In integrinų susietų kinazės padidėjimas ne bažnytinės teisės suteikia NF-κB tarpininkaujant augimo privalumus skrandžio vėžio ląstelių aktyvuojant ERK1 /2

In padidėjimas integrino susietų kinazės ne bažnytinės teisės suteikia NF-κB tarpininkaujant augimo privalumus skrandžio vėžio ląstelių aktyvuojant ERK1 /2
Anotacija
faktai
padidėjęs aktyvumas ar išraišką integrinų susietų kinazės (ILK) , kuris reguliuoja ląstelių sukibimą, migraciją ir proliferaciją, veda į onkogenezėje. Mes identifikuoti molekulinį pagrindą Pieno reguliavimo ir jo alternatyvų vaidmenį suteikiant ERK1 /2 /NF-κB tarpininkaujant augimo privalumus skrandžio vėžio ląsteles.
Rezultatai
slopina Ilk su trumpa segtukas RNR arba T315, spėjamas Ilk inhibitorius, panaikino NF-κB tarpininkaujant su žmogaus skrandžio vėžio ląstelių AGS augimą, SNU-1, MKN45 ir GES-1. Ilk skatino Ras aktyvumą aktyvuoti C-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /ribosomos S6 kinazės /inhibitorius κBα /NF-κB signalizacijos palengvinant IQ susidarymo motyvas, kurių sudėtyje yra GTPase įsijungiantis baltymas 1 (IQGAP1) - Rasa sudėtinga. Priverstinis fermentinis Ilk išraiška skatina ląstelių augimą, palengvinant ERK1 /2 /NF-κB signalizacijos. PI3K aktyvavimo arba sumažėjo PTEN išraiška ilgai ERK1 /2 aktyvacija apsaugoti Pieno nuo proteasomos tarpininkaujant degradacija. C-galas šilumos šokas Giminaitis 70 sąveikaujančių baltymų, An HSP90 susijęs E3 ubikvitino ligaze tarpininkaujant ILK ubiquitination kontroliuoti PI3K- ir HSP90 reglamentuotas Pieno stabilizavimo ir signalizacijos. Be to, ląstelių augimo, identifikuojamos kelias skatinamas ląstelių migraciją ir sumažino skrandžio vėžio ląstelių jautrumą į priešvėžinių agentų 5-fluorouracilo ir cisplatina. Be to, egzogeninė administravimas EGF taip pat padidėjusi EGFR sukėlė ILK- ir IQGAP1 reguliuojama ERK1 /2 /NF-κB aktyvacijos ląstelių augimą ir migracija.
Išvada
in Pieno padidinti ne bažnytinės teisės skatina ERK1 /2 /NF-κB aktyvavimo ir veda prie skrandžio vėžio ląstelių augimą.
raktažodžiai
ilk ląstelių augimas IQGAP1 ERK1 /2 NK κB Fono
integrino susietų kinazės (Pieno), 59-kDa serino /treonino kinazės, tiesiogiai sąveikauja su citoplazmos domeno β1 integrino [1]. Ilk apima tris sritis: N-terminalas ankyrin (ANK) pasikartoja, centrinis pleckstrin homologija (pH) -kaip domeno, o kinazės domeno, C-terminalas [2], [3]. Integrino tarpininkaujant ląstelių tarpląsteliniame (ECM) sukibimo arba augimo faktoriai aktyvuoti fosfatidil 3-kinazės (PI3K) fosforilinti membranos jungiasi PI 4,5-bifosfato (PIP2) ir generuoti PI 3,4,5-trifosfatas (PIP3) , kuris jungiasi prie pH-kaip domeno ilk ir aktyvuoja ilk [4], [5]. Po ILK aktyvavimo, C-galinio kinazės domeno Pieno gali prisijungti prie įvairių baltymų, įskaitant AKT, affixin, beta-Parvin, glikogeno sintezės kinazės (GSK) -3β, calponin homologijos turinčių ILK surišančio baltymo, 20-kDa reguliavimo šviesos grandinės myosin (LC20), tuo Miozinas nukreipimą subvieneto Miozinas šviesos grandinės fosfatazės (MYPT1), paxillin, alfa-NAC, bei baltymų fosfatazės inhibitoriai PHI-1, kepi, o CPI-17 [2], [3] , [6], [7]. N-terminalų ANK kartojasi tarpininkauti Pieno su ILKAP, baltymas fosfatazės 2C šeimos nariui, ir Kraštutiniu atveju, kaip LIM tik domeno adapteris baltymų sąveiką. Ilk gali būti laikomas PIP3-bendrauja baltymų pasroviui PI3K; jos poveikis yra užblokuotas fosfatazės ir angiotenziną homologas ištrintas chromosomos 10 (PTEN) [8], [9]. PTEN slopina navikų dephosphorylating PIP3 [10], [11] Ilk
vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant įvairius ląstelių procesus, įskaitant platinimo, išlikimą, migracijos, ląstelės ciklo progresavimo ir angiogenezę.; padidėjęs aktyvumas ar išraiška Pieno veda į onkogenezėje [2], [3]. Be moduliuoti savo partneres baltymus koriniams procesus, Ilk yra hipotezę reikia įsitraukti į ląstelėje signalo perdavimas tinklu. Mechaniškai, Ilk tiesiogiai fosforilina AKT apie Ser473 ir GSK-3β apie Ser9 [4], [9] tarpininkauti β-kateninai perkėlimas ir reguliuoti AP-1 išraiška naviko ląstelių proliferaciją [12]. NF-κB aktyvinimas yra labai svarbus Pieno tarpininkaujant onkogeniniam procesų, pavyzdžiui, kovos su apoptozės veiklos [13], išgyvenimo skatinimo [14], epitelio-mezenchiminių perėjimo [15], ląstelių pratęsimo ir atsparumo apoptozės [16], angiogenezę [17 ], ir migracija, invazijos, ir metastazių [18] - [20]. Be to, NF-κB aktyvacijos reikalingas kanoninis reguliavimo IKKα ir IKKß kurį Ilk /AKT kelyje. Sukelti ląstelių migraciją, Ilk galite aktyvuoti mažą GTPases RPT ir CDC42 [21]. Be to, Ilk reguliuoja ERK1 /2 aktyvinimo myogenic diferenciacijos [22]. Padidėjęs išraišką MicroRNA-143 ir MicroRNA-145, kurie gaudo Pieno slopina AKT ir ERK1 /2 keliai [23]. Tačiau molekulinės mechanizmo, lemiančio Ilk tarpininkaujant ERK1 /2 aktyvavimo lieka nežinoma.
