Lisääntyminen integriini-sitoutuvan kinaasin ei-canonically antaa NF-KB-välitteistä kasvun etuja mahalaukun syöpäsolujen aktivoimalla ERK1 /2

lisääntyminen integriini-sitoutuvan kinaasin ei-canonically antaa NF-KB-välitteistä kasvun etuja mahalaukun syöpäsolujen aktivoimalla ERK1 /2
tiivistelmä
tausta
Lisääntynyt toiminta tai integriini-sitoutuvan kinaasin (ILK), joka säätelee soluadheesiota, muuttoliike ja lisääntymistä, johtaa kasvaimen synnyssä. Olemme tunnistaneet molekyylitason perustan sääntelyn ILK ja sen vaihtoehtoisen rooli annetaan ERK1 /2 /NF-KB-välitteistä kasvun etuja mahalaukun syöpäsoluja.
Tulokset
estävä ILK lyhyt hiusneula-RNA tai T315, oletetun ILK-estäjä, poisti NF-KB-välitteistä kasvun ihmisen mahalaukun syöpäsoluja AGS, SNU-1, MKN45, ja GES-1. ILK stimuloitu Ras aktiivisuus aktivoida c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /ribosomaalisen S6-kinaasi /inhibiittori κBα /NF-KB: n signaloinnin helpottamalla muodostumista IQ-motiivin sisältävien GTPaasia aktivoiva proteiini 1 (IQGAP1) - Ras monimutkainen. Pakko entsymaattinen ILK: n ilmentymistä edistää solujen kasvua helpottamalla ERK1 /2 /NF-KB: n signalointi. PI3K aktivointi tai vähentynyt PTEN ilmaisu pitkäaikainen ERK1 /2 aktivointi suojaamalla ILK peräisin proteasomin välittämän hajoamisen. C-terminaalissa heat shock sukulais 70 vuorovaikutuksessa proteiini, joka on HSP90 liittyvä E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla, välittämää ILK ubikitinaa- valvoa PI3K- ja HSP90-säänneltyjen ILK vakautus- ja signalointi. Lisäksi solujen kasvua, tunnistetut reitti edistää solujen vaeltamiseen ja vähentää herkkyyttä mahasyövän solujen syöpää ehkäisevät aineet 5-fluorourasiili ja sisplatiini. Lisäksi eksogeeninen anto EGF sekä yli-ilmentyminen EGFR laukeaa ILK- ja IQGAP1 säädelty ERK1 /2 /NF-KB: n aktivaation, solujen kasvua, ja muuttoliike.
Päätelmä
lisääntyminen ILK kuin canonically edistää ERK1 /2 /NF-KB: n aktivaation ja johtaa kasvun mahalaukun syöpäsoluja.
avainsanat
ILK Cell kasvun IQGAP1 ERK1 /2 NK-KB: n tausta
integriini-sitoutuvan kinaasin (ILK), joka on 59-kDa: n seriini /treoniini-kinaasi, suoraan vuorovaikutuksessa sytoplasmisen domeenin β1-integriinin [1]. ILK on kolme muuttujaa: N-terminaalinen ankyriiniproteiinista (ANK) toistuu, on keskeinen pleckstrin homologia (PH) kaltainen domeeni ja C-terminaalinen kinaasi domeeni [2], [3]. Integriinin välittämä soluväliaineen (ECM) tarttumista tai kasvutekijät aktivoivat fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K), fosfory- membraanisidotut PI 4,5-bisfosfaatin (PIP2) ja tuottaa PI 3,4,5-trifosfaatti (PIP3), joka sitoutuu PH-kaltaisen domeenin ILK ja aktivoi ILK [4], [5]. Jälkeen ILK aktivoinnin, C-terminaalisen kinaasidomeenin ILK voi sitoutua erilaisten proteiinien, mukaan lukien AKT, affixin, β-Parvin, glykogeenisyntaasikinaasi (GSK) -3β, calponin homologia sisältävä ILK-sitovaa proteiinia, 20 kDa: n sääntely kevytketjujen myosiinin (LC20), myosiiniin kohdistaminen alayksikköä myosiinikevytketjua fosfataasi (MYPT1), paksilliini, α-NAC, ja Proteiinifosfataasiin inhibiittorit PHI-1, Kepi, ja CPI-17 [2], [3] [6], [7]. N-terminaalinen ANK toistojen välittävät vuorovaikutusta ILK kanssa ILKAP, proteiinifosfataasi 2C perheenjäsen, ja PURISTUMISVAARA, joka on LIM domain vain sovitin proteiinia. ILK voidaan pitää PIP3-vuorovaikutuksessa proteiini alavirtaan PI3K; sen vaikutukset estyvät fosfataasin ja tensin homologin poistetaan kromosomissa 10 (PTEN) [8], [9]. PTEN estää kasvainten defosforyloimaan PIP3 [10], [11].
