Un aumento de la integrina-quinasa vinculadas confiere no-canónicamente ventajas de crecimiento mediada por NF-kB en células de cáncer gástrico mediante la activación de ERK1 /2

un aumento de la integrina-quinasa vinculadas no canónicamente confiere ventajas de crecimiento mediada por NF-kB en las células de cáncer gástrico por la activación de ERK1 /2
Abstract
Antecedentes
aumento de la actividad o la expresión de la integrina-quinasa vinculada (CIC), que regula la adhesión celular, la migración, y la proliferación, conduce a la oncogénesis. Se identificaron las bases moleculares de la regulación de la CIC y su papel alternativo para conferir ERK1 /2 /NF-kappa B mediada ventajas de crecimiento de células de cáncer gástrico.
Resultados
CIC inhibidora con ARN de horquilla corta o T315, un putativo inhibidor de ILK, abolió NF-B mediada por el crecimiento de las células de cáncer gástrico AGS humanos, SNU-1, MKN45, y GES-1. De ILK estimuló la actividad Ras para activar el c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /ribosomal S6 quinasa /inhibidor de la señalización de κBα /NF-kB, facilitando la formación de la IQ proteína GTPasa de la activación que contiene motivo-1 (IQGAP1) - complejo Ras. expresión de ILK enzimática forzada promovió el crecimiento celular, facilitando la señalización ERK1 /2 /NF-kB. la activación de PI3K o disminución de la expresión de PTEN prolongada activación de ERK1 /2 mediante la protección de la ILK de la degradación mediada por el proteosoma. C-terminal de cognado de choque térmico 70 interacción de proteínas, un E3 ubiquitina ligasa HSP90-asociado, mediada por la ubiquitinación de ILK para el control de PI3K- y estabilización de ILK regulado HSP90 y señalización. Además del crecimiento celular, la vía identificado promueve la migración celular y la reducción de la sensibilidad de células de cáncer gástrico a los agentes contra el cáncer 5-fluorouracilo y cisplatino. Además, la administración exógena de EGF, así como la sobreexpresión de EGFR activan ERK1 /2 /NF-kB activación, el crecimiento celular, y la migración regulada IQGAP1 ILK- y.
Conclusión
Un aumento de la ILK no canónicamente promueve ERK1 /2 /activación de NF-kappa B y conduce al crecimiento de células de cáncer gástrico.
Palabras clave
el crecimiento celular de ILK IQGAP1 ERK1 /2 Antecedentes NK-kappa B quinasa vinculada
-integrina (CIC), un 59-kDa serina /treonina quinasa, interactúa directamente con el dominio citoplásmico de integrina β1 [1]. CIC comprende tres dominios: N-terminal de anquirina (ANK) se repite, una homología pleckstrin central (PH) -como de dominio, y un dominio C-terminal quinasa [2], [3]. célula-matriz extracelular mediada por la integrina (ECM) de adhesión o factores de crecimiento activan la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) para fosforilar unida a membrana PI 4,5-bifosfato (PIP2) y generar PI 3,4,5-trifosfato (PIP3), que se une al dominio PH-como de la ILK y activa de ILK [4], [5]. Después de la activación de la ILK, el dominio de quinasa C-terminal de la ILK se puede unir a varias proteínas, incluyendo AKT, affixin, β-Parvin, glucógeno sintasa quinasa (GSK) -3β, calponin proteína de unión ILK-que contiene homología, la 20-kDa regulador cadenas ligeras de la miosina (LC20), la subunidad miosina-focalización de fosfatasa de la cadena ligera de la miosina (MYPT1), paxillin, α-NAC, y los inhibidores de la proteína fosfatasa PHI-1, KEPI, y CPI-17 [2], [3] , [6], [7]. Las repeticiones ANK N-terminales median en la interacción de la ILK con ILKAP, un miembro de la familia de la proteína fosfatasa 2C, y una pizca, un adaptador de proteínas de dominio de sólo LIM. De ILK puede ser considerado una proteína PIP3-interactuar aguas abajo de PI3K; sus efectos están bloqueados por la fosfatasa y tensina suprimido homólogo en el cromosoma 10 (PTEN) [8], [9]. PTEN suprime tumores por dephosphorylating PIP3 [10], [11]
