Identifizierung neuer Cyclooxygenase-2-abhängige Gene in Helicobacter-pylori-Infektion in vivo

Identifizierung neuer Cyclooxygenase-2-abhängige Gene in Helicobacter pylori
Infektion in vivo
Zusammenfassung
Hintergrund Helicobacter pylori
ist ein entscheidender bestimmender Faktor in der Pathogenese gutartiger und neoplastischer Magenerkrankungen. Cyclooxygenase-2 (Cox-2) ist die induzierbare Schlüsselenzym des Arachidonsäure-Metabolismus und ist ein zentraler Mediator bei Entzündungen und Krebs. Expression des Gens COX-2
ist in der Magenschleimhaut bei H. pylori Infektion
hochreguliert, aber die pathobiologischen Folgen dieser verbesserten Cox-2-Expression noch nicht charakterisiert. Das Ziel dieser Studie war es, neue Gene stromabwärts von Cox-2 in einem in vivo-Modell
zu identifizieren, um dadurch potentielle Ziele für die Untersuchung der Rolle von Cox-2 in H. pylori
Pathogenese Identifizierung und die Initiierung von prä- kanzerösen Veränderungen.
Ergebnisse
Genexpressionsprofile in der Magenschleimhaut von Mäusen, die mit einem spezifischen COX-2 Inhibitor (NS398) oder Vehikel behandelt wurden, zu unterschiedlichen Zeitpunkten untersucht (6, 13 und 19 wk) nach H. pylori-Infektion
. H. pylori-Infektion betroffen
die Expression von 385 Genen über den Versuchszeitraum, einschließlich Regulierungsbehörden von Magen-Physiologie, Proliferation, Apoptose und Schleimhaut Verteidigung. Unter den Bedingungen der Cox-2-Hemmung wurden 160 Zielgene als Ergebnis von H. pylori Infektion
geregelt. Die Cox-2-abhängige Teilmenge enthalten diejenigen beeinflussen Magen-Physiologie (Gastrin, GalR1
), epitheliale Barrierefunktion (Tjp1, connexin45, AQP5
), Entzündung (ICAM1
), Apoptose (Clu
) und Proliferation (GDF3, Igf2
). Die Behandlung mit NS398 allein verursacht unterschiedliche Expression von 140 Genen, von denen 97 einzigartig waren, was darauf hinweist, dass diese Gene unter Bedingungen der basalen reguliert werden Cox-2-Expression.
Fazit
dieser Studie eine Gruppe von neuartigen Cox-2 identifiziert abhängige Gene sowohl unter normalen beeinflusst und den entzündlichen Erkrankungen, induziert durch H. pylori
Infektion. Diese Daten liefern wichtige neue Verbindungen zwischen Cox-2 und entzündlichen Prozessen, Epithelwiederherstellung und Integrität.
Hintergrund Helicobacter pylori
Infektion mit einer Vielzahl von Magenerkrankungen einschließlich chronischer Gastritis, Magengeschwüren assoziiert ist, assoziiert mucosa lymphatischen Gewebe (MALT) Lymphom und Adenokarzinom des Magens [1, 2]. Die Pathogenität des Bakteriums durch epidemiologische Einflüsse sowie Bakterien- und Wirtsfaktoren bestimmt [1, 3]. Bakterielle Besiedlung der Magenschleimhaut führt zur Entwicklung einer chronischen entzündlichen Infiltrat, das durch erhöhte Freisetzung von Entzündungsmediatoren, Wachstumsfaktoren und reaktiven Sauerstoff-Metaboliten [2, 4].
Das induzierbare COX-2-Enzyms und seiner konstitutiv exprimiert begleitet Isoform Cox-1 sind die wichtigsten Regulatoren des menschlichen Prostaglandin-Stoffwechsel [5-7]. Die Endprodukte ihrer enzymatischen Aktivität umfassen eine Gruppe von Prostaglandinen und Thromboxanen, der als kritische Regulatoren der grundlegenden physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich Thrombozytenaggregation, Geburt, T-Zell-Entwicklung, Entzündung und Krebs identifiziert wurden [5-7]. Cox-2-Enzymaktivität weitgehend reguliert durch de novo Synthese
von Cox-2-Protein [5, 6].