Ląstelių stimuliacija pagal augimo faktoriais ir citokinais, taip pat ląstelių sąveikos su ECM padidėjimas ILK veiklos [24]. Be to, molekulinės reguliavimo PI3K /PTEN pagal ilk, Aoyagi ir kt. identifikuoti Ilk kaip nauja šilumos šoko baltymas (HSP) 90 klientų baltymų ir nustatė, kad farmakologiškai slopina HSP90 lėmė ILK nykimo proteasomos priklausomu būdu [25]. Be to, HSP90 susijęs E3 Ubikvitino ligazės, C-galas šilumos smūgio giminingi 70 sąveikaujant baltymo (CHIP) sukelia Pieno degradaciją [26]. Hashiramoto ir kt. parodė, kad HSP90 stabilizavosi Pieno ir ilgalaikis AKT ir ERK1 /2 aktyvavimo [16]. Taigi, mes spėlioti ryšį tarp ILK stabilumo ir jos paskesnių kinazės aktyvinimo. Ras /MAPK kelias signalizacijos yra būtinas Tumorigenesis [27]. Padidėjęs Ilk išraiška yra susijęs su aukštos kokybės skrandžio vėžio [28], prostatos vėžio [29], ir nesmulkiųjų ląstelių plaučių vėžiu [30], nors ląstelių šių vėžio dažniausiai uosto Ras mutacijas [31] - [33]. Nukreipimas Pieno su siRNA sumažėja skrandžio vėžio ląstelių invaziją, platinimu ir augimą nežinoma mechanizmą [34]. Dėl galimybės, kad Ilk veikia prieš srovę nuo NF-κB reguliuojant IKKα [13], kuris buvo susijęs skrandžio Tumorigenesis [35], Ilk spėliojo aktyvuoti ląstelių augimą per NF-κB-reguliuojamoje keliu. Naudojant skrandžio vėžio ląsteles (MAA, MKN45 ir SNU-1), mes studijavo molekulinę reguliavimą Pieno ir nustatė nekanoninį kelią iš ILK reguliuojama ERK1 /2 aktyvavimo NF-κB sąlygojamą skrandžio vėžio ląstelių augimą, migracijos, ir išlikimo skatinimas.
rezultatai
ilk veikla ir išraiška yra būtini NF-κB sąlygojamą ląstelių augimą pervežimas padidėjęs aktyvumas ar išraiškos Pieno pagerina tumorigenezei skatinant ląstelių [6] augimą. RNRi pagrindu Ilk triukšmo slopinimo slopina skrandžio vėžio ląstelių augimą [34], kadangi Ilk raiška yra susijusi su skrandžio Tumorigenesis [28]. Žmogaus skrandžio navikų ir AGS gautas mazgelių BALB /c pelių, Ki-67-teigiamas plinta ląstelių persipynusių Pieno Kaip rodo fluorescencijos pagrindu imunodažymu (1a paveikslas), o AEC-paremtą imunodažymu (papildomas failą 1: papildoma medžiaga ir metodai; Papildoma failą 2: S1 paveiksle) eksperimentai. Ištirti galimą mechanizmus, sukeliančius Pieno tarpininkaujant skrandžio vėžio ląstelių augimą, keletą skrandžio epitelio ląstelių linijos buvo apibūdinta pagal jų skirtingų ląstelių augimo tempai, kurie buvo didesni už AGS ir SNU-1 ląstelių ir mažesnis už MKN45 ir GES-1 ląstelių ir naudojami šiame tyrime (Papildoma failų 3: S2A pav). Palyginti su MKN45 ląstelių, AGS ir SNU-1 ląstelių, taip pat buvo padidėjusi Pieno išraišką (papildomas failą 3: S2B ir S2C pav). Lentiviruso pagrindu shRNR buvo naudojamas nutildyti ilk
genetiškai į AGS, SNU-1, MKN45, ir GES-1 skrandžio epitelinės ląstelės (1b paveikslas, viršutinis panelis), taip pat kaip ir A549 ir ​​H1975 žmogaus plaučių adenokarcinomos ląstelių, HK 2 žmogaus inkstų proksimaliniai kanalėlių epitelio ląstelės, ir THP-1 žmogaus monocitine ląstelių (Papildoma failų 3: S2D pav). Šių ląstelių, Ilk žymiai slopinimo (p
< 0,05) sumažėjo ląstelių augimą (1B pav; Papildoma failą 3: S2E pav.) Be to, gydant Ląstelės su ILK inhibitoriaus T315 [36] gerokai (P