de ILK juega un papel vital en la regulación de varios procesos celulares, incluyendo la proliferación, la supervivencia, la migración, la progresión del ciclo celular y la angiogénesis.; aumento de la actividad o la expresión de la ILK conduce a la oncogénesis [2], [3]. Además de la modulación de sus proteínas asociadas a los procesos celulares, CIC está la hipótesis de participar en una red de transducción de señales intracelulares. Mecánicamente, la ILK fosforila directamente AKT en Ser473 y GSK-3β en Ser9 [4], [9] para mediar translocación β-catenina y regular AP-1 de expresión para la proliferación de células tumorales [12]. la activación de NF-kappa B es esencial para procesos oncogénicos ILK mediada, como la actividad anti-apoptótica [13], la promoción de la supervivencia [14], epitelio-mesenquimal transición [15], extensión celular y resistencia a la apoptosis [16], angiogénesis [17 ], y la migración, invasión y metástasis [18] - [20]. Además, se requiere la activación de NF-kB para la regulación canónica de IKK y IKKß por la vía de la ILK /AKT. Para desencadenar la migración celular, la ILK puede activar el pequeñas GTPasas RAC y Cdc42 [21]. Además, la ILK regula ERK1 /2 de activación en la diferenciación miogénica [22]. expresión de microARN-143 y microARN-145 aumentado, que tienen como objetivo la ILK, inhibe la Akt y ERK1 /2 vías [23]. Sin embargo, la ILK-mediada subyacente activación mecanismo molecular ERK1 /2 sigue siendo desconocido. México La estimulación de las células por factores de crecimiento y citoquinas, así como la interacción celular con la actividad de la ILK aumento ECM [24]. Además de la regulación molecular de la PI3K /PTEN por CIC, Aoyagi et al. De ILK identificado como una proteína de cliente nueva proteína de choque térmico (HSP) 90 y se encontró que la inhibición de HSP90 farmacológicamente dio lugar a la degradación de ILK en una manera dependiente de proteasoma [25]. Además, la HSP90 asociada E3 ubiquitina ligasa C-terminal de cognado de choque térmico 70 proteína de interacción (CHIP) causa la degradación de ILK [26]. Hashiramoto et al. demostró que HSP90 estabiliza la ILK y AKT y ERK1 /2 activación [16] sostenida. Por lo tanto, se especula una relación entre la estabilidad de ILK y la activación de sus quinasas aguas abajo. vía de señalización Ras /MAPK es esencial para la tumorigénesis [27]. El aumento de expresión de ILK se relaciona con cáncer de alto grado gástrico [28], el cáncer de próstata [29], y el cáncer no microcítico de pulmón de células [30], aunque las células de estos cánceres comúnmente albergan mutaciones Ras [31] - [33]. Orientación de la ILK con siRNA disminuye la invasión del cáncer gástrico celular, la proliferación y el crecimiento a través de un mecanismo desconocido [34]. En cuanto a la posibilidad de que la ILK actúa aguas arriba de NF-kappa B mediante el control de IKK [13], que ha sido implicado en la tumorigénesis gástrico [35], de ILK se especula para activar el crecimiento celular a través de una ruta de NF-kappa B-regulado. El uso de células de cáncer gástrico (AGS, MKN45, y SNU-1), se estudió la regulación molecular de la ILK y identificado una vía no canónica de ILK-regulada activación ERK1 /2 para el crecimiento de células de cáncer gástrico mediada por NF-kappa B, la migración, y la supervivencia promoción.
resultados
actividad de la ILK y expresión son esenciales para aumento de la actividad o la expresión de la ILK crecimiento celular
mediada por NF-kappa B aumenta la tumorigénesis mediante la promoción de crecimiento celular [6]. basado en RNAi silenciamiento de ILK atenúa el crecimiento de células de cáncer gástrico [34], mientras que la sobreexpresión de ILK está relacionado con la tumorigénesis gástrico [28]. En los tumores gástricos humanos y nódulos AGS-derivados en ratones BALB /c, Ki-67-positivas las células proliferantes CIC coexpressed como lo demuestra la fluorescencia basada en la inmunotinción (Figura 1A) y la inmunotinción a base de AEC (archivo adicional 1: materiales y métodos suplementarios; la disposición 2: Figura S1) experimentos. Para investigar los posibles mecanismos de crecimiento celular del cáncer gástrico CIC mediada subyacente, varias líneas de células epiteliales gástricas se caracterizaron de acuerdo a sus diferentes velocidades de crecimiento celular, que eran más altos para los AGS y células SNU-1 e inferior para el MKN45 y células GES-1 , y se utiliza en este estudio (archivo adicional 3: Figura S2A). En comparación con las células MKN45, el AGS y células SNU-1 también había una expresión elevada CIC (archivo adicional 3: Figura S2B y S2C). A shRNA basado en lentiviral se utilizó para silenciar la ILK
genéticamente en los AGS, SNU-1, MKN45, y GES-1 gástricos células epiteliales (Figura 1B, panel superior), así como en A549 y células de adenocarcinoma de pulmón humano H1975, las células tubulares proximales renales epiteliales humanas THP-1 células monocíticas humanas (: Figura S2D disposición 3) 2 HK-y. En estas células, la ILK silenciar significativamente (P
