Identificação de novos genes 2 dependente de ciclooxigenase em infecção por Helicobacter pylori in vivo

Identificação de genes ciclooxigenase-2-dependentes novos na infecção por Helicobacter pylori
in vivo
Abstract
Fundo
Helicobacter pylori
é um fator determinante importante na patogênese da gástrica benigna e neoplásico doenças. A ciclo-oxigenase-2 (COX-2) é a enzima chave induzível do metabolismo do ácido araquidónico e é um mediador central na inflamação e cancro. A expressão do gene
Cox-2 é sobre-regulada na mucosa gástrica durante a infecção por H. pylori, mas as consequências
pathobiological desta expressão aumentada de Cox-2 não estão ainda caracterizadas. O objetivo deste estudo foi identificar novos genes a jusante da Cox-2 em um vivo
modelo, identificando assim potenciais alvos para o estudo do papel da Cox-2 em H. pylori patogênese
eo iniciação de alterações pré-cancerosas.

Resultados perfis de expressão de gene na mucosa gástrica de ratos tratados com um inibidor específico de Cox-2 (NS398) ou veículo foram analisadas em diferentes pontos temporais (6, 13 e 19 sem) após a infecção por H. pylori
. A infecção por H. pylori
afectou a expressão de 385 genes durante o período experimental, incluindo reguladores da fisiologia gástrica, a proliferação, a apoptose e a defesa da mucosa. Sob condições de inibição de Cox-2, 160 genes alvo eram reguladas como resultado de infecção por H. pylori
. O subconjunto dependente Cox-2 incluiu aqueles que influenciam a fisiologia gástrica (gastrina, Galr1
), a função de barreira epitelial (Tjp1, connexin45, AQP5
), inflamação (ICAM1
), apoptose (Clu
) e proliferação (Gdf3, Igf2
). O tratamento com NS398 sozinho causou a expressão diferencial de genes de 140, dos quais 97 eram únicos, indicando que estes genes são regulados em condições basais de expressão de Cox-2.

Conclusão Este estudo identificou um painel de novos Cox-2 genes dependentes influenciados tanto sob as condições inflamatórias induzidas pela infecção por H. pylori
normal e. Estes dados fornecem novas ligações importantes entre Cox-2 e de processos inflamatórios, de reparação e de integridade epitelial.
Fundo
Helicobacter pylori
infecção está associada com uma variedade de desordens gástricas incluindo gastrite crónica, úlcera péptica, mucosa associada tecido linfático linfoma (MALT), e o adenocarcinoma gástrico [1, 2]. A patogenicidade da bactéria é determinada por influências epidemiológicos, bem como fatores bacterianos e de acolhimento [1, 3]. A colonização bacteriana da mucosa gástrica leva ao desenvolvimento de um infiltrado inflamatório crónico, que é acompanhada por libertação aumentada de mediadores inflamatórios, factores de crescimento e metabolitos de oxigénio reactivos [2, 4].
A enzima induzível COX-2 e a sua expresso constitutivamente isoforma COX-1 são os principais reguladores do metabolismo da prostaglandina humana [5-7]. Os produtos finais da sua actividade enzimática compreender um painel de prostaglandinas e de tromboxanos, que foram identificados como reguladores críticos de processos fisiológicos e patológicos fundamentais, incluindo a agregação de plaquetas, parto e no desenvolvimento de células T, inflamação e cancro [5-7]. actividade enzimática de COX-2 está em grande parte, regulada por meio de novo
síntese da proteína de Cox-2 [5, 6].
No estômago, o reforço de Cox-2
expressão tem sido encontrado durante a H. pylori
Triggered gastrite, assim como em lesões da mucosa do stress, úlceras gastroduodenais e após os danos de isquemia /reperfusão [8-10]. COX-2 e seus prostanóides relacionados também poderão contribuir para a patogénese do cancro gástrico. lesões da mucosa gástrica de adenocarcinoma e pré-malignas frequentemente sobre-expressar a
gene Cox-2 [11-14], e elevados níveis intratumorais Cox-2 parecem estar associados com a invasão mais profunda do tumor [15] e um aumento da frequência de metástase linfática [ ,,,0],16]. Além disso, inibidores de Cox-2 foram demonstradas para suprimir potencialmente a proliferação de células de cancro gástrico humano em [1, 17, 18], bem como adenocarcinomas gástricos experimentais in vitro
em ratinhos nus [17]. Recentemente, no entanto, uma série de relatórios desafiaram a noção de que esta actividade anti-tumoral é devido à inibição da Cox-2 em si [19]. Os indivíduos que tomam inibidores de COX-têm sido relatados para exibir um risco reduzido de desenvolvimento de carcinoma gástrico [20], no entanto, os efeitos secundários cardiovasculares relatadas associados com a administração crónica coxib significa que o uso clínico de inibidores da COX-para tratamento anti-cancerígeno é controverso (Avaliou em [21]).
a expressão do gene Cox-2
, por conseguinte, parece ser um passo importante na patogénese de doenças gástricas benignas e malignas e, por conseguinte, não só o esclarecimento da sua contribuição para o H. pylori
patogênese dependente, mas também os efeitos a jusante de Cox drogas inibidoras é de relevância clínica especial.
Temos demonstrado anteriormente que a H. pylori
pode influenciar diretamente a expressão de Cox-2
em células epiteliais gástricas através mecanismos de transcrição e activação de MAPK dependente de ERK identificados de um proximais cis
-regulatory elemento CRE-eBox como um passo fundamental no H. pylori
-response do
gene Cox-2 [22] . Embora estes resultados confirmam ainda mais a ligação fisiopatológica entre a bactéria e Cox-2
, efectores moleculares localizada a jusante da COX-2 durante a infecção por H. pylori gástrico
ainda não foram identificados.
Aqui analisamos a expressão do gene na gástrica epitélio de ratinhos tratados com o inibidor específico de Cox-2 NS398, em diferentes pontos de tempo após a infecção por H. pylori
utilizando microarrays de ADN e foram capazes de definir perfis de expressão de genes regulados por H. pylori
através de Cox-2-dependente e mecanismos independentes.