< 0,05) ir priklausomai nuo dozės uždelsto veikimo ląstelių augimas (1c pav) be citotoksiškumo (duomenys neparodyta). Be to, sumažėjo kolonija formavimas buvo pastebėtas Pieno-nutildė AGS ląstelių (papildomas bylos 3: S2F pav.) Taigi, genai yra nuslopinami (Papildoma failą 3: S2G paveikslas) ir farmakologiniai metodai (Papildoma failą 3: S2H paveikslas) slopinti Pieno veiklą ar raiška atvedė į ląstelės ciklo suėmimo prie G 1 etapas. Šie rezultatai rodo augimą skatinantį vaidmenį Pieno. 1 pav Ilk išraiška yra būtinas ląstelių augimui ir NF-κB aktyvacijos. (A), atstovas fluorescencija pagrindu imunohistocheminį dažymo rodo Pieno (žalia pervežimas) ir Ki-67 (raudona
) žmogaus skrandžio navikų ir AGS-gautų mazgelių BALB /c pelių coexpression. DAPI (mėlyna
) buvo naudojamas branduoliniams counterstaining. Ilk + Ki-67 + ląstelių immunofluorescently tamsintas audinių skyriuose pateikiami kaip DOT-sklypus tam FACS-kaip analizės, naudojant TissueQuest programinę įrangą. Ląstelės buvo apskaičiuota kaip procentinė dalis ir ląstelių skaičiaus visų ląstelių (DAPI + ląstelių) vienam srityje. (B), Vakarų dėmė iš ILK išraiškos ląstelėse transfektuotose shRNAs skirtomis Pieno (shILK
) arba kontrolės liuciferazė (shLuc
). β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. WST-8 pagrįstas tyrimas rodo ląstelių augimą inhibicija Pieno-nutildė ląsteles. (C) priklauso nuo dozės poveikis Ilk inhibitoriaus T315 dėl AGS ląstelių augimo slopinimui. (D) atstovas fluorescencija pagrindu imunohistocheminį dažymo rodo Pieno coexpression (žalia
) ir fosforilinto NF-κB Ser536 (raudona
) į žmogaus skrandžio navikų ir AGS-gautų mazgelių pelėmis. DAPI (mėlyna
) buvo naudojamas branduoliniams counterstaining. DOT-sklypai parodyti Pieno ir NF-κB Ser536 coexpression. (E), logistinės regresijos analizė parodė ryšį tarp Pieno, fosforilinto NF-κB Ser536 ir Ki-67 93 išbandytų skrandžio vėžio egzempliorių. R-kvadratu (R
2
) ir p
vertės parodyta. (F), EJSA parodyti NF-κB aktyvacijos. (G) liuciferazės reporterio testą rodo aktyvinimo santykis NF-κB kontroliuoti Renilla liuciferazės ląstelėse, gydytiems su NF-κB inhibitoriaus CAPE (iki 25 mikrogramų /ml). (H) augimas 25 mikrogramai /ml ŽALIASIS gydytų AGS ląsteles. (I) formulės NF-κB aktyvavimo shLuc- arba shILK transfekuotos ląstelės. (J) NF-κB aktyvavimo po 6 h nuo T315 gydymo AGS ląsteles. Ląstelių augimą, kolonijos formavimo ir liuciferazės veiklos duomenys, vidurkis ± SN iš trijų nepriklausomų eksperimentų. * P
< 0,05, ** p
< 0,01, ir *** P
< 0,001 palyginti su 0 dieną arba santykinio kontrolės. #P
≪ 0,05, ## P,
< 0,01, o ### p
. ≪ 0,001, lyginant su shLuc
Apibūdinti ILK reguliuojama ląstelių augimą funkcijas, NF- κB signalizacijos buvo nagrinėjama, nes Ilk gali veikti Upstream NF-κB reguliuojant IKKα [13]. Iki imunodažymu, kad Pieno ir fosforilinarai NF-κB (Ser536) coexpression buvo pastebėtas žmogaus ir pelės skrandžio audinių (1d pav), ir žymiai jų coexpression (p
< 0,01) ir teigiamai koreliuoja su proliferuojančias ląstelių skaičiaus , kuri yra nurodyta 55 trijų teigiamų atvejų viso 93 skrandžio vėžiu egzempliorių (1E, skaičių; Papildoma failų 4: S3 pav). Imunodažymu už NF-κB branduolinės perkėlimas (papildomas bylos 3: S2I pav), EMSA (1F paveikslą), ir propaguotojas tyrimai (1G pav) patvirtino steigiamasis aktyvavimo NF-κB į AGS ląstelių, bet ne į MKN45 ląsteles. Gydymas ląsteles su NF-κB inhibitorių CAPE žymiai (p
< 0,001) sumažino NF-κB aktyvavimo (pav 1G) ir ląstelių augimo (1H pav.) Bet Ilk slopinimo (1I pav; Papildoma failą 3: S2J paveikslas) arba T315 gydymas (1J paveikslas) žymiai (p
< 0,05) sustojo NF-κB veikla. Šie rezultatai parodė, kad Ilk yra būtinas ląstelių augimui ląstelių linijų išbandyti, nes tai palengvina NF-κB aktyvacijos skrandžio vėžio.
