Zvýšenie integrín viazané kinázy non-canonically udeľuje NF-kB sprostredkovanej rastové výhody na buniek karcinómu žalúdka aktiváciou ERK1 /2

zvýšenie v integrínu viazané kinázy non-canonically udeľuje NF-kB sprostredkovanej výhody rastu do buniek karcinómu žalúdka tým, aktivácia ERK1 /2
Abstract
pozadí
zvýšenú aktivitu alebo expresiu integrínu viazané kinázy (ILK), ktorý reguluje bunkovú adhéziu, migráciu a proliferáciu, vedie k onkogenézy. Identifikovali sme molekulárnej základ pre reguláciu ILK a jej alternatívne úlohu v udelení ERK1 /2 /NF-kB sprostredkovanej výhody rastu k rakovinovým bunkám žalúdku.
Výsledky
inhibícia ILK s krátkym vlásenky RNA alebo T315, domnelý inhibítor ILK, zrušil NF-kB sprostredkované rast v ľudskom žalúdku rakovinových buniek AGS, SNU-1, MKN45 a GES-1. ILK stimulované Ras aktivitu k aktivácii c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /ribozomálnu S6 kinázy /inhibítor κBα /NF-kB signalizácia tým, že uľahčuje tvorbu IQ motív obsahujúce GTPázu aktivujúce proteín 1 (IQGAP1) - komplex Ras. Nútené enzymatické expresia ILK podporovať rast buniek uľahčením ERK1 /2 /NF-kB signalizácia. PI3K aktivácie alebo znížená expresia Ptení predĺži doba aktivácie ERK1 /2 tým, že chráni pred degradáciou ILK proteazómu sprostredkované. C-koniec tepelného šoku príbuzný 70 interakčným proteínom, s HSP90 súvisiace s E3 ubiquitin ligázu, sprostredkované ILK ubiquitinace ovládať PI3K- a HSP90-regulované stabilizáciu ILK a signalizáciu. Okrem rastu buniek, identifikovaný cesta podporovať migráciu buniek a znižuje citlivosť buniek karcinómu žalúdka do protirakovinové látky 5-fluorouracilu a cisplatiny. Navyše exogénne podávanie EGF, ako aj zvýšená expresia EGFR spúšťa ILK- a IQGAP1-regulovaný ERK1 /2 /NF-kB aktivácie, rast buniek a migráciu.
Záver
Zvýšenie podielu ILK non-canonically podporuje ERK1 /2 aktivácia /NF-kB a vedie k rastu buniek karcinómu žalúdka.
kľúčové slová
ILK rast buniek IQGAP1 ERK1 /2 NK-kB pozadia
integrín viazané kinázy (ILK), čo je 59-kDa serín /treonín kináza, priamo interaguje s cytoplazmatickej domény D1 integrínu [1]. ILK sa skladá z troch domén: N-terminálny ankyrin (ANK) sa opakuje, centrálne pleckstrin homológne (PH) -like domény, a kináza C-koncová doména [2], [3]. Integrín sprostredkované bunka-extracelulárnej matrix adhéznych alebo rastu (ECM) faktory aktivujú fosfatidylinozitol 3-kinázy (PI3K) fosforylovať membránovo viazaný PI 4,5-bifosfát (PIP2) a generovať PI 3,4,5-trifosfát (PIP3), ktorý sa viaže na PH-podobná doména ILK a aktivuje ILK [4], [5]. Po aktivácii ILK, C-koncová doména kinázy ILK sa môže viazať na rôzne proteíny, vrátane Akt affixin, p-Parvin, glykogén syntázy kinázy (GSK) -3β, calponin ILK proteínu viažuceho homológie s obsahom 20-kDa regulačné ľahké reťazce myozínových (LC20), ktorých myosin cielenie podjednotky myosin ľahkého reťazca fosfatázy (MYPT1), paxillinu, a-NAC, a inhibítory proteínovej fosfatázy PHI-1, Kepi a CPI-17 [2], [3] [6], [7]. Tieto N-terminálne repetície ANK sprostredkovávajú interakcie ILK s ILKAP, proteín fosfatázy 2C člena rodiny, a krajnom prípade s LIM domény len pre adaptér proteínu. ILK môže byť považovaný za proteín PIP3-interagujúce po prúde PI3K; jeho účinky sú blokované fosfatázy a tensinu homológov vypúšťa na chromozóme 10 (Ptení) [8], [9]. Ptení potláča nádory z hľadiska dephosphorylating PIP3 [10], [11]
ILK hrá dôležitú úlohu v regulácii rôznych bunkových procesov, vrátane proliferácie, prežitia, migrácia, progresiu bunkového cyklu a angiogenézy .; Zvýšená aktivita alebo expresie ILK vedie k onkogenézy [2], [3]. Okrem moduláciu jeho partnerské proteíny pre bunkové procesy, ILK je hypotéza sa podieľa na intracelulárnym prenosu signálu siete. Mechanicky, ILK priamo fosforyluje Akt na Ser473 a GSK-3p na Ser9 [4], [9] sprostredkovať β-katenin translokáciu a regulovať AP-1 expresie na proliferáciu nádorových buniek [12]. Aktivácia NF-kB je nevyhnutné pre ILK sprostredkovanú onkogénnych procesov, ako je napríklad anti-apoptotické aktivitu [13], podpora prežívania [14], epiteliálne-mezenchýmových prechodu [15], bunkové rozšírenie a odolnosť proti apoptóze [16], angiogenézy [17 ], a migrácia, invázia a metastázy [18] - [20]. Okrem toho, pre kanonické reguláciu IKKA a IKKß u ILK /Akt dráhy je vyžadovaná aktivácia NF-kB. Ak chcete spustiť migráciu buniek, ILK môže aktivovať malý GTPase RAC a Cdc42 [21]. Okrem toho ILK reguluje Erk1 aktiváciu /2 v Myogénne diferenciácie [22]. Zvýšená expresia mikroRNA-143 a mikroRNA-145, ktoré sa zameriavajú na ILK, inhibuje AKT a ERK1 /2 dráhy [23]. Avšak, aktivácia molekulárnej mechanizmus základnej ILK sprostredkované ERK1 /2 zostáva neznámy.