Im Magen verbesserte Cox-2
Expression während H. pylori gefunden worden
Gastritis sowie in der Schleimhaut Stress Läsionen, gastroduodenalen Ulzera und nach Ischämie /Reperfusionsschäden [8-10] -triggered. Cox-2 und seine verwandten Prostanoide scheinen auch an der Pathogenese von Magenkrebs bei. Adenokarzinom des Magens und präkanzerösen Läsionen der Schleimhaut häufig überexprimieren die Cox-2-Gen
[11-14] und erhöhte intratumorale Cox-2-Spiegel scheinen mit tiefer Tumorinvasion [15] und einer erhöhten Häufigkeit von lymphatischen Metastasierung assoziiert zu sein [ ,,,0],16]. Darüber hinaus haben Cox-2-Inhibitoren nachgewiesen Proliferation von menschlichen Magenkrebszellen in vitro
[1, 17, 18] sowie experimentelle Magen-Adenokarzinome in Nacktmäusen, [17], um potently unterdrücken. Kürzlich haben jedoch eine Reihe von Berichten, den Begriff herausgefordert, dass diese Antitumoraktivität aufgrund der Hemmung von COX-2 selbst ist [19]. Einzelpersonen Einnahme Cox-Hemmer berichtet bedeuten ein geringeres Risiko zur Anzeige für die Entwicklung von Magenkarzinom [20], aber die berichteten kardiovaskulären Nebenwirkungen im Zusammenhang mit chronischer coxib Verwaltung, dass die klinische Anwendung von Cox-Inhibitoren für die anti-kanzerogene Behandlung ist umstritten (Bewertet in [21]).
Expression des
Cox-2-Gen erscheint daher ein wichtiger Schritt in der Pathogenese von gutartigen und bösartigen Magenerkrankungen und daher Klärung nicht nur aufgrund ihres Beitrags zur H. pylori zu sein
-abhängigen Pathogenese, sondern auch die nachgelagerten Effekte von Cox Drogen ist von besonderer klinischer Bedeutung zu hemmen.
Wir haben bereits gezeigt haben, dass H. pylori
direkt Expression-Cox 2
durch in Magenepithelzellen beeinflussen können Transkriptionsmechanismen und identifiziert MAPK-ERK-abhängige Aktivierung eines proximalen cis
Aufsichtsrechtliche CRE-Ebox Element als Schlüsselschritt in der H. pylori
-response des Cox-2
Gen [22] . Während weiter diese Ergebnisse die pathophysiologische Verbindung zwischen dem Bakterium und Cox-2
, molekulare Effektoren stromabwärts von Cox-2 während des Magen-H.-pylori-Infektion
blieb nicht identifizierte bestätigt.
Hier analysierten wir die Genexpression in den Magen Epithel von Mäusen mit der Cox-2-spezifischen Inhibitors NS398, zu verschiedenen Zeitpunkten nach der H. pylori
Infektion unter Verwendung von DNA-Mikroarrays behandelt und konnten Genexpressionsprofile von H. pylori
durch Cox-2-abhängigen geregelt zu definieren und unabhängige Mechanismen.
Ergebnisse
Bestimmung der Cox-2-Inhibitor-Konzentration
auf die geeignete Konzentration des Inhibitors in unserer H. pylori
Infektionsmodell, PGE2-Spiegel wurden gemessen in der Magenschleimhaut nach H. bestimmen, pylori
Infektion in Gegenwart oder Abwesenheit von Cox-2-Hemmung mit NS398. Infizierte Mäuse zeigten eine 50% ige Erhöhung der PGE2 Ebene in der Magenschleimhaut. Behandlung infizierter Mäuse mit NS398 (10 mg /kg) in der PGE2 solche zu einer Reduktion führte, dass es nicht von der Kontrollgruppe unterschied (Daten nicht gezeigt). Wir folgerten daher, dass eine Dosis von 10 mg /kg ausreichend war Cox 2-Aktivität in Gegenwart eines H. pylori
Infektion zu unterdrücken. Langzeitverabreichung von dem spezifischen COX-2 Inhibitor
NS398 nicht signifikant beeinflussen Bakterien Kolonisation oder entzündliche Partituren
Alle Mäuse in den infizierten Gruppen mit H. pylori
kolonisiert wurden, wie durch quantitative Kultur bestimmt. Die Bakterienbelastung erhöhte sich nur geringfügig in der Zeit zwischen 6 und 19 Wochen (Abbildung 1A). Die Verabreichung von NS398 anscheinend nicht einen signifikanten Effekt auf die bakterielle Besiedelung zu haben. Die Infektion mit H. pylori