Ilk reguliuoja Ras aktyvumą palengvinti IQGAP1-RAS kompleksą kontroliuoti MAPK aktyvuota NF-κB
Kadangi AGS ląstelės uosto PIK3CA parsisiųsti ir kras
mutacijas [37], mes išnagrinėjo galimus teisinio reguliavimo poveikio Pieno dėl NF-κB veiklos moduliavimo pagal šių 2 kinazės [38]. Naudojant Žmogaus Phospho-MAPK Array Kit, mes nustatė 10 kinazes, kurie buvo labiau išreikštas AGS ląstelių nei MKN45 ląsteles. Šie kinazės daugiausia veikė pasroviui iš PI3K ir MAPK signalizacijos keliuose (Papildoma failų 5: S4A pav). Iki Imunoblotingo, mes patvirtino padidintą fosforilinimo AKT, ERK1 /2, ir IκBα kartu IκBα nykimo AGS ląstelių (2A pav.) Farmakologinis slopinimas c-Raf, MEK1 /2 ir PI3K reikšmingai (p
< 0,05) sumažino ląstelių augimą (2B pav), IκBα fosforilinimas (Ser32) ir degradacija (2C paveikslą), ir NF-κB veikla ( 2D paveikslas) rodo, kad tiek PI3K- ir RAS-aktyvavimo signalo perdavimo kelių palengvino NF-κB aktyvacijos. Dėl Pieno poveikis buvo plačiai tiriamas dėl savo sąveikos su ląstelių augimą ir NF-κB sukelto AKT [4], [9]. Keista, Ilk triukšmo slopinimo nepaveikė AKT ir GSK-3β fosforilinimo AGS ir SNU-1 ląstelių, tačiau žymiai sumažino c-Raf ir ERK1 /2 aktyvinimo visų tirtų ląstelių (2e, skaičių; Papildoma failą 5: S4b pav). Be AKT deaktyvuotas, mes įvertintas alternatyvų kelią aktyvinimo NF-κB per mechanizmą įtraukiant MAPK /p90RSK /IκBα signalizacijos [38]. Iš ILK
nokdaunas sumažino kelis fosforilinimo RSK (Thr573, Thr359 /Ser363 ir Ser380) ir IκBα fosforilinimo (Ser32) ir padidėjo IκBα kaupimosi (2e pav). Slopina MEK1 /2 sukėlė panašų poveikį (Papildoma failą 5: Pav S4C) ir ląstelės ciklo suėmimas tuo G 1 etapas (Papildoma failą 5: S4D pav). RAS išskleidžiamasis tyrimas atskleidė, kad slopina Ilk sukėlė Ras išjungimo nepaveikiant Ras baltymo (2F paveikslas) stabilumą. Šie rezultatai parodė galimą nekanoninį būdas: Pieno moduliuoti NF-κB reguliuojant Ras /C-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /IκBα signalizacijos. 2 pav Ilk-IQGAP1-RAS kompleksas palaiko Ras aktyvumą aktyvuoti c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /RSK /IκBα /NF-κB signalizacijos. (A), Western blot iš asmenų, nurodytų baltymų AGS ir MKN45 ląstelių. β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. AGS ląstelės gydomi C-Raf inhibitorių GW5074, MEK1 /2 inhibitoriai U0126 ar PD98059 arba PI3K inhibitorių LY294002 48 h buvo vertinami pagal jų augimo (B) fosforilinimas IκBα ne Ser32 (pIκBα pervežimas) ir bendro baltymo (C ), ir NF-κB aktyvavimo (D). (E) Jei shLuc- ar shILK-perkeltų ląstelių, Vakarų dėmės rodo nurodytų baltymų ekspresiją. β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. (F), Rasa aktyvacijos tyrimas rodo Ras aktyvumą ir baltymų raišką shLuc- ir shILK-perkeltų AGS ląsteles. (G) atstovas fluorescencijos pagrindu imunohistocheminis dažymas rodantį ILK (žalia
) coexpression ir fosforilinto ERK1 /2 Tyr202 /Thr204 (raudona
) į žmogaus skrandžio navikų ir AGS-gautų mazgelių BALB /c pelių. DAPI (mėlyna
) buvo naudojamas branduoliniams counterstaining. DOT-sklypai parodyti nurodytų baltymų coexpression. Kontroliuoti ir IQGAP1 siRNR-perkeltų AGS ląsteles 48 h, nurodytų baltymų (H) išraiška, buvo parodyta NF-κB aktyvavimo, ir ląstelių augimo (I dalis). Baltymų fragmentai paimti iš neapdorotų AGS ląstelių (J) arba su shLuc ir shILK transfekciją (L, M) buvo immunoprecipitated (IP pervežimas) su kontroline IgG (C. IgG pervežimas) arba antikūnų ILK, IQGAP1, ir Ras , Immunoblots (IB
) parodyti ILK, IQGAP1 ir Ras išraiška. (K) atstovas fluorescencijos pagrindu imunohistocheminis dažymas rodantį ILK (žalia
) coexpression, IQGAP1 (raudona
) ir Rasa (raudona
) į AGS ląsteles. DAPI (mėlyna
) buvo naudojamas branduoliniams counterstaining. Dėl platinimu ir liuciferazės veiklos duomenys, vidurkis ± SN iš trijų nepriklausomų eksperimentų. ** P
< 0,01 ir *** P
< 0,001, lyginant su kontrole. Vertikalūs trikampis, padidėjo išraiška; apverstas trikampis, sumažėjo išraiška