Stimuláciu buniek rastovými faktormi a cytokínmi, rovnako ako bunkové interakcie s ECM zvýšenie ILK aktivity [24]. Okrem molekulárnej regulácia PI3K /Ptení u ILK, Aoyagi et al. identifikovaná ILK ako nového proteínu tepelného šoku (HSP) 90 klientského proteínu, a zistilo sa, že farmakologicky inhibícia HSP90 za následok degradáciu ILK spôsobom proteazómu závislé [25]. Okrem toho je HSP90 spojené s E3 ubikvitin ligázu C-koniec tepelného šoku príbuzný 70 interagujúce proteín (čipu) spôsobí degradáciu ILK [26]. Hashiramoto et al. preukázali, že HSP90 stabilizovaný ILK a trvalé Akt a ERK1 /aktivácia 2 [16]. Preto sme sa špekulovať vzťah medzi ILK stabilitou a aktiváciu jeho nadväzujúcich kináz. Ras /MAPK signalizácie je nevyhnutná pre nádorového ochorenia [27]. Zvýšená expresia ILK sa vzťahuje k rakovine žalúdka vysoko kvalitné [28], rakoviny prostaty [29], a nemalobunkového karcinómu pľúc [30], aj keď bunky v týchto rakovín bežne prístav Ras mutácie [31] - [33]. Cielenie ILK s siRNA znižuje rakoviny žalúdka invázie buniek, proliferáciu a rast prostredníctvom neznámym mechanizmom [34]. Pokiaľ ide o možnosť, že ILK pôsobí proti prúdu od NF-kB pomocou regulácie [13] IKKA, ktorá sa podieľa na vzniku nádorov žalúdka [35], ILK sa špekuluje aktivovať bunkový rast cez NF-kB-regulované dráhy. S použitím buniek karcinómu žalúdka (AGS, MKN45 a SNU-1), sme študovali molekulárnej reguláciu ILK a identifikovali nekanonický dráhu ILK-regulované ERK1 /2 aktivácia pre NF-kB sprostredkovanej rastu karcinómu žalúdka buniek, migrácie, a prežitie propagácie.
výsledky
ILK aktivita a expresia sú nevyhnutné pre NF-kB sprostredkované rast buniek
zvýšenú aktivitu alebo expresiu ILK zvyšuje tumorigenezi tým, že podporuje rast buniek [6]. RNAi založené na ILK tlmenie hluku zmierňuje žalúdočné rast rakovinových buniek [34], pričom nadmerná expresia ILK sa vzťahuje k tvorbe nádorov žalúdka [28]. V ľudských nádorov žalúdka a zápis, odvodené uzly v Balb /c myší, Ki-67-pozitívne proliferujúcich bunkách koexprimován ILK, ako ukázalo fluorescencii založené na imunologickej (obrázok 1A) a AEC založený imunologickej (ďalší súbor 1: doplnkových materiálov a metód; Ďalší súbor 2: Obrázok S1) experimenty. Prešetrila možné mechanizmy ILK sprostredkované rast žalúdočné rakovinové bunky, niekoľko žalúdočné epitelové bunkové línie boli charakterizované v súlade s ich rôznou rýchlosťou bunkového rastu, ktoré boli vyššie pre AGS a SNU-1 buniek a nižšie pre MKN45 a GES-1 buniek a použitý v tejto štúdii (ďalší súbor 3: Obrázok S2A). V porovnaní s MKN45 buniek, AGS a buniek SNU-1 tiež mali zvýšené ILK výraz (ďalší súbor 3: Obrázok S2B a S2C). Lentivirovým báze Zhrnieme bol použitý na umlčanie ILK
geneticky v AGS, SNU-1, MKN45 a GES-1 žalúdočné epiteliálne bunky (obrázok 1B, horný panel), rovnako ako v A549 a H1975 buniek adenokarcinómu ľudských pľúc, HK-2 ľudských obličkových proximálnych rúrkovité epitelové bunky a THP-1 ľudskej monocytární bunky (ďalší súbor 3: Obrázok S2D). V týchto bunkách, ILK významne umlčanie (P
menšie ako 0,05) sa znížil rast buniek (Obrázok 1B; Ďalší súbor 3: Obrázok S2E). Okrem toho, ošetrenie buniek s inhibítorom ILK T315 [36] významne (P
