a diminuição da expressão de ILK pode modificar
2 activação /ERK1 sob o crescimento e diferenciação celular [22].; No entanto, a regulação molecular relacionada com a sinalização de Ras não tem sido documentado [2], [3]. A co-expressão de ILK e ERK1 /2 (Tyr202 /Thr204) foi demonstrada em humanos e tumores gástricos nódulos AGS-derivados em ratinhos BALB /c (Figura 2G). ILK interage com IQGAP1 [7], um tipo de GTPase-activating protein Ras que é diferente do GAP, que transforma a Ras no seu estado inactivo. Porque IQGAP1 controla a sinalização de Ras /MAPK, é oncogénica [39], [40]. A expressão de proteínas da família IQGAP manteve-se inalterada nos AGS e MKN45 células, mesmo após silenciamento ILK (arquivo adicionais 5: Figura S4E). No entanto, silenciando oncogênico IQGAP1, mas não IQGAP3, (arquivo adicionais 5: Figura S4F-S4H)-c Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /sinalização RSK (Figura 2H), atividade de NF-kB, e crescimento de células efetivamente inibida ( Figura 2I). Ao realizar um ensaio de coimmunoprecipitation, que demonstrou um potencial de ILK abrigar complexo, IQGAP1, e Ras (Figura 2J). Imunocoloração confirmou que ILK foi co-expressos em níveis semelhantes aos de IQGAP1 e Ras (Figura 2K; arquivo adicionais 6: Figura S5). Notavelmente, o silenciamento de ILK interrompido o complexo IQGAP1-Ras (Figura 2L e 2M). Estes resultados demonstraram que a ILK facilitou a formação do complexo Ras-IQGAP1 para sustentar a actividade do RAS.
ILK enzimática modula a formação de a /2-mediada crescimento celular IQGAP1-Ras complexo e ERK1
Os nossos resultados mostraram que a inibição farmacologicamente ILK diminuiu o crescimento das células, indicando que o papel essencial da actividade enzimática de ILK. Além disso inibição de ILK pela abordagem genética interrompido sinalização Ras IQGAP1-mediada. Inibição da actividade de ILK farmacologicamente com T315 (Figura 3A) ou através de transfecção geneticamente da laia mutante enzimática A262V [41] (Figura 3B) também interrompida a formação do complexo IQGAP1-Ras nas células AGS. Três regiões truncadas de ILK (Figura 3c) foram sobre-expressos em células MKN45 para identificar o domínio essencial para a manutenção do complexo IQGAP1-Ras. ensaios Coimmunoprecipitation demonstrou que ILK overexpressed constrói abrigar regiões de domínio quinase catalítico imunoprecipitadas com IQGAP1 e Ras (Figura 3D) PH e. Portanto, ILK única contendo domínio de cinase activada de ERK1 /2 (Figura 3E). Em comparação com a ILK de comprimento completo (ILK 1-452), a transfecção de ILK mutante de cinase morta A262V não activar ERK1 /2 (Figura 3F). Experiências adicionais demonstraram que apenas ILK contendo o domínio cinase aumentada MEK1 /2-regulado a activação de NF-kB (Figura 3G) seguido de MEK1 /2 e crescimento celular de NF-kB-regulada (Figura 3H) nas células MKN45. Estes resultados mostraram que a ILK enzimática mediada por a formação do complexo Ras-IQGAP1 para desencadear ERK1 /2 e crescimento celular de NF-kB mediada. Figura 3 imposta expressão de ILK facilita o crescimento celular através da indução de activação de ERK1 /2 /NF-kB. Os lisados ​​de proteína extraída a partir de células tratadas com AGS T315 (A) ou transfectadas com Myc-DDK-tagged ILKA262V mutante (B) foram imunoprecipitados (IP
) com anticorpos contra ILK. Imunotransfer�cias (IB
) mostram a expressão de ILK, IQGAP1, e Ras. Plasmídeos baseados em pcDNA3.1-Flag-ILK contendo full-length ILK (ILK
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