ILK on tärkeä rooli säätelyssä solujen eri prosesseissa, kuten solujen lisääntymisen, selviytyminen, muuttoliike, solusyklin etenemistä, ja angiogeneesi; lisääntynyttä aktiivisuutta tai ekspressiota ILK johtaa onkogeneesiin [2], [3]. Sen lisäksi moduloiva sen kumppani proteiineja solun prosesseissa, ILK on arveltu olevan osallisena solunsisäistä viestintää verkossa. Mekanistisesti ILK suoraan fosforyloi AKT päälle Ser473 ja GSK-3β on Ser9 [4], [9] välittäjänä β-kateniinin translokaatio ja säännellä AP-1 lauseke kasvainsoluproliferaation [12]. NF-KB: n aktivaatio on välttämätöntä ILK-välitteisen onkogeenisen prosesseja, kuten anti-apoptoottista aktiivisuutta [13], selviytymisen edistämiseen [14], epiteelin-mesenkymaalitransitioon [15], solukkolaajennuksen ja kestävyys apoptoosin [16], angiogeneesin [17 ], ja muuttoliike, invaasio, ja etäpesäkkeiden [18] - [20]. Lisäksi NF-KB aktivoitumista tarvitaan kanoninen sääntelyn IKKα ja IKKß jonka ILK /AKT-reitin. Laukaista solujen vaeltamiseen, ILK voi aktivoida pieniä GTPaaseja RAC ja Cdc42 [21]. Lisäksi ILK säätelee ERK1 /2 aktivaation myogenic erilaistumista [22]. Lisääntynyt ilmentyminen mikroRNA-143 ja microRNA-145, joiden kohteena ILK, estää AKT ja ERK1 /2 reittejä [23]. Kuitenkin molekyylimekanismin taustalla ILK-välitteisen ERK1 /2 aktivointi on tuntematon.
Stimulointi solujen kasvutekijöiden ja sytokiinien sekä solujen vuorovaikutusta ECM kasvu ILK toimintaa [24]. Sen lisäksi, että molekyyli asetuksen PI3K /PTEN mukaan ILK, Aoyagi et ai. tunnistettu ILK uutena lämpösokkiproteiinin (HSP) 90 asiakkaan proteiinia ja totesi, että farmakologisesti estävä HSP90 johti ILK hajoamista proteasomin riippuvaisella tavalla [25]. Lisäksi HSP90 liittyvä E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla C-päähän heat shock sukulais 70 vuorovaikutuksessa proteiinin (chip) aiheuttaa ILK hajoaminen [26]. Hashiramoto et ai. osoittaneet, että HSP90 vakiintunut ILK ja jatkuva AKT ja ERK1 /2 aktivointi [16]. Niinpä spekuloida suhdetta ILK vakautta ja aktivoinnista sen loppupään kinaasien. Ras /MAPK-reitin signalointi on välttämätöntä, tuumorigeneesin [27]. Lisääntynyt ILK: n ilmentymistä liittyy korkealaatuisesta mahasyövän [28], eturauhassyöpä [29], ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [30], vaikka solujen näitä syöpiä yleensä satama Ras mutaatioita [31] - [33]. Kohdistaminen ILK siRNA vähentää mahalaukun syöpäsoluinvaasiota, lisääntymistä ja kasvua tuntematon mekanismi [34]. Mitä tulee mahdollisuus, että ILK toimii ylävirtaan NF-KB säätelemällä IKKα [13], joka on ollut mukana mahalaukun kasvainten synnyssä [35], ILK on spekuloitu aktivoida solujen kasvua NF-KB-säänneltyjen reitin. Käyttämällä mahasyövän soluja (AGS, MKN45, ja SNU-1), tutkimme molekyylitason säätelyyn ILK ja tunnistaa ei-kanoninen reitin ILK-säänneltyjen ERK1 /2 aktivointia NF-KB-välitteisen mahalaukun syöpäsolujen kasvua, muuttoliike, ja selviytymisen edistäminen.
tulokset
ILK aktiivisuutta ja ilme ovat välttämättömiä NF-KB-välitteistä solujen kasvua
Lisääntynyt aktiivisuutta tai ilmentymistä ILK parantaa kasvaimen kehittymisen edistämällä solujen kasvun [6]. RNAi-pohjainen ILK hiljentäminen vaimentaa mahalaukun syöpäsolujen kasvua [34], kun taas ILK yliekspressio suhteessa mahahapon kasvaimien syntyyn [28]. Ihmisen mahalaukun kasvaimet ja AGS johdettuja kyhmyt BALB /c-hiirissä, Ki-67-positiivisia lisääntyvien solujen ekspressoidaan ILK mistä osoituksena fluoresenssipohjaiset immunovärjäys (kuvio 1A) ja AEC-pohjainen immunovärjäys (Additional tiedosto 1: Täydentävät materiaalit ja menetelmät; Muut tiedosto 2: Kuva S1) kokeissa. Tutkimaan mahdollisia mekanismit ILK välittämä mahalaukun syöpäsolujen kasvua, useita mahalaukun epiteelisolujen linjojen luonnehdittiin mukaan erilaiset solujen kasvu, jotka olivat korkeammat AGS ja SNU-1-soluissa ja alemman varten MKN45 ja GES-1-soluissa , ja tässä tutkimuksessa käytetyt (Additional tiedosto 3: Kuva S2A). Verrattuna MKN45 solujen, AGS ja SNU-1-soluissa oli myös kohonnut ILK: n ilmentymistä (Additional tiedosto 3: Kuva S2B ja S2C). Lentiviruksen-pohjainen shRNA käytettiin hiljentää ILK