menšie ako 0,05) a v závislosti na dávke retardovaný rast buniek (Obrázok 1C) bez cytotoxicity (dáta nie sú uvedené). Naviac sa znížila tvorba kolónií bola pozorovaná u branže-umlčané AGS buniek (ďalší súbor 3: Obrázok S2F). Tak, umlčanie génov (Ďalší súbor 3: Obrázok S2G) a farmakologické metódy (Ďalší súbor 3: Obrázok S2H) k potlačeniu ILK činnosť alebo zvýšená expresia viedla k zastaveniu bunkového cyklu v G 1 fázy. Tieto výsledky ukazujú na úlohu rast podporujúci ILK. Obrázok 1 ILK expresie je nevyhnutná pre rast buniek a aktiváciu NF-kB. (A) Zástupca fluorescencie na báze Imunohistochemické farbenie znázorňuje koexpresi ILK (zelený
) a Ki-67 (červený)
v ľudských nádorov žalúdka a AGS-odvodených uzliny v Balb /c myší. DAPI (modrá
) bol použitý pre jadrovú kontrastným. ILK + Ki-67 + buniek v sekciách farbených immunofluorescently tkaniva sú prezentované ako bodových plochách analýzy FACS, ako pomocou TissueQuest softvér. Bunky boli vypočítané ako percento a počet buniek z celkového počtu buniek (DAPI + bunky) na poli. (B) Western blot expresie ILK v bunkách transfekciou shRNAs zacielenia ILK (shILK
) alebo kontrolné luciferázy (zhlukoch
). β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. Test WST-8 na báze ukazuje inhibíciu rastu buniek v bunkách ILK-umlčaný. (C) Účinok závislý od dávky na T315 inhibítora ILK na inhibíciu bunkového rastu AGS. (D) Zástupca fluorescencie na báze Imunohistochemické farbenie znázorňuje koexpresi ILK (zelený
) a fosforylovaného NF-kB Ser536 (červená
) v ľudských nádorov žalúdka a AGS-odvodených uzliny u myší. DAPI (modrá
) bol použitý pre jadrovú kontrastným. Dot-grafy ukazujú Spoločná expresia ILK a NF-kB Ser536. (E) Logistická regresná analýza preukázala koreláciu medzi ILK, fosforylovaného NF-kB Ser536 a Ki-67 u 93 vzoriek s karcinómom žalúdka testovaných. R-squared (R
2
) a hodnoty P
sú zobrazené. (F) EMSA preukázanie aktivácie NF-kB. (G) Luciferázový reportér test ukazuje pomer aktivácia NF-kB pre ovládanie Renilla luciferázy v bunkách ošetrených s NF-kB inhibítora kapucňou (25 ug /ml). (H) Rast 25 ug ml CAPE ošetrených AGS buniek /. (I), aktivácia NF-kB v bunkách alebo shLuc- shILK transfekciou. (J) NF-kB aktivácia po 6 hodinách liečby T315 v AGS bunkách. Pre rast buniek, tvorbu kolónií, a aktivity luciferázy, dáta sú priemer ± SD z troch nezávislých pokusov. * P Hotel < 0,05, ** P Hotel < 0,01 a *** P Hotel < 0,001 v porovnaní s Day 0 alebo relatívnej kontrolou. #P
Menšie ako 0,05, ## P
< 0,01 a ### P
. ≪ 0,001 v porovnaní s zhlukoch
Charakterizovať funkcie ILK-regulovaná rastom buniek, NF- kB signalizácia bola skúmaná, pretože ILK môže pôsobiť proti prúdu NF-kB regulovaním IKKA [13]. Imunobarvením, Spoločná expresia ILK a fosforylovaného NF-kB (Ser536) bola pozorovaná u ľudských a myších žalúdočných tkanív (Obrázok 1D), a ich významne Koexprese (P Hotel &0,01) a pozitívne koreluje s počtom proliferujúcich buniek , čo je indikované 55 triple-pozitívnych prípadov z celkovo 93 vzoriek s karcinómom žalúdka (obrázok 1E, ďalšie súborové 4: obrázok S3). Imunohistochemické pre NF-kB nukleárnej translokácii (ďalší súbor 3: Obrázok S2I), EMSA (obrázok 1F), a propagátor testy (Obrázok 1G) potvrdila konštitutívny aktiváciu NF-kB v bunkách AGS, ale nie v bunkách MKN45. Ošetrovanie buniek s NF-kB inhibítora CAPE významne (P Hotel &0,001) znižuje aktiváciu NF-kB (obr 1G) a rast buniek (obrázok 1 H). Buď ILK umlčanie (Obr 1I; Ďalší súbor 3: Obrázok S2J) alebo liečbu T315 (Obrázok 1J) významne (P
menšie ako 0,05) sa zastavil NF-kB aktivita. Tieto výsledky ukázali, že ILK je nevyhnutný pre rast buniek v testovaných bunkových líniách, pretože to uľahčuje aktiváciu NF-kB u karcinómov žalúdka.