< 0,05) disminución del crecimiento celular (Figura 1B; archivo adicional 3: Figura S2E). Además, el tratamiento de células con el inhibidor de ILK T315 [36] de manera significativa (P
< 0,05) y el crecimiento celular retardada (Figura 1C) sin citotoxicidad dependiente de la dosis (datos no mostrados). Además, la disminución de la formación de colonias se observó en células AGS-ILK silenciada (archivo adicional 3: Figura S2F). Por lo tanto, el silenciamiento de genes (archivo adicional 3: Figura S2G) y métodos farmacológicos (archivo adicional 3: Figura S2H) para suprimir la actividad de la ILK o sobreexpresión dado lugar a la detención del ciclo celular en el G 1 fase. Estos resultados muestran un papel de promoción del crecimiento de la ILK. Figura 1 la expresión de ILK es necesaria para el crecimiento celular y la activación de NF-kB. (A) Representante tinción inmunohistoquímica basada en fluorescencia muestra la coexpresión de la ILK (verde
) y Ki-67 (rojo
) en tumores gástricos humanos y nódulos derivados de AGS en ratones BALB /c. DAPI (azul
) se utilizó para la contratinción nuclear. CIC + Ki-67 + células en las secciones de tejido teñidas immunofluorescently se presentan como punto-parcelas de un análisis FACS-como mediante el uso de software de TissueQuest. Las células se calcularon como el porcentaje y el número de células de las células totales (células DAPI +) por campo. (B) transferencia de Western de la expresión de ILK en células transfectadas con shRNAs orientación de ILK (shILK
) o un control de luciferasa (shLuc
). β-actina se utilizó como control interno. ensayo basado en WST-8 muestra la inhibición del crecimiento celular en células de ILK-silenciada. (C) El efecto dependiente de la dosis de la T315 inhibidor de ILK en la inhibición del crecimiento de células AGS. (D) Representante tinción inmunohistoquímica basada en fluorescencia muestra la coexpresión de CIC (verde
) y fosforilados Ser536 NF-B (rojo
) en los tumores gástricos humanos y nódulos derivados de AGS en ratones. DAPI (azul
) se utilizó para la contratinción nuclear. Las tramas de puntos curvas muestran la co-expresión de la ILK y NF-kB Ser536. El análisis de regresión (E) logística mostró una correlación entre la CIC, fosforilada NF-kB Ser536, y Ki-67 en 93 muestras de cáncer gástrico probadas. P
valores R cuadrado (R
2) y se muestran. (F) EMSA que demuestra la activación de NF-kB. ensayo de indicador (G) Luciferase muestra la relación entre la activación de NF-KB para controlar Renilla luciferasa en las células tratadas con el inhibidor de NF-kappa B CAPE (25 mg /ml). (H) El crecimiento de las células tratadas 25 g /ml CABO-AGS. (I) la activación de NF-kB en las células o shLuc- shILK transfectadas. (J) la activación de NF-KB después de 6 h de tratamiento T315 en células AGS. Para el crecimiento celular, la formación de colonias y la actividad de luciferasa, los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes. * P
< 0,05, ** P
< 0,01, y *** P
< 0,001 en comparación con el día 0 o el control relativo. #P Hotel < 0,05, P ## Hotel < 0,01, y ### P
. ≪ 0,001 en comparación con shLuc
Para caracterizar las características de crecimiento de las células CIC-regulada, NF se examinó la señalización kappa B porque la ILK puede actuar aguas arriba de NF-kappa B mediante el control de IKK [13]. Por la inmunotinción, se observó la co-expresión de la ILK y fosforilados NF-kappa B (Ser536) en los tejidos gástricos humanos y de ratón (Figura 1D), y su coexpresión significativamente (P
< 0,01) y se correlacionó positivamente con el número de células proliferantes , que se indica por 55 casos de triple positivos sobre el total de 93 muestras de cáncer gástrico (Figura 1E; archivo adicional 4: Figura S3). La inmunotinción para la translocación nuclear de NF-kB (archivo adicional 3: Figura S2I), EMSA (Figura 1F), y promotor de ensayos (Figura 1G) confirmaron la activación constitutiva de NF-kB en las células AGS, pero no en las células MKN45. El tratamiento de las células con el inhibidor de NF-kB CABO significativamente (P Hotel < 0,001) reducción de la activación de NF-kappa B (Figura 1G) y el crecimiento celular (Figura 1H). De cualquier CIC silenciamiento (Figura 1I; la disposición 3: Figura S2J) o tratamiento T315 (Figura 1J) significativamente (P Hotel < 0,05) detuvo la actividad de NF-kB. Estos resultados demostraron que la ILK es indispensable para el crecimiento celular en las líneas celulares ensayadas, ya que facilita la activación de NF-kappa B en los cánceres gástricos.