geneettisesti että AGS, SNU-1, MKN45, ja GES-1 mahalaukun epiteelisolujen (kuvio 1 B, ylempi paneeli) sekä A549 ja H1975 ihmisen keuhkon adenokarsinooma soluja, HK-2 ihmisen munuaisen proksimaalisten tubulusten epiteelisolujen, ja THP-1 ihmisen monosyyttejä (Additional tiedosto 3: Kuva S2D). Näissä soluissa ILK hiljentäminen merkitsevästi (P ​​
< 0,05) vähentynyt solujen kasvua (kuvio 1 B; Additional tiedosto 3: Kuva S2E). Lisäksi käsittelemällä soluja ILK-estäjän T315 [36] merkitsevästi (P ​​
< 0,05) ja annosriippuvaisesti hidastaa solujen kasvua (kuvio 1C) ilman sytotoksisuus (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi vähentynyt pesäkkeen muodostusta havaittiin ILK-vaiennetaan AGS soluja (Additional tiedosto 3: Kuva S2F). Siten geenien (Additional tiedosto 3: Kuva S2G) ja farmakologinen menetelmät (Additional tiedosto 3: Kuva S2H) tukahduttaa ILK toimintaa tai yli-ilmentyminen johti solusyklin pysähtyminen G 1 vaihe. Nämä tulokset osoittavat kasvua edistävä merkitys ILK. Kuvio 1 ILK: n ilmentymistä on tarpeen solujen kasvun ja NF-KB: n aktivaation. (A) edustaja fluoresenssiin perustuva immunohistokemiallisella värjäyksellä esittää -parin ILK (vihreä
) ja Ki-67 (punainen
) ihmisen mahalaukun kasvaimet ja AGS-johdettu kyhmyt BALB /c-hiirissä. DAPI (sininen
) käytettiin ydin- counterstaining. ILK + Ki-67 + -solujen immunofluorescently värjättyä kudosleikkeiden esitetään piste-kuvaajia FACS-like-analyysi käyttämällä TissueQuest ohjelmistoa. Solut lasketaan prosentteina ja solujen määrä solujen kokonaismäärästä (DAPI + solut) kenttää kohti. (B) Western blot ILK: n ilmentymistä soluissa, jotka on transfektoitu shRNAs kohdistaminen ILK (shILK
) tai verrokkina lusiferaasi (shLuc
). β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. WST-8-pohjainen määritys osoittaa inhibition solukasvun ILK-vaiennetaan soluja. (C) annos-riippuvainen vaikutus ILK-estäjän T315 inhibitioon AGS solujen kasvua. (D) edustaja fluoresenssipohjaiset immunohistokemiallista värjäystä osoittaa -parin ILK (vihreä
) ja fosforyloitu NF-KB Ser536 (punainen
) ihmisen mahalaukun kasvaimet ja AGS johdettuja kyhmyt hiirillä. DAPI (sininen
) käytettiin ydin- counterstaining. Piste-tonttien esittävät -parin ILK ja NF-KB: n Ser536. (E) Logistinen regressioanalyysi osoitti korrelaation ILK, fosforyloitu NF-KB Ser536, ja Ki-67 in 93 mahasyövässä testatuilla näytteillä. R-squared (R
2
) ja P
arvot näkyvät. (F) EMSA osoittaa NF-KB: n aktivaation. (G) lusiferaasireporttiterilla määritys osoittaa aktivoinnin suhteen NF-KB: n ohjaamaan Renilla lusiferaasin soluissa, joita käsiteltiin NF-KB-inhibiittori KAP (25 ug /ml). (H) Kasvu 25 ug /ml CAPE käsiteltyjen AGS soluissa. (I) NF-KB: n aktivaation shLuc- tai shILK-transfektoiduissa soluissa. (J) NF-KB: n aktivaation jälkeen 6 h T315 hoidon AGS-soluissa. Solujen kasvun, pesäkkeiden muodostumisen, ja lusiferaasiaktiivisuus, tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P
< 0,05, ** P
< 0,01 ja *** P
< 0,001 verrattuna Päivä 0 tai sukulainen ohjaus. #P
≪ 0,05, ## P
< 0,01 ja ### P
< 0,001 verrattuna shLuc.
Luonnehtia piirteet ILK-säänneltyjen solujen kasvua, NF KB: n signalointi tutkittiin koska ILK voi toimia ylävirtaan NF-KB säätelemällä IKKα [13]. Immunovärjäyksellä, -parin ILK ja fosforyloidun NF-KB (Ser536) havaittiin ihmisen ja hiiren mahan kudoksissa (kuvio 1 D), ja niiden samanaikaista ilmentymistä merkittävästi (P ​​
< 0,01) ja korreloi positiivisesti määrää lisääntyvien solujen , joka on merkitty 55 triple-positiivisten tapausten kokonaismäärästä 93 mahasyövän yksilöt (kuvio 1 E; Additional tiedosto 4: Kuva S3). Immuunivärjäytyminen NF-KB tumaansiirtymiseen (Additional tiedosto 3: Kuva S2I), EMSA (kuvio 1 F), ja promoottori määritykset (kuvio 1G) vahvisti konstitutiivinen NF-KB: AGS soluissa mutta ei MKN45 soluissa. Käsittelemällä solut NF-KB-inhibiittori KAP merkittävästi (P ​​
< 0,001) pienentää NF-KB: n aktivaation (kuvio 1G) ja solujen kasvun (kuvio 1 H). Joko ILK hiljentäminen (kuva 1I; Additional tiedosto 3: Kuva S2J) tai T315 käsittely (kuvio 1J) merkitsevästi (P ​​
< 0,05) lopetti NF-KB: n aktiivisuutta. Nämä tulokset osoittivat, että ILK on välttämätön solujen kasvun testatut solulinjat, koska se helpottaa NF-KB: n aktivaatiota syöpien.