ILK reguluje aktivitu Ras uľahčením komplexu IQGAP1-Ras ovládať MAPK aktivovanej NF-kB
Vzhľadom k tomu, AGS bunky prechovávať PIK3CA stroje a Kras
mutácie [37] sme skúmali možné regulačné účinky ILK na moduláciu NF-kB aktivity podľa týchto kritérií 2 kináz [38]. Použitie Array Kit Human fosfo-MAPK sme identifikovali 10 kináz, ktoré boli viac vysoko vyjadrené v AGS bunkách než v bunkách MKN45. Tieto kinázy väčšinou konal v smere z PI3K a MAPK signálnych dráh (ďalší súbor 5: Obrázok S4A). Westernovým prenosom, sme potvrdili zvýšenú fosforylácii AKT, ERK1 /2 a IκBα sprevádzané degradáciou IκBα v AGS bunkách (obrázok 2A). Farmakologická inhibícia c-Raf, MEK1 /2, a PI3K významne (P Hotel &0,05) znižuje rast buniek (obrázok 2B), IκBα fosforylácie (Ser32) a degradácie (obrázok 2C), a NF-kB aktivita ( obrázok 2D), čo naznačuje, že obaja PI3K- a Ras-aktiváciu signálnej dráhy uľahčená aktivácia NF-kB. Účinky ILK boli široko študované z dôvodu jeho interakcie s bunkovou na rast a NF-kB-spojené AKT [4], [9]. Prekvapivo, ILK umlčanie neovplyvnilo Akt a GSK-3p fosforylácii v AGS a buniek SNU-1, ale výrazne znížená c-Raf a ERK1 /2 aktivácia vo všetkých testovaných buniek (obr 2E, ďalší súbor 5: Obrázok S4B). Bez AKT deaktiváciu sme vyhodnotili alternatívnu cestu pre aktiváciu NF-kB prostredníctvom mechanizmu zahŕňajúceho MAPK /p90RSK /IκBα signalizácie [38]. Porazený z ILK
znížila viac fosforylácii RSK (Thr573, Thr359 /Ser363 a Ser380) a IκBα fosforylácie (Ser32) a zvýšené hromadenie IκBα (Obrázok 2e). Inhibícia MEK1 /2 spôsobila podobné účinky (Ďalší súbor 5: Obrázok S4C) a zástavu bunkového cyklu v G 1 fáza (Ďalší súbor 5: Obrázok S4D). Pull-down test Ras bolo zistené, že inhibícia ILK spôsobil Ras deaktiváciu bez toho aby to ovplyvnilo stabilitu Ras proteínu (obrázok 2F). Tieto nálezy preukázali potenciálnu nekanonický cestu pre ILK modulovať NF-kB prostredníctvom regulácie Ras /c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /IκBα signalizáciu. Obrázok 2 ILK-IQGAP1-Ras komplex udržiava Ras aktivitu pre aktiváciu c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /RSK /IκBα /NF-kB signalizácia. (A), Western blot z uvedených proteínov v AGS a MKN45 buniek. β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. AGS bunky ošetrené inhibítory c-Raf GW5074, MEK1 /2 inhibítory U0126 alebo PD98059, alebo inhibítor PI3K LY294002 po dobu 48 hodín boli hodnotené pre ich rast (B), fosforylácii IκBα na Ser32 (pIκBα
) a celkové bielkoviny (C ), a aktiváciu NF-kB (D). (E) V shLuc- alebo buniek transfekciou shILK, western blot ukazujú expresiu uvedených proteínov. β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. test aktivácie (F) Ras ukazuje Ras aktivitu a expresiu proteínu v shLuc- a shILK-transfekované bunky AGS. (G) Reprezentatívny fluorescencie na báze Imunohistochemické farbenie ukazujúci koexpresi ILK (zelená
) a fosforylovaného ERK1 /2 Tyr202 /Thr204 (červená
) v ľudských nádorov žalúdka a AGS-odvodených uzliny v Balb /c myší. DAPI (modrá
) bol použitý pre jadrovú kontrastným. Dot-grafy ukazujú koexpresi uvedených proteínov. V kontrole a IQGAP1 siRNA transfekciou AGS buniek po 48 hodinách, je expresia uvedených proteínov (H), bolo preukázané, aktivácia NF-kB, a rast buniek (I). Proteínové lyzáty získané z neošetrených buniek AGS (J) alebo s zhlukoch a shILK transfekcia (L, M) boli imunoprecipitovány (IP
) s kontrolným IgG (C. IgG
) alebo s protilátkami proti ILK, IQGAP1, a Ras , Imunoblotu (IB
) ukazujú expresiu ILK, IQGAP1 a Ras. (K) Reprezentatívny fluorescencie na báze Imunohistochemické farbenie ukazujúci Spoločná expresia ILK (zelená
), IQGAP1 (červená
) a Ras (červená
) v AGS bunkách. DAPI (modrá