mit einem niedrigen bis mittleren Klasse Gastritis in infizierten Mäusen verursacht, die in ihrer Schwere im Laufe der Zeit zu erhöhen tendenziell, aber zu Geschwürbildung oder den Nachweis einer Metaplasie nicht 1B und 1C für Vergleiche von Mäusen führen (siehe in jeder Gruppe in Woche 13). Diese Beobachtungen sind in Übereinstimmung mit den Berichten von anderen Studien, bei denen Mäuse für ähnliche Zeiträume infiziert wurden [23, 24]. Die histologische Analyse zeigte Verabreichung von Vehikel und NS398 induziert allein eine minderwertige Gastritis über die Zeit (Abbildung 1B). Abbildung 1 Verwaltung des spezifischen Cox-2-Hemmer NS398 nicht signifikant bakterielle Besiedelung oder entzündliche Scores beeinflussen. A. Behandlung mit NS398 hat keinen Einfluss auf H. pylori
Kolonisation in C57 BL /6-Mäuse. CFU aus den Mägen von einzelnen Mäusen abgerufene bei 6, 13 und 19 Wochen nach der Infektion (gefüllte Kreise). B. Verteilung der Pathologie-Scores in infizierten und Kontroll-Mäusen. Pathologie wurde nach dem Sydney-System wie folgt bewertet: keine Entzündung (0), minderwertige, nicht -active Gastritis und low grade mild aktive Gastritis (1), Mittelstufe mild aktive Gastritis (2). C. Hematoxylin und Eosin gefärbten Paraffinschnitten von 13 Wochen nach der Infektion, repräsentative Bilder von nicht-infizierten Mäusen, die mit nur Fahrzeug (V), nicht infizierten Mäusen, die mit NS398 (NS398), infizierten Mäusen (V + Hp
), und infizierten Mäusen, die mit NS398 (NS398 + Hp
). In Woche 13 (17 Wochen nach der Infektion), wurde moderate aktive Gastritis beobachtet sowohl in der V + Hp
und NS398 + Hp
Gruppen. Originalvergrößerung 20 ×, Skala bar = 50 &mgr; m
RNA von Tieren, die mit ähnlichen Noten und Kolonisierung Ebenen (3 Mäuse pro Gruppe) wurden gesammelt und verwendet, um die drei experimentellen Vergleiche durchzuführen:. Nicht-infizierten im Vergleich zu infizierten (V vs
V + Hp
), infiziert gegen NS398 (V + Hp) vs
NS398 + Hp
behandelt und infiziert und nicht-infizierten im Vergleich zu nicht-infizierten und NS398 (V vs
NS398 behandelt) (2A). Das Experiment wurde entworfen, um uns zu ermöglichen Genexpressionsprofile in den Mägen von Mäusen zu bestimmen, allein oder in NS398 Fahrzeugempfangenden Fahrzeug, und diese von den Auswirkungen von H. pylori Infektion
zu isolieren. Figur 2 Globale Genexpression in der Magenschleimhaut von Mäusen, die mit H. pylori infiziert. A. Venn-Diagramm den Abbau von differentiell exprimierten Genen darstellt (mehr als 3 fache nach oben oder unten) über den Zeitraum der Studie. Die Zahl der Gene, die die Abschneidekriterien vorbei ist für jeden experimentellen Vergleich angegeben: Infizierte im Vergleich zu nicht-infizierten Mäusen (V vs
V + Hp
), infizierte Mäuse im Vergleich zu NS398 behandelt und infizierten Mäusen (V + Hp vs
NS398 + Hp
) und nicht-infizierte Mäuse im Vergleich zu NS398 behandelt (V vs
NS398). Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl insgesamt Gene unterschiedlich in den drei experimentellen Vergleiche ausgedrückt. B. Trenddarstellungen repräsentieren Ausdruck globale Gen gemessen in den drei experimentellen Vergleiche. Jeder Punkt auf der y-Achse stellt den durchschnittlichen Expressionsverhältnis für Gene, die die Abschneidekriterien in den Wochen 6, 13 und 19 nach der Behandlung beginnt, vorbei, das heißt eine Zeile repräsentiert ein Gen. Die 33-Infektion im Zusammenhang mit Genen, die anders als Folge der Behandlung NS398 exprimiert wurden, werden für alle Vergleiche rot markiert. Cox-2 (PTGS2) wird durch die gelbe Linie angezeigt.