ILK säätelee Ras aktiivisuus helpottamalla kompleksi IQGAP1-Ras ohjata MAPK-aktivoitua NF-KB: n
Koska AGS solujen satama PIK3CA
ja KRAS
mutaatiot [37], tutkimme mahdolliset sääntelyn vaikutuksia ILK on modulaatio NF-KB: n aktiivisuutta näillä 2 kinaasien [38]. Käyttämällä Ihmisen Phospho-MAPK Array Kit tunnistimme 10 kinaasit, jotka korkeammin ilmaistu AGS soluissa kuin MKN45 soluissa. Nämä kinaasit enimmäkseen toimivat myötävirtaan PI3K ja MAPK signalointireitteihin (Additional tiedosto 5: Kuva S4A). Western blotting, me vahvisti fosforylaatio lisääntyy AKT: n, ERK1 /2, ja IκBα mukana IκBα hajoamista AGS-soluissa (kuvio 2A). Farmakologinen esto c-Raf, MEK1 /2, ja PI3K merkittävästi (P ​​
< 0,05) vähensi solujen kasvua (kuvio 2B), IκBα fosforylaatio (Ser32) ja hajoamista (kuvio 2C), ja NF-KB: n aktiivisuuden ( kuvio 2D), joka osoittaa, että sekä PI3K- ja Ras-aktivointi signalointireittien helpottaa NF-KB: n aktivaation. Vaikutukset ILK on tutkittu laajasti, koska sen vuorovaikutusta solujen kasvuun ja NF-KB-liittyvä AKT [4], [9]. Yllättäen ILK hiljentäminen ei vaikuttanut AKT ja GSK-3β fosforylaatiota AGS ja SNU-1-soluissa, mutta lyhensi c-Raf ja ERK1 /2 aktivointi kaikissa soluissa testataan (kuvio 2E; Additional tiedosto 5: Kuva S4b). Ilman AKT deaktivointi, arvioimme vaihtoehtoisen reitin aktivoimiseen NF-KB mekanismilla, johon MAPK /p90RSK /IκBα signalointi [38]. Knockdown ILK
vähensi useita fosforylaatiota RSK (Thr573, Thr359 /Ser363, ja Ser380) ja IκBα fosforylaatio (Ser32) ja lisääntynyt IκBα kertymistä (kuvio 2E). Inhiboiva MEK1 /2 aiheutti samanlaisia ​​vaikutuksia (Additional tiedosto 5: Kuva S4C) ja solusyklin pysähtyminen G 1 vaihe (Additional tiedosto 5: Kuva S4d). Ras-pull-down-määritys paljasti, että inhiboivat ILK aiheuttaman Ras deaktivointi vaikuttamatta vakautta Ras-proteiinin (kuvio 2F). Nämä havainnot osoittivat mahdollisen kaanoniin koulutusjakson ILK moduloida NF-KB säätelemällä Ras /c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /IκBα signalointi. Kuvio 2 ILK-IQGAP1-Ras kompleksi yllä Ras aktiivisuutta aktivoimaan c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /EK /IκBα /NF-KB signalointi. (A) Western blot osoitettujen proteiinien AGS ja MKN45 soluja. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. AGS-soluja käsiteltiin c-Raf estäjä GW5074, MEK1 /2-estäjät U0126 tai PD98059 tai PI3K-inhibiittori LY294002: ssa 48 tuntia arvioitiin niiden kasvu (B), fosforylaatio IκBα on Ser32 (pIκBα
) ja kokonaisproteiinin (C ), ja NF-KB: n aktivaation (D). (E) In shLuc- tai shILK-transfektoiduissa soluissa, western blotit osoittavat ilmentymisen ilmoitettu proteiineja. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (F) Ras aktivaatiomääritys osoittaa Ras aktiivisuus ja proteiinin ilmentymistä shLuc- ja shILK-transfektoitujen AGS soluissa. (G) edustaja fluoresenssiin perustuva immunohistokemiallisella värjäyksellä esittää -parin ILK (vihreä
) ja fosforyloitu ERK1 /2 Tyr202 /Thr204 (punainen
) ihmisen mahalaukun kasvaimet ja AGS-johdettu kyhmyt BALB /c-hiirissä. DAPI (sininen
) käytettiin ydin- counterstaining. Dot-koealojen osoittavat -parin ilmoitettu proteiineja. Valvonta- ja IQGAP1 siRNA-transfektoiduissa AGS-soluja 48 h, ilmentyminen osoitetaan proteiinien (H), NF-KB: n aktivaation ja solujen kasvua (I) on esitetty. Proteiini lysaatit uutetaan käsittelemättömien AGS-soluja (J) tai shLuc ja shILK transfektio (L, M) immunosaostettiin (IP
) ja kontrolli-IgG (C. IgG
) tai vasta-aineita ILK, IQGAP1, ja Ras . Immunoblotit (IB
) osoittavat ilmentymisen ILK, IQGAP1, ja Ras. (K) edustaja fluoresenssipohjaiset immunohistokemiallista värjäystä osoittaa -parin ILK (vihreä
), IQGAP1 (punainen
), ja Ras (punainen
) in AGS soluissa. DAPI (sininen
) käytettiin ydin- counterstaining. Lisääntymisen ja lusiferaasiaktiivisuus, tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. ** P
< 0,01 ja *** P
< 0,001 verrattuna kontrolli. Pystyssä kolmio, lisääntynyt ilmentyminen; ylösalaisin kolmio, vähentynyttä ilmentymistä.