De ILK regula la actividad Ras, facilitando el complejo de IQGAP1-Ras para controlar MAPK activadas por NF-kappa B
Dado que las células AGS albergan PIK3CA y KRAS

mutaciones [37], se examinaron los posibles efectos reguladores de la ILK en la modulación de la actividad de NF-kB por estas quinasas 2 [38]. El uso de un Kit de matriz humano fosfo-MAPK, se identificaron 10 quinasas que fueron más altamente expresado en las células AGS que en las células MKN45. Estas quinasas mayoría actuaron aguas abajo de las vías de señalización de PI3K y MAPK (archivo adicional 5: Figura S4A). Mediante transferencia Western, se confirmó un aumento de la fosforilación de AKT, ERK1 /2, y I? B? Acompañado por la degradación de I? B? En las células AGS (Figura 2A). La inhibición farmacológica de c-Raf, MEK1 /2, y PI3K significativamente (P
< 0,05) la reducción del crecimiento celular (Figura 2B), I? B? Fosforilación (Ser32) y la degradación (Figura 2C), y la actividad de NF-kappa B ( Figura 2D), indicando que tanto PI3K- y Ras-activación de vías de señalización facilitado la activación de NF-kB. Los efectos de la ILK se han estudiado ampliamente debido a sus interacciones con crecimiento- celular y AKT asociada a NF-kB [4], [9]. Sorprendentemente, el silenciamiento de ILK no afectó AKT y la fosforilación de GSK-3β en el AGS y células SNU-1, pero redujo notablemente c-Raf y ERK1 /2 activación en todas las células ensayadas (Figura 2E, la disposición 5: Figura S4B). Sin desactivación AKT, evaluamos una vía alternativa para la activación de NF-kB a través de un mecanismo que implica la MAPK /p90rsk /I? B? Señalización [38]. La caída de la ILK
reduce la fosforilación múltiplo de RSK (Thr573, Thr359 /Ser363, Ser380 y) y la fosforilación de I? B? (Ser32) y el aumento de la acumulación de I? B? (Figura 2E). La inhibición de MEK1 /2 causó efectos similares (archivo adicional 5: Figura S4C) y una detención del ciclo celular en el G 1 fase (archivo adicional 5: Figura S4D). Un ensayo de pull-down Ras reveló que la inhibición de la ILK causada Ras desactivación sin afectar a la estabilidad de la proteína Ras (Figura 2F). Estos resultados demostraron una potencial vía no canónica de CIC para modular NF-kB mediante la regulación de la señalización de Ras /c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /I? B. Figura 2 CIC-IQGAP1-Ras complejo sustenta la actividad de Ras para activar c-Raf /2 señalización MEK1 //ERK1 /2 /RSK /I? B? /NF-? B. (A) Western blot de las proteínas indicadas en células AGS y MKN45. β-actina se utilizó como control interno. Se evaluaron las células AGS tratados con inhibidores de c-Raf GW5074, MEK1 /2 inhibidores U0126 o PD98059, o inhibidor de PI3K LY294002 durante 48 h para su crecimiento (B), la fosforilación de I? B? en Ser32 (pI? B?