) bol použitý pre jadrovú kontrastným. Pre proliferáciu a aktivity luciferázy, dáta sú priemer ± SD z troch nezávislých pokusov. ** P Hotel < 0,01 a *** P Hotel < 0,001 v porovnaní s kontrolou. Vzpriamené trojuholník, zvýšená expresia; prevrátený trojuholník, znížená expresia ILK
môžete upraviť aktiváciu ERK1 /2 v raste a diferenciácie [22] buniek .; však, nebola preukázaná molekulárnej regulácie vzťahujúce sa k Ras signalizáciu [2], [3]. Spoločná expresia ILK a fosforylovaného ERK1 /2 (Tyr202 /Thr204) bola preukázaná u ľudských nádorov žalúdka a AGS odvodené uzly v Balb /c myší (obrázok 2G). ILK interaguje s IQGAP1 [7], čo je Ras GTPase aktivujúci-podobný proteín, ktorý je odlišný od GAP, ktorý transformuje Ras do neaktívneho stavu. Vzhľadom k tomu, IQGAP1 riadi Ras /MAPK signalizácie, je onkogénne [39], [40]. Expresia IQGAP proteínov rodiny zostala nezmenená v AGS a MKN45 buniek, a to aj po ILK umlčanie (ďalší súbor 5: Obrázok S4E). Avšak, umlčanie onkogénne IQGAP1, ale nie IQGAP3, (Ďalší súbor 5: Obrázok S4F-S4H) účinne inhibuje c-Raf /MEK1 //ERK1 /signalizácie 2 2 /RSK (obrázok 2 H), NF-kB aktivita a rast buniek ( obrázok 2i). Vykonaním testu coimmunoprecipitation sme ukázali potenciálny komplexné prechovávanie ILK, IQGAP1, a Ras (obr 2J). Imunologické potvrdil, že ILK bol koexprimován na úrovni podobné tým IQGAP1 a Ras (obr 2K; Ďalší súbor 6: Obrázok S5). Pozoruhodne, umlčanie ILK narušil komplex IQGAP1-Ras (obr 2L a 2M). Tieto výsledky ukázali, že ILK umožnil tvorbu komplexu IQGAP1-Ras k udržaniu Ras aktivitu.
Enzymatická ILK moduluje tvorbu IQGAP1-Ras komplexu a ERK1 /2-sprostredkované bunkovým rastom
Naše zistenia ukázali, že farmakologicky inhibícia ILK sa znížil rast buniek, čo ukazuje na zásadnú úlohu enzýmovej aktivity ILK. Ďalej inhibícia ILK genetickým prístupom narušená IQGAP1 sprostredkovanú signalizáciu Ras. Inhibičnú aktivitu ILK farmakologicky s T315 (obrázok 3A) alebo geneticky transfekcia enzymatické mutantný ILK A262V [41] (obrázok 3B), tiež narušený tvorbu komplexu IQGAP1-Ras v bunkách AGS. Tri skrátené oblasti ILK (obrázok 3C) bol nadmerne exprimovaný v bunkách MKN45, aby sa identifikovala doména nevyhnutné na udržanie komplexu IQGAP1-Ras. Coimmunoprecipitation testy preukázali, že nadmerne exprimovaný ILK konštrukty nesúci PH a katalytické doméne kinázy regióny imunoprecipitovány IQGAP1 a Ras (obrázok 3D). Z tohto dôvodu, ILK iba kinázovej doména, obsahujúce aktivované ERK1 /2 (obrázok 3e). V porovnaní s plnou dĺžkou ILK ILK ( 1-452), transfekcia mutantný ILK kinázu mŕtvy A262V nemal aktiváciu ERK1 /2 (obrázok 3F). Ďalšie experimenty ukázali, že iba ILK doménu obsahujúce kinázy zvýšila MEK1 /2-regulovaný aktiváciu NF-kB (obr 3G) a následne MEK1 /2- a NF-kB-regulované rastu buniek (obrázok 3H), v bunkách MKN45. Tieto výsledky ukázali, že enzymatická ILK sprostredkovanej tvorby komplexu Ras-IQGAP1 spúšťať ERK1 /2, a NF-kB sprostredkovanú rast buniek. Obrázok 3 Vynútená ILK expresie uľahčuje rast buniek indukuje aktiváciu ERK1 /2 /NF-kB. Proteínové lyzáty získané z buniek ošetrených s AGS T315 (A) alebo transfekciou Myc-DDK-značený mutant ILKA262V (B), boli imunoprecipitovány (IP)
s protilátkami proti ILK. Imunoblotu (IB
) ukazujú expresiu ILK, IQGAP1 a Ras. Plazmidy založené na pcDNA3.1-Flag-ILK, ktoré obsahujú full-length ILK (branže
1
-452
), fragment 171-452 (branže
171
-452
) , fragment 1-170 (ILK
1
-170
) (C), alebo Myc-DDK-značený mutant ILKA262V boli transfekovány do buniek MKN45. (D) Coimmunoprecipitation z vlajku s uvedenými proteínmi je zobrazený pomocou Western blotting. V porovnaní s pcDNA3.1-Flag (Vlajka