Pieno gali keisti ERK1 /2 aktyvavimo pagal ląstelių augimui ir diferenciacijai [22]. "; Tačiau, molekulinė reguliavimas susijęs su Ras signalizacijos nebuvo dokumentais [2], [3]. Iš Pieno ir fosforilinto ERK1 /2 (Tyr202 /Thr204) coexpression buvo įrodytas žmogaus skrandžio navikų ir AGS-kilęs mazgelių BALB /c pelių (2G pav). Ilk sąveikauja su IQGAP1 [7], RAS GTPase įsijungiantis-kaip baltymo, kuris yra nepanašios iš GAP, kuris transformuoja Ras savo neplinta. Kadangi IQGAP1 kontroliuoja Ras /MAPK signalizacijos, tai onkogeninė [39], [40]. Iš IQGAP šeimos baltymų ekspresija buvo nepakitęs AGS ir MKN45 ląsteles, net po ILK nuslopinami (Papildoma failo 5: S4E pav). Tačiau nutildyti onkogeninio IQGAP1, bet ne IQGAP3 (Papildoma failą 5: Pav S4F-S4H) veiksmingai slopina C-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /RSK signalizacijos (2H paveikslas), NF-κB veikla ir ląstelių augimą ( pav 2i). Atliekant coimmunoprecipitation testą, mes parodė galimą sudėtingą slėpimas Pieno, IQGAP1 ir anksčiau (2J pav.) Imunodažymu patvirtino, kad Ilk buvo persipynusių lygis panašios į IQGAP1 ir Ras (2k pav; Papildoma failą 6: S5 pav.) Pažymėtina, kad triukšmo slopinimo Ilk sutrikdė IQGAP1-Ras kompleksą (2L ir 2M pav.) Šie rezultatai parodė, kad Ilk palengvino IQGAP1-Ras komplekso susidarymą išlaikyti Ras aktyvumą.
Fermentinis Ilk moduliuoja į IQGAP1-RAS sudėtingą ir ERK1 /2-tarpininkaujant ląstelių augimą
Mūsų rezultatai parodė, kad farmakologiškai slopina susidarymą ilk sumažėjo ląstelių augimą, nurodant, kokius esminius vaidmenį fermentinį aktyvumą Pieno. Daugiau slopina Ilk genetinio metodo sutrikdė IQGAP1-tarpininkaujant Ras signalizacijos. Slopina Pieno veiklą farmakologiškai su T315 (3a paveikslas) ar genetiškai iki transfekuoja fermentinį mutantas Pieno A262V [41] (3B pav), taip pat sutrikdė iš IQGAP1-Ras komplekso AGS ląstelių susidarymą. Trys elektroniniai regionai Pieno (Fig.3C) buvo ekspresija per MKN45 ląstelių nustatyti domeną svarbiems palaikant IQGAP1-Ras kompleksą. Coimmunoprecipitation tyrimai parodė, kad ekspresija Ilk konstruoja slėpimas PH ir katalizinio kinazės domeno regionus immunoprecipitated su IQGAP1 ir anksčiau (3D pav.) Todėl tik kinazės domeno, kuriame yra Ilk aktyvuota ERK1 /2 (3e paveikslą). Palyginti su pilnametražis Pieno (Ilk 1-452), transfekuojant kinazės miręs mutantas Pieno A262V nebuvo aktyvuoti ERK1 /2 (3f paveikslą). Papildomos eksperimentai parodė, kad tik kinazės domeno, kuriame yra Ilk padidėjo MEK1 /2-reguliuojamas NF-κB aktyvinimas (3G pav), po MEK1 /2- ir NF-κB reguliuojama ląstelių augimo (3H paveikslą) MKN45 ląsteles. Šie rezultatai parodė, kad fermentinis Ilk tarpininkaujant, kad IQGAP1-Ras kompleksų susidarymo, kad sukeltų ERK1 /2- ir NF-κB-sukelto ląstelių augimą. 3 pav prievartinio Ilk išraiška palengvina ląstelių augimą skatinančius ERK1 /2 /NF-κB aktyvacijos. Baltymų fragmentai paimti iš AGS ląstelių gydomiems T315 (A) arba transfektuotose Myc-DDK-Tagged mutantas ILKA262V (B) buvo immunoprecipitated (IP
) su antikūnų Pieno. Immunoblots (IB
) parodyti ILK, IQGAP1 ir Ras išraiška. Plazmidės remiantis pcDNA3.1-vėliava Pieno sudėtyje yra pilnametražis Pieno (Pieno
1
-452
), fragmentas 171-452 (Pieno
171
-452
) , fragmentas 1-170 (Pieno
1
-170
) (c) punktą arba Myc-DDK-Tagged mutantas ILKA262V buvo pernešta į MKN45 ląsteles. (D), Coimmunoprecipitation vėliava su nurodytais baltymais rodomas naudojant Imunoblotingo. Palyginti su pcDNA3.1 vėliavą (vėliavos pervežimas) tik Vakarų dėmės rodo fosforilinto ERK1 /2 išraiška Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (E, F). β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. NF-κB aktyvavimo (G) ir ląstelių augimo (O) Taip pat buvo aptikta nesant ar buvimas PD98059 ir Žaliojo. Duomenys vidurkis ± SN iš trijų nepriklausomų eksperimentų. ** P
< 0,01, palyginti su kontrolės. ## P,
< 0,01, lyginant su ILK1-452. Vertikalūs trikampis, padidėjo išraiška.