ILK muokata ERK1 /2 aktivointi alle solujen kasvuun ja erilaistumiseen [22]; kuitenkin, molekyyli koskeva asetus Ras signalointia ei ole dokumentoitu [2], [3]. -parin ILK ja fosforyloidun ERK1 /2 (Tyr202 /Thr204) osoitettiin ihmisen mahalaukun kasvaimet ja AGS-johdettu kyhmyt BALB /c-hiiriä (kuvio 2G). ILK vuorovaikutuksessa IQGAP1 [7], joka on Ras GTPaasia aktivoiva kaltainen proteiini, joka on erilainen kuin GAP, joka muuttaa Ras sen ei-aktiiviseen tilaan. Koska IQGAP1 ohjaa Ras /MAPK signalointi, se on onkogeeninen [39], [40]. Ilmentyminen IQGAP proteiinit oli ennallaan AGS ja MKN45 solujen jälkeenkin ILK hiljentäminen (Additional tiedosto 5: Kuva S4E). Kuitenkin vaientaminen onkogeeniset IQGAP1, mutta ei IQGAP3, (Additional tiedosto 5: Kuva S4F-S4H) esti c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /EK signalointia (kuvio 2 H), NF-KB aktiivisuutta, ja solujen kasvua ( Kuvio 2I). Suorittamalla coimmunoprecipitation määrityksen, osoitimme potentiaalinen monimutkainen kätkeminen ILK, IQGAP1, ja Ras (kuvio 2J). Immunovärjäyksen vahvisti, että ILK oli ekspressoidaan tasoisena kuin IQGAP1 ja Ras (kuvio 2K; Additional tiedosto 6: Kuva S5). Erityisesti hiljentäminen ILK häiritsi IQGAP1-Ras kompleksi (kuvio 2L ja 2M). Nämä tulokset osoittivat, että ILK helpotti muodostumista IQGAP1-Ras kompleksin ylläpitämään Ras aktiivisuus.
Entsymaattinen ILK moduloi muodostumista IQGAP1-Ras monimutkainen ja ERK1 /2-välitteistä solujen kasvun
Tulosten osoitti, että farmakologisesti estävä ILK vähentynyt solujen kasvua, mikä osoittaa keskeinen rooli entsyymiaktiivisuuden ILK. Edelleen estämällä ILK geneettinen lähestymistapa häiritsi IQGAP1 välittämän Ras signalointi. Inhiboiva ILK aktiivisuus farmakologisesti kanssa T315 (kuvio 3A) tai geneettisesti transfektoimalla entsymaattisen mutantti ILK A262V [41] (kuvio 3B) myös häiritsi muodostumista IQGAP1-Ras monimutkainen AGS soluissa. Kolme katkaistu alueet ILK (kuvio 3C) on yli-ilmentyy siinä MKN45 soluissa tunnistaa domain välttämätöntä ylläpitää IQGAP1-Ras monimutkainen. Coimmunoprecipitation analyysit osoittivat, että yli-ilmentynyt ILK rakentaa kätkeminen PH ja katalyyttinen kinaasialue alueilla immunosaostettiin IQGAP1 ja Ras (kuvio 3D). Siksi vain kinaasidomeenista sisältäviä ILK aktivoitua ERK1 /2 (kuvio 3E). Verrattuna täyspitkän ILK (ILK 1-452), transfektoidaan kinaasi-dead-mutantin ILK A262V ei aktivoinut ERK1 /2 (kuvio 3F). Muihin kokeet osoittivat, että vain kinaasidomeenin sisältävä ILK kasvoi MEK1 /2-säännelty NF-KB: n aktivaation (kuvio 3G) ja sen jälkeen MEK1 /2- ja NF-KB: n säädelty solujen kasvu (kuvio 3H) on MKN45 soluissa. Nämä tulokset osoittivat, että entsymaattinen ILK-välitteisen muodostumisen IQGAP1-Ras kompleksin laukaista ERK1 /2- ja NF-KB: n välittämä solujen kasvua. Kuvio 3 Tahdonvastaiset ILK: n ilmentymistä helpottaa solukasvua aiheuttamalla ERK1 /2 /NF-KB: n aktivaation. Proteiini lysaatit uutetaan AGS käsiteltyjen solujen T315 (A) tai transfektoitu Myc-DDK-leimatun mutantin ILKA262V (B) immunosaostettiin (IP
), jossa vasta-aineiden ILK. Immunoblotit (IB
) osoittavat ilmentymisen ILK, IQGAP1, ja Ras. Perustuvat plasmidit pcDNA3.1-Flag-ILK sisälsi täyspitkän ILK (ILK
1
-452
), fragmentti 171-452 (ILK
171
-452
) fragmentti 1-170 (ILK
1
-170
) (C), tai Myc-DDK-merkittyä mutantti ILKA262V transfektoitiin MKN45 soluihin. (D) Coimmunoprecipitation Flag, jossa on esitetty proteiinien on esitetty käyttämällä western-blottauksella. Verrattuna pcDNA3.1-Flag (Flag
) vain, western blotit osoittavat ilmentymisen fosforyloidun ERK1 /2 klo Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (E, F). β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. NF-KB: n aktivaation (G) ja solujen kasvun (H) havaittiin myös puuttuessa tai läsnä PD98059 ja KAP. Tiedot ovat keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. ** P
< 0,01 verrattuna kontrolli. ## P
< 0,01 verrattuna ILK1-452. Pystyssä kolmio, lisääntynyt ilmentyminen.