resultados da determinação da concentração de inibidor de Cox-2
Para determinar a concentração apropriada de inibidor no nosso H. pylori
modelo de infecção, os níveis de PGE2 foram medidos em mucosa gástrica após H. pylori
infecção na presença ou ausência de inibição de Cox-2 com NS398. murganhos infectados mostraram um aumento de 50% no nível de PGE2 na mucosa gástrica. Tratamento de camundongos infectados com NS398 (10 mg /kg) conduziu a uma redução da PGE2 de tal modo que não diferiram do grupo de controlo (dados não apresentados). Concluímos, portanto, que uma dose de 10 mg /kg foi suficiente para suprimir a actividade de Cox 2 na presença de uma infecção por H. pylori
.
A administração prolongada do inibidor específico de Cox-2 não NS398 não afectar significativamente bacteriana colonização ou pontuações inflamatórias
Todos os ratinhos nos grupos infectados foram colonizados com H. pylori
, tal como determinado por cultura quantitativa. A carga bacteriana aumentou apenas ligeiramente no período entre 6 e 19 semanas (Figura 1A). A administração de NS398 não pareceu ter um efeito significativo sobre a colonização bacteriana. A infecção por H. pylori
provocou um baixo grau médio de gastrite em ratinhos infectados que tendiam a aumentar em termos de gravidade ao longo do tempo, mas não levou a formação de úlceras ou de provas de metaplasia (ver Figura 1B, 1C e Figura para comparações de murganhos em cada grupo na semana 13). Estas observações estão de acordo com relatos de outros estudos onde os ratos foram infectados por iguais períodos de tempo [23, 24]. A análise histológica revelou a administração de veículo e NS398 sozinho induz uma gastrite baixo grau ao longo do tempo (Figura 1B). A Figura 1 Administração da NS398 inibidor específico de Cox-2 não afecta significativamente a colonização bacteriana ou pontuações inflamatórias. O A. O tratamento com NS398 não influenciar a colonização de H. pylori
em C57 BL /6 ratos. CFU recuperados dos estômagos dos ratos individuais em 6, 13 e 19 semanas após a infecção (círculos cheios). B. Distribuição dos escores de patologia em camundongos infectados e controle. Patologia foi pontuada de acordo com o sistema de Sydney da seguinte forma: nenhuma inflamação (0), de baixa qualidade, gastrite não -active e gastrite baixo grau leve-activa (1), de médio grau gastrite leve (2). C. hematoxilina e eosina secções de parafina de pós infecção 13 semanas, imagens representativas dos ratinhos não infectados tratados apenas com veículo (V), ratinhos não infectados tratados com NS398 (NS398), camundongos infectados (Hp
V +), e camundongos infectados tratados com NS398 (NS398 + Hp
). Na semana 13 (17 semanas após a infecção), moderada gastrite ativa foi observada em ambos os NS398 + Hp
grupos V + Hp Comprar e. Ampliação original 20 ×, barra de escala = 50 uM
ARN a partir de animais com resultados semelhantes e níveis de colonização (3 ratinhos por grupo) foram reunidas e utilizadas para realizar as três comparações experimentais:. não infectados, versus infectada (V vs
V + Hp
), infectados, versus NS398 tratados e infectados (V + Hp vs
NS398 + Hp
), e não-infectados versus não-infectados e tratados NS398 (V vs
NS398) (Figura 2A). O experimento foi concebido para nos permitir determinar perfis de expressão gênica nos estômagos dos ratos que receberam veículo sozinho ou NS398 no veículo, e para isolar esses dos efeitos da infecção por H. pylori
. Figura 2 Expressão do gene global na mucosa gástrica de ratinhos infectados com H. pylori. A. Venn diagrama que ilustra a repartição de genes diferencialmente expressos (mais de 3 vezes para cima ou para baixo) durante o período do estudo. O número de genes que passam os critérios de corte é indicado para cada comparação experimental: Infected contra ratinhos não infectados (V vs
V + Hp
), os ratos infectados, versus tratados NS398 e camundongos infectados (V + Hp vs
NS398 + Hp
), e não-infectados camundongos contra tratada NS398 (V vs