Globale Genexpression in der Magenschleimhaut von H. pylori infizierten Mäusen
Die RNA in dieser Studie verwendet wurde, aus der Magenschleimhaut
extrahiert nur, und histologische Analysen von Mägen auf diese Weise vorbereitet haben bestätigt, dass Muskel oder andere Bindegewebe der Schleimhaut zugrunde liegen nicht in unseren Vorbereitungen enthalten waren (nicht dargestellt). Die Veränderungen in der Genexpression in dieser Studie gesehen sind daher sehr wahrscheinlich eine transkriptionale Reaktion auf die von Magenepithelzellen beschränkt zu reflektieren und den Entwicklungs lymphatischer und granulocytic Infiltrate, die chronische H. pylori Infektion
charakterisieren. Cut-offs für signifikante Veränderungen in der Genexpression bei p <gesetzt wurden; 0,05 und dreifache Änderung [25].
H. pylori
infizierten Mäusen, bestanden 385 Gene, die die Schnitt- während der Studie (2A) Kriterien mindestens einmal ab. H. pylori
infizierten Mäusen, die mit NS398 behandelt wurden, hatten 160 differentiell exprimierte Gene. In Mäusen, die mit NS398 allein behandelt wurden, wurden 140 Gene differentiell exprimiert werden (2A). Mit Hilfe eines subtraktiven Ansatz wurden Gene in Untergruppen unterteilt sich die wichtigsten experimentellen Effekte:. H. pylori-Infektion
, Cox-2-Unterdrückung und Cox-2-Unterdrückung während der Infektion
Infektion mit H. pylori TÜV-induzierte komplexe Muster der globalen Genexpressions über den Zeitraum des Experiments (2B). Behandlung infizierter Mäuse mit NS398 resultierte in einer deutlichen Genexpression Signatur, die auf die Wirkung der Infektion zusätzlicher war. Dreiunddreißig der Gene unterschiedlich in infizierten Mäusen exprimiert war ein Ergebnis der NS398 Behandlung (rote Gene markiert), zusätzlich weitere 107 Gene wurden nur in NS398 behandelt und infizierten Mäusen exprimiert. Auf diese Weise wird eine Untergruppe von Genen definiert Cox-2-abhängigen Genen gegründet wurde. Wir unterteilt diese Gene in Untergruppen eine weitere Analyse zu erleichtern, auf der Grundlage der Gene Ontology Kategorien das DAVID-Tool für die Gen-Annotation an der NCBI http:... //David abcc ncifcrf gov /. Tabelle 1 enthält ausgewählte Cox-2-abhängige Gene (eine vollständige Liste finden Sie in den weiteren Datei 1, Tabelle S2 zu finden). Die meisten Gene zeigten eine fluktuierende Expressionsmuster anzeigt, dass Kontrollmechanismen und die kumulativen Effekte der beiden Infektion und Cox-2-Unterdrückung eine Rolle bei der Genexpression über time.Table 1 Experimentelles Design
Week

-4 & -3
0
6
13
19
Mäuse (n)
Fahrzeug nur
(V )
17
Mock Infektion
Behandlung
5
6 6
NS398 (10 mg /kg)
(NS398)
17
beginnen Mock-Infektion
Behandlung beginnen
5
6 6
Fahrzeug und H. pylori
(V + Hp
) 24
SS1
Behandlung Infect beginnen
8 8
8 NS398 (10 mg /kg) und H. pylori
(NS398 + Hp
)
24
SS1 Infect
Behandlung beginnen
8 8
8 Nach Woche 0 Mäuse täglich sc erhalten. Injektionen von NS398 oder allein Fahrzeug, wie angegeben. Die Mäuse wurden bei 6. 13 und 19 Wochen nach Beginn der Behandlung getötet und H. pylori-Besiedlung
(KBE), dann wurden Pathologie-Scores bestimmt und Gesamt-RNA hergestellt.
Wirkung von NS398 auf Magen-Genexpressionsprofile
Frühere Studien auf der Cox-2-Inhibitor NS398 in einer Vielzahl von in vitro und in vivo

Modelle haben gezeigt, es ist ein spezifischer Inhibitor von COX-2-Aktivität ist, mit wenig oder keinen Einfluss auf die eng verwandt, konstitutiv ausgedrückt Cox-1 | [26, 27]. In unserer Studie erschien Langzeitverabreichung Auswirkungen auf die Genexpression zu haben, die aufgelöst wurden oder für nach mehreren Monaten kompensiert, da ein großer Teil der Gene, die geregelt Aufwärts waren nach Woche 6 der Verabreichung nicht anders Woche geäußert wurden 13 (2B und Tabelle 1). Nur 33 der Gene, die durch NS398 beeinflusst wurden, wurden auch in Reaktion auf eine Infektion geregelt. Eine vollständige Liste der Gene als Folge der NS398 Behandlung geregelt wird angezeigt (zusätzliche Datei 1, Tabelle S3.