) y proteína total (C ), y la activación de NF-kappa B (D). (E) En shLuc- o células transfectadas shILK, transferencias Western muestran la expresión de las proteínas indicadas. β-actina se utilizó como control interno. ensayo de activación (F) muestra la actividad de Ras Ras y expresión de proteínas en células AGS y shLuc- shILK transfectadas. (G) Representante tinción inmunohistoquímica basada en fluorescencia que muestra la coexpresión de la ILK (verde
) y ERK1 fosforilados /2 Tyr202 /Thr204 (rojo
) en tumores gástricos humanos y nódulos derivados de AGS en ratones BALB /c. DAPI (azul
) se utilizó para la contratinción nuclear. Las tramas de puntos curvas muestran la co-expresión de las proteínas indicadas. En el control y las células AGS transfectadas con siRNA IQGAP1 a las 48 h, la expresión de las proteínas indicadas (H), se demostró que la activación de NF-kB, y el crecimiento celular (I). Proteína lisados ​​extraídos de células AGS no tratados (J) o con shLuc y transfección shILK (L, M) se inmunoprecipitaron (IP
) con IgG de control (C IgG
) o con anticuerpos contra la ILK, IQGAP1, y Ras . Inmunotransferencias (IB
) muestran la expresión de la ILK, IQGAP1, y Ras. (K) Representante tinción inmunohistoquímica basada en fluorescencia que muestra la co-expresión de la ILK (verde
), IQGAP1 (rojo
), y Ras (rojo
) en células AGS. DAPI (azul
) se utilizó para la contratinción nuclear. Para la proliferación y la actividad luciferasa, los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes. ** P
< 0,01 y *** P
< 0,001 en comparación con el control. triángulo en posición vertical, el aumento de expresión; triángulo invertido, disminución de la expresión de ILK
puede modificar la activación de ERK1 /2 bajo crecimiento y diferenciación celular [22].; sin embargo, la regulación molecular relacionada con la señalización de Ras no se ha documentado [2], [3]. La co-expresión de la ILK y ERK1 fosforilados /2 (Tyr202 /Thr204) se demostró en tumores gástricos humanos y nódulos AGS-deriva en ratones BALB /c (Figura 2G). De ILK interactúa con IQGAP1 [7], un Ras GTPasa de la activación como proteína que es diferente de GAP, que transforma Ras a su estado inactivo. Debido IQGAP1 controla la señalización Ras /MAPK, es oncogénico [39], [40]. La expresión de proteínas de la familia IQGAP se mantuvo sin cambios en el AGS y MKN45 células, incluso después de silenciamiento CIC (archivo adicional 5: Figura S4E). Sin embargo, silenciando oncogénico IQGAP1, pero no IQGAP3, (archivo adicional 5: Figura S4F-S4H) inhibió de manera efectiva-Raf c ///2 señalización ERK1 /2 /RSK MEK1 (Figura 2 H), la actividad de NF-kappa B, y el crecimiento celular ( la figura 2I). Mediante la realización de un ensayo de coimmunoprecipitation, hemos demostrado un potencial de ILK la acogida complejo, IQGAP1, y Ras (Figura 2J). La inmunotinción confirmó que la ILK se coexpressed en niveles similares a los de IQGAP1 y Ras (Figura 2K; la disposición 6: Figura S5). En particular, el silenciamiento de ILK interrumpido el complejo IQGAP1-Ras (Figura 2L y 2M). Estos resultados demostraron que la ILK facilitó la formación del complejo Ras-IQGAP1 para mantener la actividad Ras.
De ILK enzimática modula la formación de la IQGAP1-Ras complejo y ERK1 /2 mediada por el crecimiento celular
Nuestros resultados mostraron que la inhibición de farmacológicamente CIC disminuyó el crecimiento celular, lo que indica el papel esencial de la actividad enzimática de la ILK. Además la inhibición de la ILK por el enfoque genético interrumpe la señalización de Ras mediada por IQGAP1. La inhibición de la actividad de la ILK farmacológicamente con T315 (Figura 3A) o genéticamente por transfección de la CIC mutante enzimática A262V [41] (Figura 3B) también interrumpió la formación del complejo IQGAP1-Ras en las células AGS. Tres regiones truncadas de la ILK (Figura 3C) se sobreexpresa en las células MKN45 para identificar el dominio esencial para sostener el complejo IQGAP1-Ras. Los ensayos demostraron que coimmunoprecipitation CIC sobreexpresada construye albergar PH y regiones del dominio quinasa catalíticos inmunoprecipitadas con IQGAP1 y Ras (Figura 3D). Por lo tanto, la ILK única quinasa que contiene el dominio activa ERK1 /2 (Figura 3E). En comparación con el CIC de longitud completa (CIC 1 a 452), la transfección de CIC mutante quinasa-muerta A262V no activaba ERK1 /2 (Figura 3F). Experimentos adicionales demostraron que sólo la ILK contiene el dominio de quinasa regulada aumentó-2 MEK1 /activación de NF-kappa B (Figura 3G) seguido de MEK1 /2 y el crecimiento celular regulados por el NF-kappa B (Figura 3H) en las células MKN45. Estos resultados mostraron que la ILK enzimática mediada la formación del complejo Ras-IQGAP1 para activar ERK1 /2 y el crecimiento celular mediada por NF-kB. Figura 3 forzada expresión de ILK facilita el crecimiento celular mediante la inducción de la activación de ERK1 /2 /NF-kB. lisados ​​de proteína extraída de las células AGS tratados con T315 (A) o transfectadas con Myc-DDK-tagged ILKA262V mutante (B) se inmunoprecipitaron (IP
) con anticuerpos contra la ILK. Inmunotransferencias (IB
) muestran la expresión de la ILK, IQGAP1, y Ras. Los plásmidos basados ​​en pcDNA3.1-Flag-CIC que contienen de larga duración (CIC ILK
1 | -452
), fragmento 171-452 (CIC 171

-452
) , fragmento 1-170 (CIC
1 | -170
) (C), o Myc-DDK-etiquetados mutante ILKA262V se transfectaron en células MKN45. (D) coimmunoprecipitation de la bandera con las proteínas indicadas se muestra mediante Western Blot. En comparación con pcDNA3.1-Flag (Bandera
) solamente, transferencias Western muestran la expresión de fosforilados ERK1 /2 en Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (E, F). β-actina se utilizó como control interno. la activación de NF-kappa B (G) y el crecimiento celular (H) también fueron detectados en la ausencia o presencia de PD98059 y el cabo. Los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes. ** P
< 0,01 en comparación con el control. ## P
< 0,01 en comparación con ILK1-452. triángulo en posición vertical, el aumento de expresión.