PI3K aktyvacijos sumažėjo PTEN išraiška palengvinti ERK1 /2 /NF-κB aktyvacija stabilizuoti Pieno
Kadangi Ilk priklauso nuo PI3K tarpininkaujant PIP3 kartos savo aktyvacijos [4], augimas factor- ir integrino tarpininkaujant PI3K aktyvavimo arba PI3K mutacija AGS ląstelių [37] galėtų prisidėti prie Pieno išraišką ir aktyvacijos. Palyginti su MKN45 ląstelių augimą, AGS ląstelių augimas buvo nepaveikė [42] padidėjusi IL-6 lygių, bei β1 ir β3 integrinų išraiškos nepadidėjo (Papildoma failų 7: S6 pav). Mes taip pat patvirtino, kad PIP3 karta buvo didesnis PI3K-mutavo AGS ląstelių (4A pav.) Ištirti skirtumus tarp PI3K, Pieno ir Ras signalizacijos būdus santykius, AGS ląstelės buvo gydomi MEK1 /2 PI3K, Ilk, arba Rasa inhibitoriumi trukmė skiriasi. Šiuo 6 h po gydymo, T315 šiek tiek slopino MEK1 /2 ir ERK1 /2 fosforilinimas (papildomas failą 8: S7 pav). 24 h po gydymo, PI3K slopinimo sutrinka Ilk išraiška, kuri buvo po MEK1 /2 /ERK1 /2 išjungimas 24 h po gydymo (4B paveiksle). Tačiau Rasa slopinimas nebuvo išjungti AKT ar Pieno į AGS ląstelių, nors Ras gali tarpininkauti PI3K aktyvacijos [27]. Panašus į Pieno-nutildė AGS ląstelių, tiek MKN45 ir LY294002 stimuliuojama AGS ląstelės buvo mažiau Ras aktyvumo (4C pav.) Vertimo inhibitorius cikloheksimidas palengvino LY294002 sukeltos Ilk downregulation (4D pav) ir proteosomos inhibitorius MG132 atstatomi minėtą poveikį ir ERK1 /2 nukenksminimą (4e pav). Navikas slopintuvas fosfatazės PTEN neigiamai reguliuoja PI3K /PDK1 /AKT signalizacijos [10], [11], ir Pieno veiklą [8], [9], o AGS ląstelės eksponuojami mažą raišką PTEN (2a pav) [43]. Priverstinis išraiška PTEN į AGS ląstelių ne tik ardo tą steigiamasis fosforilinimo PDK1, AKT ir PAK1 bet ir slopina Pieno išraišką, ERK1 /2 fosforilinimo (4F paveikslą), ir NF-κB aktyvacijos (4G pav.) Šie rezultatai parodė, kad PI3K aktyvacijos sumažėjo PTEN išraiška stabilizuoti Pieno reguliuoti ERK1 /2 /NF-κB aktyvacijos. 4 pav PI3K aktyvacijos sumažėjo PTEN išraiška palengvinti ERK1 /2 /NF-κB aktyvavimo per ILK stabilizavimo. (A) PIP3 masė ELISA rinkinys buvo naudojamas nustatyti PI3K veiklą matuojant PIP3 išgaunama nuo neapdorotų AGS ir MKN45 ląstelių ir iš AGS ląstelių, gydytų LY294002 24 h. (B) AGS ląstelės buvo gydomi PD98059, LY294002, T315, arba Rasa inhibitoriais FTI-277 už nurodyto laiko. Vakarų dėmės rodo nurodytų baltymų ekspresiją. β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. (C), Rasa veikla buvo aptikta AGS, MKN45 ir LY294002 gydytų AGS ląstelių po 24 h. Vakarų dėmės rodo nurodytų baltymų AGS ląstelių gydytiems su vertimu inhibitorius cikloheksimidas (chx
) (D) arba proteosomos inhibitorių MG132 (e) 0,5 h ir tada gydomiems LY294002 24 val išraiška. PTEN buvo ekspresija į AGS ląstelių naudojant pcDNA3.1-GFP-PTEN (PTEN
). Vakarų dėmės rodo nurodytų baltymų, lyginant su pcDNA3.1-GFP (Vektorius
) transfekciją (F) išraišką, taip pat buvo nustatyta, NF-κB aktyvavimo (G). Dėl kinazės ir liuciferazės veiklos duomenys, vidurkis ± SN iš trijų nepriklausomų eksperimentų. * P
< 0,05, ** p
< 0,01, ir *** P
< 0,001, palyginti su kontrolės. Vertikalūs trikampis, padidėjo išraiška; apverstas trikampis, sumažėjo išraiška.