) iba, western bloty ukazujú expresiu fosforylovaného ERK1 /2 v Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (E, F). β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. Aktivácia NF-kB (G) a rastu buniek (H) sa zistili aj v neprítomnosti alebo v prítomnosti PD98059 a Cape. Dáta sú priemer ± SD z troch nezávislých pokusov. ** P Hotel < 0,01 v porovnaní s kontrolou. ## P Hotel <0,01 v porovnaní s ILK1-452. Vzpriamené trojuholník, zvýšená expresia. Aktivácia PI3K stroje a zníženie Ptení expresie uľahčuje aktiváciu ERK1 /2 /NF-kB stabilizáciou ILK
Vzhľadom k tomu, ILK je závislá na PI3K sprostredkované generácia PIP3 pre jeho aktiváciu [4], rastového faktora a integrín sprostredkované PI3K aktivácie alebo PI3K mutácie v bunkách AGS [37] by mohli prispieť k branže expresiu a aktiváciu. V porovnaní s rastom buniek MKN45, rast buniek AGS bol ovplyvnený zvýšenými IL-6 úrovní [42], a vyjadrenie D1 a P3 integrínu nemal zvyšovať (ďalší súbor 7: Obrázok S6). Ďalej bolo potvrdené, že generácia PIP3 bola vyššia v bunkách AGS PI3K-mutované (obrázok 4A). Preskúmať vzťahy medzi PI3K, podobní, a Ras signálnych dráh, sa AGS bunky boli ošetrené s MEK1 /2, PI3K, ILK alebo Ras inhibítor pre rôzne časové obdobie. V 6 hodín po ošetrení, T315 mierne inhibuje MEK1 /2 a ERK1 /2 fosforyláciu (dodatočný súbor 8: Obrázok S7). Po 24 hodinách po ošetrení, PI3K inhibícia narušený ILK výraz, ktorý bol nasledovaný MEK1 /2 /ERK1 /2 deaktivácia 24 hodín po ukončení liečby (pozri obrázok 4B). Avšak, inhibícia Ras nemal deaktivovať Akt alebo ILK v AGS bunkách, hoci Ras môže sprostredkovať PI3K aktiváciu [27]. Podobne ako branže-umlčaný AGS buniek, a to MKN45 a LY294002 stimulovanej AGS bunky, vykazovali zníženou aktivitou Ras (obr 4C). Inhibítor preklad cykloheximid uľahčil LY294002 indukované ILK zníženie expresie (obrázok 4D) a inhibítor proteasomu MG132 zvrátiť vyššie uvedené účinky a ERK1 /2 inaktivácie (Obrázok 4E). Tumor supresorové fosfatáza Ptení negatívne reguluje PI3K /PDK1 /Akt signálne [10], [11] a ILK aktivitu [8], [9], a AGS bunky vykazovali nízku expresiu Ptení (obrázok 2A) [43]. Vynútená expresia Ptení v AGS bunkách nielen tlmí konštitutívny fosforylácii PDK1, Akt a PAK1, ale tiež inhibuje ILK výraz, ERK1 /2 fosforylácie (obr 4F), a aktiváciu NF-kB (obr 4G). Tieto výsledky ukazujú, že aktivácia PI3K a zníženie Ptení expresie ILK stabilizovať pre reguláciu aktivácie ERK1 /2 /NF-kB. Obrázok 4 aktivácia PI3K a zníženie Ptení expresie uľahčiť ERK1 /2 /NF-kB aktivácia cez stabilizáciu ILK. (A) PIP3 Mass ELISA Kit sa určovali aktivity PI3K meraním množstva PIP3 získané z neošetrených AGS a MKN45 buniek a z buniek ošetrených s AGS LY294002 po dobu 24 hodín. (B) AGS bunky boli ošetrené s PD98059, LY294002, T315, alebo Ras inhibítor SLR-277 po uvedenej doby. Western bloty ukazujú expresiu uvedených proteínov. β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. (C) Ras aktivita bola zistená v AGS, MKN45 a LY294002 ošetrené AGS buniek po 24 hodinách. Western bloty ukazujú expresiu uvedených proteínov v bunkách AGS vopred ošetrených s inhibítorom preklad cykloheximid (CHX
), (d) alebo inhibítora proteasomu MG132 (E) po dobu 0,5 hodiny a potom sa spracuje s LY294002 po dobu 24 hodín. Ptení bol nadmerne exprimovaný v bunkách AGS pomocou pcDNA3.1-GFP-Ptení (Ptení
). Western bloty ukazujú expresiu uvedených proteínov, v porovnaní s pcDNA3.1-GFP (Vector
) transfekcia (F), a NF-kB aktivácia (G) bol tiež určený. Pre kinázy a aktivity luciferázy, dáta sú priemer ± SD z troch nezávislých pokusov. * P
menšie ako 0,05, ** P
< 0,01 a *** P Hotel &0,001 v porovnaní s kontrolou. Vzpriamené trojuholník, zvýšená expresia; prevrátený trojuholník, znížená expresia.