PI3K aktivointi ja laski PTEN ilmaisun helpottamiseksi ERK1 /2 /NF-KB: n aktivoitumisen vakauttaa ILK
Koska ILK riippuu PI3K välittämää PIP3 sukupolven sen aktivoitumisen [4], kasvutekijä- ja integriini-välitteisen PI3K aktivointia tai PI3K mutaatio AGS soluissa [37] voisi edistää ILK: n ilmentymistä ja aktivointi. Verrattuna kasvua MKN45 solujen kasvua AGS solujen ei vaikuttanut kohonnut IL-6 tasoa [42], ja ilmaus β1 ja β3 integriinien ei kasvanut (Additional tiedosto 7: Kuva S6). Olemme edelleen vahvisti, että PIP3 sukupolvi oli suurempi PI3K-mutatoitunut AGS-soluja (kuvio 4A). Tutkia välisten suhteiden PI3K, ILK, ja Ras signalointireitteihin, AGS soluja käsiteltiin MEK1 /2, PI3K, ILK tai Ras inhibiittori eri kestoja. 6 h kuluttua hoidon, T315 hieman esti MEK1 /2 ja ERK1 /2 fosforylaatiota (Additional tiedosto 8: Kuva S7). 24 tunnin käsittelyn jälkeen, PI3K inhibitio häiritsi ILK: n ilmentymistä, joka seurasi MEK1 /2 /ERK1 /2 deaktivointi 24 h käsittelyn jälkeen (kuvio 4B). Kuitenkin Ras esto ei poista AKT tai ILK että AGS soluissa, vaikka Ras voi välittää PI3K aktivointi [27]. Samanlainen ILK-vaiennettu AGS soluihin, sekä MKN45 ja LY294002 stimuloiman AGS soluissa oli vähentynyt Ras aktiivisuus (kuvio 4C). Käännöksen estäjä sykloheksimi- helpottanut LY294002 aiheuttama ILK downregulation (kuvio 4D) ja proteasomin estäjä MG132 päinvastainen edellä mainitun vaikutuksen ja ERK1 /2 inaktivaation (kuvio 4E). Kasvain vaimennin fosfataasi PTEN säätelee negatiivisesti PI3K /PDK1 /AKT signalointi [10], [11] ja ILK aktiivisuus [8], [9], ja AGS solut osoittivat alhainen ilmaus PTEN (kuvio 2A) [43]. Pakko ilmentyminen PTEN on AGS-soluissa ei ainoastaan ​​heikennetty konstitutiivinen fosforylaatio PDK1, AKT ja PAK1 mutta inhiboi myös ILK: n ilmentymistä, ERK1 /2-fosforylaation (kuvio 4F), ja NF-KB: n aktivaation (kuvio 4G). Nämä tulokset osoittivat, että PI3K aktivointi ja laski PTEN ilmaisun vakauttaa ILK säädellä ERK1 /2 /NF-KB: n aktivaation. Kuvio 4 PI3K aktivointi ja laski PTEN ilmaisun helpottamiseksi ERK1 /2 /NF-KB: n aktivaation kautta ILK vakauttaminen. (A) PIP3 Mass ELISA Kit käytettiin määrittämään PI3K-aktiivisuuden määrän mittaamiseksi PIP3 uutetaan käsittelemättömän AGS ja MKN45 solut ja AGS soluja käsiteltiin LY294002 24 tuntia. (B) AGS-soluja käsiteltiin PD98059, LY294002, T315, tai Ras n estäjä FTI-277 varten ilmoitettu kertaa. Western-blotit osoittavat ilmentymisen ilmoitettu proteiineja. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (C) Ras-aktiivisuus havaittiin AGS, MKN45, ja LY294002-käsiteltyjen AGS soluissa, sen jälkeen 24 h. Western-blotit osoittavat ilmentymisen ilmoitettu proteiinien AGS-soluissa, jotka on esikäsitelty käännös inhibiittorin sykloheksimidin (CHX
) (D) tai proteasomin inhibiittoria MG132 (E) 0,5 h ja sitten käsiteltiin LY294002 24 tuntia. PTEN yliekspressoitiin AGS soluissa käyttämällä pcDNA3.1-GFP-PTEN (PTEN
). Western-blotit osoittavat ilmentymisen merkitty proteiinien verrattuna pcDNA3.1-GFP (Vector
) transfektion (F), ja NF-KB: n aktivaation (G) määritettiin myös. Kinaasien ja lusiferaasiaktiivisuus, tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P
< 0,05, ** P
< 0,01 ja *** P
< 0,001 verrattuna kontrolli. Pystyssä kolmio, lisääntynyt ilmentyminen; ylösalaisin kolmio, vähentynyttä ilmentymistä.