NS398). Os números entre parênteses representam o número total de genes diferencialmente expressos nos três comparações experimentais. B. Tendência parcelas representando expressão gênica global medidos nos 3 comparações experimentais. Cada ponto nos eixos y representa a razão expressão média para genes que passam os critérios de corte nas semanas 6, 13 e 19 após o início do tratamento, isto é, uma linha representa um gene. Os 33 genes relacionados com a infecção que foram diferencialmente expressos como resultado do tratamento NS398 são destacadas em vermelho para todas as comparações. Cox-2 (Ptgs2) é indicado pela linha amarela.
Expressão do gene global na mucosa gástrica de H. pylori
ratinhos infectados
O ARN utilizado neste estudo foi extraído da mucosa gástrica
apenas, e análises histológicas de estômagos preparadas desta maneira têm confirmado que o músculo ou outro tecido conjuntivo subjacente da mucosa não foram incluídos na nossa preparação (não mostrado). As alterações na expressão genética observados neste estudo são portanto altamente provável para reflectir uma resposta transcripcional restrito ao de células epiteliais gástricas e do desenvolvimento linfóide e infiltrados granulocítica crónica que caracterizam a infecção por H. pylori
. Corte-offs para mudanças significativas na expressão gênica foram fixadas em p < 0,05 e três vezes a mudança [25].
Em H. pylori
camundongos infectados, 385 genes passou o cut-off critérios em pelo menos uma vez durante o estudo (Figura 2A). H. pylori
infectados ratos que foram tratados com NS398 teve 160 genes diferencialmente expressos. Em ratinhos tratados com NS398 sozinho, 140 genes foram diferencialmente expressos (Figura 2A). Usando uma abordagem subtractiva, os genes foram divididos em subgrupos que reflectem os principais efeitos experimentais:. H. pylori
infecção, a supressão de Cox-2, e de supressão de Cox-2 durante a infecção
infecção por H. pylori
induziu uma padrão complexo de expressão do gene global ao longo do período da experiência (Figura 2B). Tratamento de camundongos infectados com NS398 resultou em uma assinatura a expressão do gene distinto, que foi suplementar para o efeito da infecção. Trinta e três dos genes diferencialmente expressos em ratos infectados, foi um resultado de tratamento NS398 (vermelho destaque genes), para além de mais de 107 genes foram apenas expressos em ratinhos tratados e infectados NS398. Desta forma um subgrupo de genes definidos Cox-2 genes dependentes foi estabelecida. Nós subdivididos estes genes em subgrupos para facilitar ainda mais a análise com base nas categorias Gene Ontologia usando a ferramenta DAVID para anotação gene no NCBI http:... //David ABCC ncifcrf gov /. A Tabela 1 contém selecionados Cox-2 genes dependentes (a lista completa pode ser encontrada no Arquivo adicional 1, Tabela S2). A maioria dos genes mostraram um padrão de expressão flutuante indicando que os mecanismos de controlo e os efeitos cumulativos de ambos infecção e supressão de Cox-2 desempenham um papel na expressão do gene ao longo time.Table 1 delineamento experimental
Semana

-4 & -3
0
6
13
19
Ratos (n)
veículo só
(V )
17
infecção Mock
Tratamento começar
5
6
6
NS398 (10 mg /kg)
(NS398)
17
infecção Mock
Tratamento começar
5
6
6
veículo mais H. pylori
(V + Hp
)
24
Infect SS1
Tratamento começam a
8
8
8
NS398 (10 mg /kg), além de H. pylori
(NS398 + Hp
)
24
Infect SS1
Tratamento começar
8
8
8
após semana 0 ratos receberam sc diariamente. injecções de NS398 ou veículo sozinho, tal como indicado. Os ratos foram mortos às 6. 13 e 19 semanas após o início do tratamento e H. pylori
colonização (ufc), em seguida, foram determinados pontuação de patologia e o ARN total foi preparado.
Efeito da NS398 em perfis de expressão de gene gástricas
estudos anteriores sobre o inibidor de COX-2 NS398 em uma variedade de ensaios in vitro
e em modelos in vivo
demonstraram que é um inibidor específico da actividade de COX-2 com pouca ou nenhuma influência sobre a intimamente relacionada, constitutivamente expresso de Cox-1

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