HSP90 spojené s E3 ligázu CHIP negatívne ovládacie prvky stabilizácie ILK, ERK1 /2 /NF-kB aktivácia a rast buniek
ďalšom overovanie mechanizmus stojaci ILK destabilizácii Naše výsledky ukazujú, že inhibícia AKT neovplyvnilo ILK stabilitu, zatiaľ čo inhibícia PI3K ovplyvnený ILK stability (ďalší súbor 9: Obrázok S8). HSP90 bol ďalší skúmaná, pretože to môže spôsobiť zníženie ILK [25]. Podobné výsledky inhibícia PI3K, zhrnie báze (obrázok 5A), alebo farmakologické inhibícia HSP90 (Ďalší súbor 10: Obrázok S9A) oneskorenie nielen PDK1 /Akt fosforylácie, ale i c-Raf //aktivácia MEK1 /2 ERK1 /2 po ILK degradácii. Okrem toho geneticky alebo farmakologicky inhibíciu HSP90 reakciou s 17-AAG alebo inhibítora HDAC SAHA, ktorý chytí HSP90 v acetylovaného, ​​enzymaticky neaktívna, oslabený NF-kB aktivita (Obrázok 5B, ďalší súbor 10: Obrázok S9B) a bunkového rastu ( obrázok 5C). Cotreatment s MG132 zachránil účinkami 17-AAG (obrázok 5D) a SAHA na degradáciu ILK a ERK1 /2 deaktiváciu (ďalší súbor 10: Obrázok S9C). V bunkách MKN45, liečba MG132 zvýšenej expresii ILK, MEK1 /2 a ERK1 /2 fosforyláciu (ďalší súbor 11: Obrázok S10), a aktiváciu NF-kB (dáta nie sú uvedené). Coimmunoprecipitation preukázala tvorbu HSP90-ILK komplexu (dáta nie sú ukázaná). Použitie Zhrnieme prístupu lentivirálním báze (obr 5E), HSP90, spojené E3 ligázu, vrátane čipu, Cullin 4A a 4B Cullin [26], [44], [45], boli skúmané pre ich úloha v degradácii ILK. Výsledky ukázali, že iba umlčanie CHIP zachránil degradácii ILK a ERK1 /2 (Obr inaktiváciu 5F), NF-kB (obr deaktivácia 5 g), a inhibícia rastu buniek (obrázok 5H) po farmakologické inhibícia PI3K a HSP90. CHIP bol vyžadovaný pre ILK ubikvitinace v LY294002 ošetrených AGS bunkách (obr 5i). Tieto výsledky ukázali, že HSP90 /CHIP signalizácia reguluje PI3K sprostredkovanej stabilizácii ILK a aktiváciu ILK-regulované ERK1 /2 /NF-kB a tak umožňuje bunkový rast. Obrázok 5 CHIP určuje ILK destabilizácii, ERK1 /2 /NF-kB inaktivácie, a potom, čo rast buniek inhibícia PI3K /HSP90 inaktiváciu. AGS bunky boli transfekovány zhlukoch alebo shHSP90 alebo vopred s HSP90 inhibítora 17-AAG (0,1 uM) po dobu 48 hodín. Western bloty ukazujú expresiu uvedených proteínov (A), a aktiváciu NF-kB (B) a rastu buniek (C) boli tiež stanovené. (D) MG132 predspracovanie (0,5 h) obrátil ILK výraz a fosforylovaného ERK1 /2 v Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) v 17-AAG ošetrených AGS buniek. (E) CHIP, Cullin 4A a 4B Cullin boli umlčaní v AGS bunkách shRNAs. Zhrnieme-transfekované bunky boli ošetrené s LY294002 alebo 17-AAG po dobu 24 hodín. Western blot ukázala expresiu ILK a fosforylovaného ERK1 /2 v Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (F), a aktiváciu NF-kB (G) a rastu buniek (H), boli tiež stanovené. (I) v shLuc- a shCHIP-transfekciou buniek AGS ošetrených LY294002, ILK sa imunoprecipitáciou a jeho ubiquitylation sa sonduje. Pre analýzu Western blot, β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. Pre aktivitu luciferázy a rastu buniek, dáta sú priemer ± SD z troch nezávislých pokusov. ** P Hotel < 0,01 a *** P Hotel < 0,001 v porovnaní s kontrolou. ## P Hotel < 0,01 a ### P Hotel < 0,001 v porovnaní s zhlukoch alebo DMSO. NS: nevýznamný. Vzpriamené trojuholník, zvýšená expresia; obrátený trojuholník, znížená expresia.