activación de PI3K y la disminución de la expresión de PTEN facilitar la activación /2 /NF-kB ERK1 mediante la estabilización de la ILK
Debido a la ILK es dependiente de la generación de PIP3 mediado por PI3K para su activación [4], factor de crecimiento y la activación de PI3K mediada por la integrina o una mutación de PI3K en las células AGS [37] podrían contribuir a la iLK expresión y activación. En comparación con el crecimiento de las células MKN45, el crecimiento de las células AGS no fue afectado por elevados niveles de IL-6 [42], y la expresión de beta 1 y beta 3 integrinas no aumentó (archivo adicional 7: Figura S6). Se confirmó, además, que la generación de PIP3 fue mayor en las células AGS PI3K-mutado (Figura 4A). Para explorar las relaciones entre las vías PI3K, ILK, y de señalización Ras, las células AGS se trataron con la MEK1 /2, PI3K, de ILK, o Ras inhibidor para diferentes duraciones. A las 6 horas después del tratamiento, T315 inhibió ligeramente MEK1 /2 y ERK1 /2 fosforilación (archivo adicional 8: Figura S7). A las 24 h después del tratamiento, la inhibición de PI3K interrumpido la expresión de ILK, que fue seguido por MEK1 24/2 /ERK1 /2 h después del tratamiento de desactivación (Figura 4B). Sin embargo, la inhibición de Ras no desactivar AKT o de ILK en las células AGS, aunque Ras puede mediar la activación de PI3K [27]. Ras actividad similar a las células AGS-ILK silenciada, tanto en células AGS LY294002 estimulada MKN45 y demostraron una reducción (Figura 4C). La cicloheximida inhibidor de traducción facilitado downregulation LY294002 inducida por la ILK (Figura 4D) y el inhibidor de proteasoma MG132 invirtió el efecto antes mencionado y ERK1 /2 inactivación (Figura 4E). El supresor de tumor la fosfatasa PTEN regula negativamente PI3K /PDK1 /señalización [10], [11] y de ILK actividad AKT [8], [9], y las células AGS exhiben una baja expresión de PTEN (Figura 2A) [43]. La expresión forzada de PTEN en las células AGS no sólo atenúa la fosforilación constitutiva de PDK1, AKT y PAK1 pero la expresión de ILK también inhibió, ERK1 /2 fosforilación (Figura 4F), y la activación de NF-kappa B (Figura 4G). Estos resultados indicaron que la activación de PI3K y la disminución de la expresión de PTEN a estabilizar la ILK para regular la activación /2 /NF-kB ERK1. Figura 4 activación de PI3K y disminución de la expresión de PTEN facilitar la activación de ERK1 /2 /NF-kappa B mediante la estabilización de la ILK. (A) A PIP3 ELISA Kit de masas se utilizó para determinar la actividad de PI3K mediante la medición de la cantidad de PIP3 extraído de AGS no tratadas y las células MKN45 y a partir de células AGS tratados con LY294002 durante 24 h. (B) células AGS se trataron con PD98059, LY294002, T315, o Ras inhibidor FTI-277 durante los tiempos indicados. Las transferencias Western muestran la expresión de las proteínas indicadas. β-actina se utilizó como control interno. Se detectó (C) Ras actividad en AGS, MKN45, y las células AGS LY294002 tratadas después de 24 h. Las transferencias Western muestran la expresión de las proteínas indicadas en las células AGS pretratadas con cicloheximida inhibidor de la traducción (CHX
) (D) o inhibidor del proteasoma MG132 (E) durante 0,5 h y después se trató con LY294002 durante 24 h. PTEN se sobreexpresa en las células AGS usando pcDNA3.1-GFP-PTEN (PTEN
). Las transferencias Western muestran la expresión de las proteínas indicadas en comparación con pcDNA3.1-GFP (Vector
) transfección (F), y también se determinó la activación de NF-kappa B (G). Por quinasa y la actividad de la luciferasa, los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes. * P
< 0,05, ** P
< 0,01, y *** P
< 0,001 en comparación con el control. triángulo en posición vertical, el aumento de expresión; triángulo invertido, disminución de la expresión.