Die "subtraktiven" Verfahren zur Klassifizierung Gene zu ergänzen, Daten wurden mit einem unüberwachten Ansatz gebündelt. Eine Selbstordnung Matrix (SOM) wurde alle Cox-2-abhängigen Genen erstellt, 3 zeigt eine SOM-Plot der Cox2 abhängigen Gene in der Studie (linkes Feld) identifiziert, das rechte Bild zeigt eine Matrix der gleichen Gene die Wirkung von H, um anzuzeigen, . pylori
auf die gleichen Gene allein Infektion (siehe auch Tabelle 2). im Großen und Ganzen fielen die regulierten Gene in die funktionellen Gruppen von 2 bis epithelialen Barrierefunktion, Proliferation und Wartung oder Entzündung (zusammengefasst in 3B) .Tabelle bezogen ist Falten Sie Änderung in der Genexpression ausgewählter Gene als Folge einer Infektion mit H. pylori
geregelt und /oder Behandlung mit dem spezifischen Cox-2-Hemmer NS398
SYMBOL
Genname
Gene Ontology
V gegen V + Hp

V + Hp vs NS398 + Hp
V vs NS398

6 13
19
6 13
19
6
13
19
Adn
Adipsin
Chymotrypsin, Aktivität.
Ergänzung activation.
3.06
1.9
-1.32
-2.4
1.93
-1.07
-1.53
-2.56
-1.97
Akt3
thymoma Virus-Proto-Onkogen 3
Protein Aminosäure phosphorylation
-1.52
6.68
-1.02
-1.09
1.28
1.33
-1.44
-1.03
-1.06
AV148957
Connexin 45
Wasser transport
1.39
-3.25
-1.04
1.29
-1.11
1.39
1
1.09
-1.01
Ccl5
chemokine (CC motif) ligand 5
Chemokin-Aktivität.
Entzündungsreaktion
1,23
-1,13
3,01
1,08
-1,13 -1,54

-1,21
1,48
1,08
BRK. DMBT1
bei malignen Hirntumoren 1 /crp ductin, muclin
Scavenger-Rezeptor-Aktivität.
Tumor gelöscht suppressor
4.15
-3.15
7.74
-2.64
-2.09
-2.15
1.78
1.28
-1
Gast
gastrin
hormone Aktivität
6,37
-1,21
1.8
-8,41 -1,87

-1,01
1 -2,35
1,45
Hsp70-3
Hitzeschock-Protein 1A
Chaperon activity
5.3
-1.86
1.31
-5.41
1.13
-1.15
3.23
-1.35
1.11
Icsbp1
interferon Konsens seq-bindendes Protein 1 | Immunantwort;. Transkription regulation
1
-1.31
3.36
1.19
1.23
-1.39
1
2.04
-1.37
Ifi47
interferon gamma induzierbare Protein
ATP-Bindung activity
1.3
-1.29
6.03
1.2
-1.13
-1.97
-1.85
-1.29
1.45
Ly75
lymphocyte Antigen 75
Abwehrreaktion
1,23
-2,25
3,37
1,36
-1,15
1 1 | 1 | 1,39
Mup5
Hauptharnprotein 5
Pheromon-Bindungsaktivität, Verkehr, Transporter activity
4.94
-1.08
3
-6.56
-1.23
-2.5
7.56
-1.5
1.31
Ptgs1
prostaglandin-endoperoxide Synthase 1 | Prostaglandin biosynthesis
-1.36
-1.03
-1.02
1.16
1.03
1
1.26
1.47
1.12
Ptgs2
prostaglandin-endoperoxide Synthase 2
Prostaglandin biosynthesis
1.27
4.34
1.47
-1.02
1.17
1
-1.55
-1.24
-1.47
Odc
Ornithine decarboxlyase
carboxy- Lyaseaktivität
1.05
-1,69 -1,19

-1,34
-3,12 -1,11

1,94
-1,4
1,23
Slc7a11. CD98 Licht
solute carrier family 7 Mitglied 11. CD98 Licht
kationischen Aminosäure transporter
1.37
3.42
1.19
1.09
2.24
1.33
-1.7
-1.64
-1.07
Tff1
trefoil Faktor 1 | Antwort auf wounding
-2.94
5.57
-3.06
-2.28
9.16
-1.56
-1.37
-6.56
2.84
Tgtp
T-cell spezifische GTPase
GTP-Bindungsaktivität
1,26
-1,24
8,29
1.55
-1,17 -2,72

-1,37
1,31
1,43
die Gene Ontology (GO) Klassifizierung zeigt die Genfunktion. Eine vollständige Liste des Expressionsniveaus aller Gene in der Studie in den weiteren Datei 1, Tabellen S1-3 gefunden werden kann.