PI3K /HSP90 /čipu /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-kB signalizácia prispieva k bunkovej migrácie a citlivosť na 5-FU a cisplatiny
Zvýšená ILK aktivitu alebo expresiu by mohla upravovať onkogénne procesy, vrátane bunkovej proliferácie, migrácie, a prežitia [3], [6]. Študovali sme možnom zapojení identifikovaného PI3K /HSP90 /CHIP /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-kB signálne dráhy vo výhodách bunkového rastu. V porovnaní s bunkami MKN45, že AGS bunky preukázali zvýšenú migračnú aktivitu; Avšak, ILK alebo IQGAP1 výrazne umlčanie (P Hotel < 0,001) zrušil migráciu buniek (Ďalší súbor 12: Obrázok S11A). Farmakologicky blokuje PI3K /HSP90 /ILK /MEK1 /2 /NF-kB signalizácie v bunkách AGS tiež významne (P Hotel &0,001) oslabený migračnej schopnosti (Ďalší súbor 12: Obrázok S11B), a CHIP značne porazený obrátený inhibičný účinky spôsobené inhibíciou PI3K a HSP90 (obrázok 6A, ďalší súbor 12: obrázok S11C). Tieto prípravky účinné proti rakovine 5-FU a cisplatiny sú bežne používané v liečbe rakoviny žalúdka [46]. Spracovaním AGS buniek s 5-FU alebo cisplatinou, a to najmä po ILK alebo IQGAP1 umlčanie, spôsobené zvýšenú náchylnosť k apoptóze (obrázok 6B). T315 zvýšená citlivosť buniek AGS 5-FU a cisplatinou (ďalší súbor 12: Obrázok S11D). Farmakologicky inhibíciu PI3K /HSP90 /ILK /MEK1 /2 /NF-kB signalizácia tiež citlivé na AGS buniek k 5-FU-indukovanej apoptózy (Obrázok 6c), vzhľadom k tomu, CHIP umlčanie retardovaný synergické účinky LY294002 a 17-AAG na 5-FU indukovaná apoptóza (obrázok 6D). Naproti tomu, nadmerná expresia ILK obsahuje katalytickú kinázovej doménu, vrátane ILK 1-452 a ILK 171-452, lepšia MEK1 /2 /NF-kB-regulované migrácia buniek (obrázok 6E) a prežívanie buniek po liečba 5-FU (Obrázok 6F). Tieto výsledky naznačili spoločné účinky ILK a IQGAP1 o aktiváciu ERK1 /2 /NF-kB pre migráciu a prežitie buniek. Obrázok 6 PI3K /HSP90 /čipu /ILK /ERK1 /2 /NF-kB signalizácia určí, migráciu buniek a reguluje náchylnosť k protirakovinovými liekmi 5-FU a cisplatiny. (A) aktivita Migrácia bola testovaná v shLuc- alebo shCHIP-transfekciou buniek AGS ošetrených LY294002 (25 pM) a 17-AAG (0,2 uM) po dobu 12 hodín. zhlukoch, kontrolné siRNA alebo DMSO boli použité ako negatívne kontroly. sú uvedené počty migrovaných buniek v pozorovanej oblasti. PI farbenie nasleduje analýzu prietokovou cytometriou ukázalo, 5-budúcnosť alebo cisplatinou indukovanú apoptózu po dobu 2 dní v shILK- alebo siIQGAP1-transfekciou buniek AGS (B), AGS bunky vopred ošetrené s uvedenými inhibítormi po dobu 0,5 hodiny (C), a shLuc- alebo shCHIP prenesené AGS buniek ošetrených LY294002 alebo 17-AAG (D). zhlukoch, kontrolné siRNA alebo DMSO boli použité ako negatívne kontroly. Plazmidy založené na pcDNA3.1-Flag-ILK, ktoré obsahujú full-length ILK (branže
1
-452
), fragment 171-452 (branže
171
-452
) alebo fragment 1-170 (branže
1
-170
) boli transfekovány do buniek MKN45. V porovnaní s pcDNA3.1-Flag (Flag
) iba, migráciu buniek (E) a apoptóze vyvolanej 5-FU (5 uM) (F) boli zistené v neprítomnosti alebo v prítomnosti PD98059 a Cape. Dáta sú priemer ± SD z troch nezávislých pokusov. * P
menšie ako 0,05, ** P
< 0,01 a *** P Hotel &0,001 v porovnaní s kontrolou. #P Hotel < 0,05, ## P Hotel < 0,01 a ### P Hotel < 0,001 v porovnaní s kontrolou. NS :. Nevýznamné
EGFR signalizácie reguluje ILK /IQGAP1 k aktivácii ERK1 /2, NF-kB a bunkovú migráciu a proliferáciu
Ak chcete overiť úlohu IQGAP1-sprostredkovanej aktivácii ILK /ERK1 /2 a NF-kB β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. * P Hotel < β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. * P Hotel < β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. ** P Hotel < * P Hotel <

• Kombinované funkcie založené na MT1-MMP expresie, hustota CD11b + imunocyty a LNR predpovedať klinické výsledky rakoviny žalúdka
• Charakteristika Vírus Epstein-Barrovej variantoch, ktoré sú spojené s karcinómom žalúdka v južnom Tunisku