HSP90-associated E3-ligaasi-Chip negatiivisesti ohjaa ILK stabilointi, ERK1 /2 /NF-KB: n aktivaation ja solujen kasvua
edelleen tarkastaa mekanismin taustalla ILK epävakautta, tuloksemme osoittivat, että AKT esto ei vaikuttanut ILK vakautta, kun taas PI3K esto vaikuttaa ILK vakautta (Additional tiedosto 9: Kuva S8). HSP90 on seuraava tutkittiin, koska se voi aiheuttaa ILK hajoamista [25]. Samanlaisia ​​tuloksia PI3K inhibition, shRNA-pohjainen (kuvio 5A) tai farmakologisen inhibition HSP90 (Additional tiedosto 10: Kuvio S9A) viivästynyt paitsi PDK1 /AKT-fosforylaation, mutta myös c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 aktivoinnin jälkeen ILK hajoamista. Lisäksi geneettisesti tai farmakologisesti estämällä HSP90 käsittelemällä 17-AAG tai HDAC estäjä SAHA, joka vangitsee HSP90 on asetyloitu, entsymaattisesti aktiivinen tila, heikennettyjä NF-KB aktiivisuutta (kuvio 5B; Additional file 10: Kuva S9B) ja solujen kasvua ( kuvio 5C). Yhteiskäsittely kanssa MG132 pelastettiin vaikutukset 17-AAG (kuvio 5D) ja SAHA koskevat ILK hajoamista ja ERK1 /2 inaktivaation (Additional tiedosto 10: Kuva S9C). Vuonna MKN45 solut, käsittelemällä MG132 lisääntynyt ILK: n ilmentymistä, MEK1 /2 ja ERK1 /2-fosforylaation (Additional tiedosto 11: Kuva S10), ja NF-KB: n aktivaation (tuloksia ei ole esitetty). Coimmunoprecipitation osoitti muodostumista HSP90-ILK-kompleksia (tuloksia ei ole esitetty). Käyttämällä lentiviruksen perustuva shRNA lähestymistapa (kuvio 5E), HSP90 liittyvä E3 ligaaseina kuten siru, Cullin 4A, ja Cullin 4B [26], [44], [45], tutkittiin niiden roolien ILK hajoamista. Tulokset osoittivat, että vain hiljentäminen Chip pelastettiin ILK hajoaminen ja ERK1 /2 inaktivaation (kuvio 5F), NF-KB deaktivointi (kuvio 5G) ja solujen kasvun estäminen (kuvio 5H) jälkeen farmakologinen esto PI3K ja HSP90. CHIP vaadittiin ILK ubikinaa- että LY294002 käsiteltyjen AGS soluissa (kuvio 5I). Nämä tulokset osoittivat, että HSP90 /Chip signalointi säätelee PI3K välittämää ILK vakautus- ja ILK-säännelty ERK1 /2 /NF-KB: n aktivaation ja helpottaa siten solujen kasvua. Kuva 5 CHIP määrittelee ILK epävakautta, ERK1 /2 /NF-KB inaktivaation, ja solukasvuneston jälkeen PI3K /HSP90 inaktivointia. AGS solut transfektoitiin shLuc tai shHSP90 tai esikäsitelty HSP90 -estäjä 17-AAG (0,1 uM) 48 tuntia. Western-blotit osoittavat ilmentymisen osoitti proteiinien (A), ja NF-KB: n aktivaation (B) ja solujen kasvua (C) määritettiin myös. (D) MG132 esikäsittelyä (0,5 h) vaihdetaan ILK: n ilmentymistä ja fosforyloitu ERK1 /2 klo Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) 17-AAG-käsiteltyjen AGS soluissa. (E) siru, Cullin 4A, ja Cullin 4B hiljennettiin vuonna AGS soluissa shRNAs. shRNA-transfektoituja soluja käsiteltiin LY294002 tai 17-AAG: ssa 24 tuntia. Western blotting osoitti ilmentymisen ILK ja fosforyloidun ERK1 /2: Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (F), ja NF-KB: n aktivaation (G) ja solujen kasvun (H) määritettiin myös. (I) Kun shLuc- ja shCHIP transfektoitiin AGS soluja käsiteltiin LY294002, ILK immunosaostettiin, ja sen ubiquitylation koettimena. Western blot -analyysiä varten, β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Lusiferaasiaktiivisuus ja solujen kasvua, tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. ** P
< 0,01 ja *** P
< 0,001 verrattuna kontrolli. ## P
< 0,01 ja ### P
< 0,001 verrattuna shLuc tai DMSO. NS: ei merkittävää. Pystyssä kolmio, lisääntynyt ilmentyminen; ylösalaisin kolmio, vähentynyttä ilmentymistä.