3 Expressionsmuster von Cox-2-abhängigen Abbildung . Gene A. Zweidimensionale Selbstordnung Matrix (SOM) Cluster relative Expressionsniveau aller Cox-2-abhängigen Gene identifiziert, die in dieser Studie (p > 0,05) zeigt. Up- oder Down-Vorschriften werden durch rot angezeigt oder blau Schattierung sind. Schwarz Schattierung zeigt ähnliche Gen-Expression in beiden Proben. im rechten Bereich des Clusters aus der Genexpressionsmuster in NS398 behandelten Mäusen (V + Hp
vs NS398 + Hp
). die linke Tafel zeigt abgeleitet zeigt das . Proliferation /Apoptose (hellblaue: Expression der gleichen Gene in infizierten Mäusen (unclustered) Genfunktionen und Literaturhinweise relevant H. pylori
Infektion sind in Tabelle 3. Gene, die die prominentesten funktionalen Kategorien passend sind farblich hervorgehoben ), epitheliale Integrität (orange), entzündliche Reaktion (rot) und Magen-Physiologie (grün) B. Diagramm Zusammenfassung der Gesamt physiologische Wirkung von Cox-2-abhängigen Gene über den Zeitraum des Experiments Gen Kategorien werden als in A. gefärbt
Bestätigung der Expression ausgewählter Cox-2-abhängigen Gene
in Expressionsniveau von cox1 (Cyclooxygenase-1)
und Cox2 (PTGS2)
, und eine Auswahl an Cox2 abhängigen Gene beteiligt bei der Entzündung (intrazellulär die mittlere Veränderung adhesion molecule 1, ICAM1
; Transforming growth factor b1, Tgfb1
), Magen-Funktion (Gastrin, Gast
), Barrierefunktion (Aquaporin 5, AQP5;
Tight-Junction-Protein 1, Tjp1
) und die Proliferation /Karzinogenese (Ornithin-Decarboxylase , ODC1
) wurde für einzelne Mäuse zu allen Zeitpunkten durch real-time PCR (Zusätzliche Datei 1, Tabelle S4) bestimmt. In 94% der Fälle in der Expression der Veränderung (Up- oder unten geregelt über die dreifache abgeschnitten Kriterien) bestätigt werden konnte.
NS398 behandelten Mäusen
die Expression von Tjp1 dramatisch in den frühen Phasen erhöht der Studie im Vergleich zu infizierten Mäusen (Abbildung 3). Die Maus-EST homolog zu Connexin 45 (AV148957, Gja7) verringert wurde auch in infizierten Mäusen, unabhängig davon, NS398 Behandlung, wie ein Magen Aquaporin AQP5 (Abbildung 3) war. Dies legte nahe, dass COX-2-Inhibierung einen Effekt auf die H. pylori ist
Einfluss von Magenbarrierefunktion vermittelt daher untersuchten wir diese weiter in einem in vitro-Modell
. Western-Blot-Analyse zeigte, dass eine Infektion mit H. pylori
auch zu einem Anstieg in Zona-Occludens geführt 1 (ZO1, humane Homolog zu Tjp1) Proteinexpression in vitro
in MKN28 Magenepithelzellen, und daß diese Zunahme wurde in der hemmte Vorhandensein von NS398 (4A). Interessanterweise war dieser Effekt unabhängig von der Anwesenheit von intaktem Typ-IV-Sekretionssystem, oder das Vorhandensein des Cytotoxin VacA, wie H. pylori
Deletionsmutanten auch ZO1 Ausdruck (4B) induziert. Expression von ODC wurde in MKN28-Zellen, behandelt mit NS398 (4C), und war auch unabhängig von der Anwesenheit eines funktionellen Typ IV Abschnitt Vorrichtung oder VacA verringert. Abbildung 4 Cox-2-abhängige Expression von ZO1 und Ornithin-Decarboxylase in MKN28 Zellen abhängig von H. pylori-Infektion. A. Expression von zona occludens-1 (ZO1) wurde entweder mit H. pylori
Wildtyp durch Western-Blot bei 6 h nach der Infektion in MKN28 Zellen bestimmt P12 oder den isogenen Mutanten die gesamte cag PAI (PAI) fehlt, oder VacA (VacA). ZO1 wurde bis nach der Infektion geregelt, unabhängig von CagA PAI oder VacA (oben), während die Expression in Zellen, die mit NS398 (nieder) behandelt verringert wurde. B. Expression von Ornithin-Decarboxylase-Protein (ODC) betroffen war nicht von H. pylori-Infektion
, wurde aber in Gegenwart von NS398.