HSP90 susijęs E3 ligazės CHIP neigiamai kontroliuoja Ilk stabilizavimas, ERK1 /2 /NF-κB aktyvavimo, ir ląstelių augimo
, toliau tikrinant mechanizmo, lemiančio Pieno destabilizacija, mūsų rezultatai parodė, kad AKT slopinimas neturėjo įtakos Pieno stabilumą, o PI3K slopinimo įtakos iLK stabilumo (papildomas failo 9: S8 pav). HSP90 buvo šalia ištirti, nes jis gali sukelti Pieno degradaciją [25]. Panašus į PI3K slopinimo, shRNR pagrindu (5A pav) arba farmakologinio slopinimo hsp90 rezultatų (Papildoma failas 10: S9A pav) atidėtas ne tik PDK1 /AKT fosforilinimą bet taip pat c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 aktyvavimo po to, kai Ilk degradacija. Be to, genetiškai ar farmakologiškai slopina Hsp90 veikiant 17-AAG arba HDAC inhibitorių Saha, kuris sulaiko hsp90 į acetilintuose, fermentais neaktyvios būsenos, susilpnintas NF-κB veikla (5B, skaičių; Papildoma failo 10: S9B pav) ir ląstelių augimo ( 5C pav.) Cotreatment su MG132 išgelbėjo 17-AAG (5d pav) ir SAHA poveikį ILK degradacijos ir ERK1 /2 nukenksminti (papildomas failas 10: S9C pav.) Per MKN45 ląstelių, gydymas MG132 padidėjo Pieno išraišką, MEK1 /2 ir ERK1 /2 fosforilinimas (papildomas failą 11: Pav S10), ir NF-κB aktyvavimo (duomenys neparodyti). Coimmunoprecipitation parodė, kad HSP90-ILK komplekso formavimą (duomenys neparodyti). Naudojant lentiviruso pagrindu shRNR požiūrį (5e paveikslą), HSP90-susijusios E3 ligases, įskaitant lustas, Cullin 4A, ir Cullin 4B [26], [44], [45], buvo išnagrinėti savo vaidmenis ILK degradacija. Rezultatai parodė, kad tik triukšmo slopinimo CHIP išgelbėjo Pieno degradaciją ir ERK1 /2 nukenksminimą (5F paveikslą), NF-κB išjungimo (5G paveikslas) ir ląstelių augimo slopinimą (5H pav) po farmakologinio slopinimu PI3K ir hsp90. CHIP reikėjo ILK ubiquitination į LY294002 gydytų AGS ląstelių (5I pav). Šie rezultatai parodė, kad HSP90 /CHIP signalizacijos reguliuoja PI3K tarpininkaujant Pieno stabilizavimo ir Pieno reguliuojama ERK1 /2 /NF-κB aktyvavimo ir taip palengvina ląstelių augimą. 5 pav CHIP nustato Pieno destabilizacija, ERK1 /2 /NF-κB inaktyvacijai ir ląstelių augimo slopinimas po PI3K /HSP90 nukenksminimą. AGS ląstelės buvo transfekuota su shLuc arba shHSP90 arba iš dalies išvalytos su hsp90 inhibitoriaus 17-AAG (0,1 mikronų) už 48 h. Vakarų dėmės rodo, kad nurodyti baltymų (A) išraiška, ir NF-κB aktyvavimo (B) ir ląstelių augimas (C) taip pat buvo nustatyti. (D), MG132 išankstinio apdorojimo (0,5 val) atstatomi Pieno išraišką ir fosforilinto ERK1 /2 ne Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) 17-AAG gydytų AGS ląsteles. (E), lustas, Cullin 4A, ir Cullin 4B nutilo ir AGS ląstelėse shRNAs. shRNR-transfekuotos ląstelės buvo gydomi LY294002 arba 17-AAG 24 h. Imunoblotingu parodė, kad ilk ir fosforilinto ERK1 /2 išraiška Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (F), ir NF-κB aktyvavimo (G) ir ląstelių augimas (H) taip pat buvo nustatyti. (I) shLuc- ir shCHIP-perkeltų AGS ląstelių gydomiems LY294002, Ilk buvo immunoprecipitated ir jos ubiquitylation buvo tyrinėjo. Vakarų blot analizė, β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Dėl liuciferazės veiklą ir ląstelių augimo duomenys, vidurkis ± SN iš trijų nepriklausomų eksperimentų. ** P
< 0,01 ir *** P
< 0,001, lyginant su kontrole. ## P,
< 0,01 ir ### P,
< 0,001, lyginant su shLuc ar DMSO. NS: nėra reikšminga. Vertikalūs trikampis, padidėjo išraiška; apverstas trikampis, sumažėjo išraiška.