PI3K /HSP90 /Chip /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-KB signalointi edistää solujen vaeltamiseen ja herkkyyttä 5-FU ja sisplatiinin
Lisääntynyt ILK aktiivisuutta tai ilmaus voi säädellä onkogeenisia prosesseja, kuten solun proliferaatiota, migraatiota, ja selviytyminen [3], [6]. Tutkimme mahdollinen osallistuminen tunnistettu PI3K /HSP90 /Chip /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-KB-signalointireitin solujen kasvun etuja. Verrattuna MKN45 solujen, AGS solut osoittivat lisääntynyttä muuttavia toimintaa; kuitenkin, ILK tai IQGAP1 äänenvaimennusjärjestelmien merkittävästi (P ​​
< 0,001) lakkautetaan solumigraation (Additional tiedosto 12: Kuva S11A). Farmakologisesti estää PI3K /HSP90 /ILK /MEK1 /2 /NF-KB signaloinnin AGS soluissa myös merkittävästi (P ​​
< 0,001) vaimensi leviämiskyky (Additional tiedosto 12: Kuva S11B), ja siru pudotus huomattavasti kääntänyt estovaikutus aiheuttama inhibition PI3K ja HSP90 (kuvio 6A; Muihin file 12: Kuva S11C). Syöpää ehkäisevät aineet 5-FU: n ja sisplatiinin käytetään yleisesti hoidettaessa mahalaukun syövistä [46]. Käsittelemällä AGS soluja 5-FU tai sisplatiinin, erityisesti sen jälkeen, kun ILK tai IQGAP1 hiljentämisen aiheuttama lisääntynyt alttius apoptoosiin (kuvio 6B). T315 lisääntynyt herkkyys AGS solujen 5-FU ja sisplatiinin (Additional tiedosto 12: Kuva S11D). Farmakologisesti estämällä PI3K /HSP90 /ILK /MEK1 /2 /NF-KB signalointia myös herkistyneet AGS solujen 5-FU: n indusoiman apoptoosin (kuvio 6C), kun taas CHIP hiljentäminen hidasti synergiavaikutuksen LY294002 ja 17-AAG 5-FU indusoimaan apoptoosin (kuvio 6D). Sen sijaan yli-ilmentyminen ILK sisältää katalyyttisen kinaasidomeenin, mukaan lukien ILK 1-452 ja ILK 171-452, parannettu MEK1 /2 /NF-KB-säännelty solumigraation (kuvio 6E) ja solujen eloonjäänti sen jälkeen, kun hoito 5-FU (kuvio 6F). Nämä tulokset osoittivat yhteisten vaikutusten ILK ja IQGAP1 päälle ERK1 /2 /NF-KB: n aktivoitumista solun kulkua ja selviytymistä. Kuva 6 PI3K /HSP90 /Chip /ILK /ERK1 /2 /NF-KB signalointi määrittelee solujen vaeltamiseen ja ohjaa alttiutta syöpälääkkeiden 5-FU ja sisplatiinilla. (A) Migration aktiivisuus testattiin shLuc- tai shCHIP transfektoidut AGS soluja käsiteltiin LY294002 (25 uM) ja 17-AAG (0,2 uM) 12 tuntia. shLuc, ohjaus siRNA, tai DMSO: ta käytettiin negatiivisina kontrolleina. Lukumäärät siirtynyt solujen havaittuun kentässä näytetään. PI värjäyksessä, mitä seurasi virtaussytometria-analyysi osoitti 5-FU- tai sisplatiinin indusoiman apoptoosin 2 päivää shILK- tai siIQGAP1-transfektoitujen AGS-solut (B), AGS soluja esikäsiteltiin ilmoitettu estäjien 0,5 h (C), ja shLuc- tai shCHIP-transfektoitujen AGS soluja käsiteltiin LY294002 tai 17-AAG (D). shLuc, ohjaus siRNA, tai DMSO: ta käytettiin negatiivisina kontrolleina. Perustuvat plasmidit pcDNA3.1-Flag-ILK sisälsi täyspitkän ILK (ILK
1
-452
), fragmentti 171-452 (ILK
171
-452
) tai fragmentti 1-170 (ILK
1
-170
) transfektoitiin MKN45 soluihin. Verrattuna pcDNA3.1-Flag (Flag
) vain, solumigraation (E) ja indusoiman apoptoosin 5-FU (5 uM) (F) havaittiin puuttuessa tai läsnä ollessa PD98059 ja KAP. Tiedot ovat keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P
< 0,05, ** P
< 0,01 ja *** P
< 0,001 verrattuna kontrolli. #P
≪ 0,05, ## P
< 0,01 ja ### P
< 0,001 verrattuna kontrolli.

• Yhdistetty ominaisuudet perustuvat MT1-MMP ilme, CD11 + immu- tiheys ja LNR ennustaa kliinisiä tuloksia mahasyöpä-
• Ominaisuudet Epstein-Barrin virus variantteja liittyy mahakarsinoo- Etelä Tunisia