Diskussion
Das Ziel dieser Studie verringerte war unser Wissen über die zu verbessern Rolle der Cyclooxygenase-2 in H. pylori
-triggered Schleimhautentzündung durch neue nachgelagerten molekularen Effektoren identifiziert. Der in vivo Ansatz
hier gefunden hat auch einen Einblick in das Transkriptom Ebene vorgesehen ist, in die komplexen Änderungen, die als Folge der chronischen Entzündungsreaktion auf H. pylori
Infektion auftreten und Cox-2-Hemmung.
beide H. pylori
Infektion und NS398 Behandlung ausgelöst einzigartige Transkriptions Signaturen in der Magenschleimhaut von Mäusen, trotz der Ähnlichkeit in der Pathologie Scores und Besiedlungsdichte zwischen den verschiedenen Gruppen (Abbildung 1). Dies ist von Interesse, weil in einem anderen Bericht ein Modell der Schleimhaut assoziierten lymphatischen Gewebe-Lymphom (MALT-Lymphom), Transkriptionsprofile in Balb /c-Mäuse infiziert mit H. Verwendung heilmannii
nach 12 bis 24 Monaten bestimmt wurden, und die großen Veränderungen in der Gen-Regulation aufgetreten in den früheren Stadien der Erkrankung (< 12 Monate, leichte bis mäßige Pathologie) [28]. Nach dieser Zeit clustering der 300 am meisten differentiell exprimierten Gene Segregation von infizierten Mäusen in Gruppen entspricht fast genau mit ihren pathologischen Charakterisierung erlaubt. Im Hinblick auf unsere Daten, wir, daß während der frühen Entwicklungsphase von chronisch aktive Gastritis, standard Pathologie Analyse schließen würde, ist nicht in der Lage zu erkennen subtile aber wichtige Änderungen in der Schleimhaut.
NS398 hemmt spezifisch die Aktivität des Cox-2 Protein, und Veränderungen in Cox-2
Genexpression erwartet werden könnte, wenn infizierte Mäuse mit einer spezifischen COX-2 Inhibitor behandelt wurden, entweder als Ergebnis eines möglichen Rückkopplungsmechanismus PGE 2 [29] beteiligt oder als ein Kompensationsmechanismus der enzymatischen Hemmung zu überwinden. Keine signifikante Änderung in Cox-2
Expression wurde beobachtet, in vivo
jedoch die Vorstellung unterstützen, dass die Expression der Cox-2-Gen
im Magen durch eine Vielzahl von Faktoren gesteuert wird. COX-2 wird durch beide inflammatorischen und Magen Epithelzellen exprimiert [22] und seine Expression kann durch verschiedene Mechanismen in verschiedenen Zelltypen steuern.
Wir konnten eine Untergruppe von Genen zu identifizieren, die als Ergebnis der differenziell exprimierten Cox wurden -2 Unterdrückung, Hervorhebung der Einflussbereich von Cox-Inhibitoren bei Magenentzündung. Cox-2-abhängige Gene fiel in zahlreichen funktionalen Kategorien, vor allem diejenigen, die in Magen-Physiologie (Säuresekretion, Motilität) beteiligt, Epithelwiederherstellung und Proliferation und Entzündungsmediatoren.
Gastrin (Gast
) ist ein wichtiger Vermittler im Magen [30-34] und Ausdruck in der Schleimhaut wurde stark beeinflusst, nicht nur durch eine Infektion mit H. pylori
, sondern auch durch die Unterdrückung von Cox-2-Aktivität (Abbildung 3, zusätzliche Datei 1, Tabelle S4). Zusätzlich zu seiner Rolle Magensäuresekretion bei der Regulierung hat Gastrin trophischen Wirkungen und reguliert die Proliferation und die Reparatur in der Schleimhaut. Tatsächlich INS-GAS transgene Mäuse, die von Hypergastrinämie leiden Karzinom nach der Infektion mit H. pylori
[35] zu entwickeln. Die Entwicklung von Karzinomen ist jedoch in diesem Modell auf Männer [35]. Andere Forscher haben auch festgestellt, dass Cox-2-Hemmung Gastrin-Expression beeinflusst in einem in-vitro
Darmkrebs-Modell [34] und auch in H. pylori
positiven Magenkrebs-Patienten [36].