PI3K /HSP90 /CHIP /Ilk /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-κB signalizacijos prisideda prie ląstelių migraciją ir jautrumas 5-FU ir cisplatinos
Padidėjęs Pieno veiklą arba išraiška gali reguliuoti onkogeninė procesus, įskaitant ląstelių proliferaciją, migracijos, ir išlikimo [3], [6]. Mes studijavo galimą įsitraukimą į nustatytą PI3K /HSP90 /CHIP /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-κB signalinio kelio ląstelių augimo privalumais. Palyginti su MKN45 ląsteles, AGS ląstelės parodė išaugo migracijos aktyvumą; Tačiau Ilk arba IQGAP1 žymiai slopinimo (P
< 0,001) panaikinta ląstelių migraciją (papildomas failo 12: S11A pav). Farmakologiškai blokuoja PI3K /hsp90 /Pieno /MEK1 /2 /NF-κB signalizacijos AGS ląstelių, taip pat žymiai (p
< 0,001) susilpnintas Migracijos gebėjimai (Papildoma failą 12: S11B paveikslas), o CHIP triuškinantis žymiai sukeisti vietomis slopinantis poveikis, kurį sukelia į PI3K ir HSP90 slopinimo (6a pav; Papildoma failų 12: S11C pav.) Priešvėžiniai agentai 5-FU ir cisplatinos yra plačiai naudojami skrandžio vėžio [46] gydymui. Gydymas AGS ląsteles 5-FU arba cisplatina, ypač po Pieno ar IQGAP1 nuslopinami, sukėlė jautresniems apoptozė (6b pav.) T315 padidino AGS ląstelių jautrumą 5-FU ir cisplatinos (papildomas failas 12: S11D pav). Farmakologiškai slopina PI3K /HSP90 /Ilk /MEK1 /2 /NF-κB signalizacijos pat įjautrintos AGS ląsteles 5-FU sukeltos apoptozės (6c pav), o CHIP triukšmo slopinimo uždelsęs sinergetinį poveikį LY294002 ir 17-AAG dėl 5-FU indukuotų apoptozė (6D pav.) Priešingai, iš Pieno raišką turintis katalizinio kinazės domeno, įskaitant Pieno 1-452 ir Ilk 171-452, sustiprintos MEK1 /2 /NF-κB reguliuojama ląstelių migracija (6E paveikslas) ir ląstelių išlikimas po gydymas 5-FU (6F pav). Šie rezultatai parodė, bendras poveikis Pieno ir IQGAP1 apie ERK1 /2 /NF-κB aktyvinimas ląstelių migracijos ir išlikimui. 6 pav PI3K /HSP90 /CHIP /Ilk /ERK1 /2 /NF-κB signalizacijos lemia ląstelių migraciją ir kontroliuoja jautrumą į vaistais nuo vėžio 5-FU ir cisplatinos. (A), Migracijos veikla buvo išbandytas shLuc- ar shCHIP-perkeltų AGS ląstelių gydomiems LY294002 (25 mikromolių), o 17-AAG (0,2 mikromolių) 12 valandų. shLuc, kontrolės siRNR arba DMSO buvo naudojami kaip neigiamos kontrolės. rodomi Iš migravo ląstelių užfiksuotų srityje numeriai. PI dažymo po tėkmės citometrijos analizė parodė, 5-FU- arba cisplatina sukeltas apoptozę 2 dienų shILK- arba siIQGAP1-transfekuotų AGS ląstelių (B), AGS ląstelės jau gydytiems su nurodytomis inhibitorių 0,5 h (C), ir shLuc- arba shCHIP-perkeltų AGS ląsteles gydomi LY294002 arba 17-AAG (D). shLuc, kontrolės siRNR arba DMSO buvo naudojami kaip neigiamos kontrolės. Plazmidės remiantis pcDNA3.1-vėliava Pieno sudėtyje yra pilnametražis Pieno (Pieno
1
-452
), fragmentas 171-452 (Pieno
171
-452
) arba fragmentas 1-170 (Pieno
1
-170
) buvo pernešta į MKN45 ląsteles. Palyginti su pcDNA3.1 vėliavą (vėliavos pervežimas) tik, ląstelių migracija (R) ir apoptozė sukeltos 5-FU (5 mkm) (F) buvo aptikta nesant ar buvimas PD98059 ir Žaliojo. Duomenys vidurkis ± SN iš trijų nepriklausomų eksperimentų. * P
< 0,05, ** p
< 0,01 ir *** P
< 0,001 palyginti su kontrolės. #P
≪ 0,05, ## P
< 0,01, ir ### P
< 0,001 palyginti su kontrolės. β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. * P
< β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. * P
< β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. ** P
< * P
<

• Kombinuoti funkcijos grindžiamos MT1-MMP raiškos, CD11b + imunocituose tankis ir LNR prognozuoja klinikinius rezultatus skrandžio vėžio
• Charakteristikos Epstein Barr viruso variantai susijęs su skrandžio karcinoma Pietų Tunisia