HSP90 asociada a E3 ligasa CHIP negativamente controles de estabilización de ILK, la activación de ERK1 /2 /NF-kappa B, y el crecimiento celular
Al verificar aún más el mecanismo de la desestabilización de ILK subyacente, nuestros resultados muestran que la inhibición de AKT no afectó a la estabilidad de la ILK, mientras que la inhibición de PI3K estabilidad CIC afectados (archivo adicional 9: Figura S8). HSP90 se investigó el próximo, ya que puede causar la degradación del CIC [25]. Similar a los resultados de la inhibición de PI3K, a base de shRNA (Figura 5A) o la inhibición farmacológica de HSP90 (archivo adicional 10: Figura S9A) retrasa no sólo la fosforilación de PDK1 /AKT sino también c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 activación /2 después de la degradación del CIC. Por otra parte, genéticamente o farmacológicamente inhibición de HSP90 mediante tratamiento con 17-AAG o el inhibidor de HDAC SAHA, que atrapa HSP90 en un estado acetilado, enzimáticamente inactiva, atenuado la actividad de NF-kappa B (Figura 5B; archivo adicional 10: Figura S9B) y el crecimiento celular ( la Figura 5C). Co-tratamiento con MG132 rescató a los efectos de 17-AAG (Figura 5D) y SAHA en la degradación de CIC y ERK1 /2 inactivación (archivo adicional 10: Figura S9C). En las células MKN45, el tratamiento con MG132 aumento de la expresión de ILK, MEK1 /2 y ERK1 /2 fosforilación (archivo adicional 11: Figura S10), y la activación de NF-kappa B (datos no presentados). Coimmunoprecipitation demostró la formación del complejo de HSP90-de ILK (datos no mostrados). El uso de un enfoque basado en lentiviral shRNA (Figura 5E), ligasas E3 asociados-HSP90, incluyendo CHIP, 4A Cullin, y Cullin 4B [26], [44], [45], fueron examinados por su papel en la degradación del CIC. Los resultados mostraron que sólo silenciar CHIP rescatado degradación de ILK y ERK1 /2 inactivación (Figura 5F), la desactivación NF-kappa B (Figura 5G), y la inhibición del crecimiento celular (Figura 5H) después de la inhibición farmacológica de PI3K y HSP90. CHIP se requiere para la ubiquitinación de ILK en las células AGS LY294002 tratados (Figura 5I). Estos resultados demostraron que la señalización /CHIP HSP90 regula la estabilización de ILK mediado por PI3K y ERK1 /activación /NF-kB ILK-regulado 2 y por lo tanto facilita el crecimiento celular. Figura 5 CHIP determina desestabilización de ILK, ERK1 /2 /NF-kB de inactivación, y la inhibición del crecimiento celular después de PI3K /HSP90 inactivación. células AGS se transfectaron con shLuc o shHSP90 o pretratados con la HSP90 inhibidor de 17-AAG (0,1 M) durante 48 h. Las transferencias Western muestran la expresión de las proteínas indicadas (A), y se determinaron también la activación de NF-kappa B (B) y el crecimiento celular (C). (D) MG132 tratamiento previo (0,5 h) revirtió la expresión de ILK y ERK1 fosforilados /2 en Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) en células AGS tratados con 17-AAG. (E) CHIP, 4A Cullin, y Cullin 4B fueron silenciados en las células AGS por shRNAs. células transfectadas con shRNA se trataron con LY294002 o 17-AAG durante 24 h. transferencia de Western mostró la expresión de la ILK y ERK1 fosforilados /2 en Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (F), y también se determinó la activación de NF-kappa B (G) y el crecimiento celular (H). (I) En shLuc- y las células transfectadas AGS-shCHIP tratados con LY294002, CIC se inmunoprecipitó, y su ubiquitylation se probaron. Para el análisis de transferencia de western, β-actina se utilizó como control interno. Para la actividad de la luciferasa y el crecimiento celular, los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes. ** P
< 0,01 y *** P
< 0,001 en comparación con el control. ## P
< 0,01 y P ###
< 0,001 en comparación con shLuc o DMSO. NS: no significativo. triángulo en posición vertical, el aumento de expresión; triángulo invertido, disminución de la expresión.
CHIP /CIC /ERK1 /PI3K /HSP90 /IQGAP1 /2 /NF-kappa B contribuye a la migración celular y la sensibilidad a 5-FU y cisplatino
aumento de la actividad o expresión de ILK podría regular oncogénico los procesos, incluyendo la proliferación celular, la migración, y la supervivencia [3], [6]. Se estudió la posible participación de la vía PI3K identificado /HSP90 /CHIP /CIC /ERK1 /vía IQGAP1 //2 señalización NF-kB en las ventajas del crecimiento celular. En comparación con las células MKN45, las células AGS mostraron una mayor actividad migratoria; Sin embargo, la ILK o IQGAP1 silenciar significativamente (P Hotel < 0,001) la migración de células abolida (archivo adicional 12: Figura S11a). bloqueando farmacológicamente /CIC /PI3K /HSP90 /MEK1 /2 NF-kB en las células AGS también significativamente (P Hotel < 0,001) atenuada la capacidad migratoria (archivo adicional 12: Figura S11B), y CHIP desmontables considerablemente invertido la efectos inhibidores causados ​​por la inhibición de PI3K y HSP90 (Figura 6A; archivo adicional 12: Figura S11C). Los agentes contra el cáncer 5-FU y cisplatino se utilizan comúnmente en el tratamiento de los cánceres gástricos [46]. El tratamiento de las células AGS con 5-FU o cisplatino, en particular después de ILK o el silenciamiento IQGAP1, causada aumento de la susceptibilidad a la apoptosis (Figura 6B). T315 aumentó la sensibilidad de las células AGS con 5-FU y cisplatino (archivo adicional 12: Figura S11D). inhibir farmacológicamente PI3K //CIC /señalización /NF-kB HSP90 /MEK1 2 también sensibiliza las células AGS a 5 inducida-FU apoptosis (figura 6C), mientras que CHIP silenciamiento retardó los efectos sinérgicos de LY294002 y 17-AAG en 5-FU la apoptosis inducida (Figura 6D). Por el contrario, la sobreexpresión de la ILK contiene un dominio quinasa catalítico, incluyendo la ILK 1-452 y la ILK 171-452, mejorada MEK1 /2 /regulada por NF-kB migración celular (Figura 6E) y célula de supervivencia después de el tratamiento con 5-FU (Figura 6F). Estos resultados indicaban los efectos comunes de la CIC y IQGAP1 sobre la activación /2 /NF-kappa B ERK1 para la migración celular y la supervivencia. Figura 6 PI3K /HSP90 /CHIP /CIC /ERK1 /2 señalización /NF-kappa B determina la migración de células y controla la susceptibilidad a los agentes contra el cáncer 5-FU y cisplatino. (A) actividad de migración se probó en shLuc- o células AGS transfectadas con shCHIP tratados con LY294002 (25 mM) y 17-AAG (0,2 M) durante 12 h. shLuc, control siRNA, o DMSO se utilizaron como controles negativos. Se muestran los números de células migradas en el campo observado. tinción con PI seguida de citometría de flujo análisis mostró 5-FU o apoptosis inducida por cisplatino durante 2 días en shILK- o células AGS transfectadas con siIQGAP1 (B), las células AGS pretratados con inhibidores de la indicada durante 0,5 h (C), y shLuc- o células AGS tratados con LY294002 o 17-AAG (D) shCHIP transfectadas. shLuc, control siRNA, o DMSO se utilizaron como controles negativos. Los plásmidos basados ​​en pcDNA3.1-Flag-CIC que contienen de larga duración (CIC ILK
1 | -452
), fragmento 171-452 (CIC 171

-452
) , o un fragmento 1-170 (CIC
1 | -170
) se transfectaron en células MKN45. En comparación con pcDNA3.1-Flag (Bandera
) solamente, la migración celular (E) y la apoptosis inducida por 5-FU (5 M) (F) se detectaron en la ausencia o presencia de PD98059 y el cabo. Los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes. * P
< 0,05, ** P
< 0,01 y *** P
< 0,001 en comparación con el control. #P
≪ 0,05, ## P
< 0,01, y ### P
< 0,001 en comparación con el control. NS:. No significativa
señalización EGFR regula la ILK /IQGAP1 para activar la migración de ERK1 /2, NF-kB, y celular y la proliferación
Para verificar el papel de la activación mediada por IQGAP1 de ILK /ERK1 /2 y NF-kB β-actina se utilizó como control interno. β-actina se utilizó como control interno. β-actina se utilizó como control interno. β-actina se utilizó como control interno. NS: no significativo. β-actina se utilizó como control interno. β-actina se utilizó como control interno. β-actina se utilizó como control interno. β-actina se utilizó como control interno. β-actina se utilizó como control interno. β-actina se utilizó como control interno. ns: no significativo.

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