Die Expression des Apoptose zu vermitteln Wachstumsdifferenzierungsfaktor 3 (GDF3
) und c-Myc (Mycs
) Gene gipfelte in Woche 13, die Apoptose hemmenden Gen clusterin (Clu
) verringerte sich stark zu diesem Zeitpunkt. Zusammengenommen ist die Genexpressionsmuster von einer Verschiebung der Proliferationsrate /Apoptose des Epithels nach 13 Wochen der Infektion als Folge der Behandlung NS398 andeutend. Längerfristige Untersuchungen erforderlich wäre, um festzustellen, ob dieser Effekt fortgesetzt oder erneut auftritt. Eine Anzahl von Genen, die vorher beobachtet wurden in Tumoren (Mycs, Clu
) [37] überexprimiert sein, Tumorsuppressoren (Patched, Ptch
) oder auf andere Weise beteiligt bei der Metastasierung oder DNA-Reparatur: Bikunin ( AMBP
) [38], Ornithin-Decarboxylase-Gen (ODC
), Trefoil factor 1 (TFF1
) [39], Insulin ähnlicher Wachstumsfaktor (Igf2
) [40] und DNA-Reparaturprotein 1 (DDB1
) wurden auch ausgedrückt differentiell in NS398 behandelten infizierten Mäusen (Abbildung 3). Das Expressionsmuster war jedoch komplex, und einige Mediatoren neigten von Cox-2 Unterdrückung verbessert werden, während die Mehrheit wurden herunterreguliert (Abbildung 3). Dies spiegelt wahrscheinlich eine regulatorische Rolle für Cox-2 als Teil eines Netzwerks von Kontrollmechanismen für epithelialen Wartung. ODC
Gen zum Beispiel codiert ein Schlüsselregulationsenzym in der Herstellung von Polyaminen, die für die Zellproliferation notwendig sind [41] und wurde zusammen mit Cox-2 in der Entwicklung von atrophischer Gastritis [42, eine Rolle zu spielen gezeigt 43]. Es wurde vorgeschlagen, dass Cox-2-Inhibitoren Odc hemmen können, und auf diese Weise für die beobachteten anti-proliferative Wirkung von Cox-2-Inhibitoren [44] verantwortlich. Unsere Beobachtung der Abnahme in Odc Expression als Ergebnis der NS398 behandelt H. pylori Infektion in
sowohl in vivo und in vitro

Studien (Tabelle 1 und Abbildung 4C) ist mit diesem Begriff in halten.
Helicobacter
ist die Infektion stark mit der Induktion einer starken Th1-Typ-Entzündungsreaktion mit hoher IFNy, zugeordnet ist, die Expression von anderen Entzündungsmediatoren wie iNOS und Faktoren, Cox-2
sowie zirkulierende Wachstum induziert wie Gastrin [45]. Unterstützung bei der Vorstellung, dass IFNy die Schlüsselrolle spielt bei der Gewinnung und Aktivierung von Lymphozyten [46, 47], beobachteten wir, dass die Expression von T-Zelloberflächenmarker ICAM1
[48, 49] und CD86
und Liganden (Verkaufen
) [50] gipfelte in infizierten Mäusen in Woche 13. Die Interferon-abhängige GTPasen (IGTp
, Iigp anhängige
), um die anti-mikrobiellen Aktivitäten von IFNy in einer STAT1 abhängigen Weise regulieren [51, 52], und ihre Expression wurde in NS398 behandelten Mäuse am Ende dramatisch reduziert die Studium. Insgesamt Hemmung der Cox-2-Aktivität führte zu einer verminderten Expression von Entzündungsmediatoren zwischen den Wochen 13 und 19 (Abbildung 3); Interessanterweise wurde diese Änderung nicht in der Pathologie Partituren wider. COX-2 wurde in Entzündungsreaktionen und Hemmung von COX-2 unter Verwendung NS398 führte zu einer Polarisation der Reaktion von in vitro stimulierten humanen PBMCs
Richtung Th1 [53], um die Th1 /Th2 Gleichgewicht zu modulieren, gezeigt. Die Autoren postulierten, dass eine chronische Expression von COX-2 und die Produktion von PGE2 zu einer Hemmung der Wirksamkeit der mukosalen Immunantwort durch einen Zustand der Toleranz verbessert wird. Das Genexpressionsmuster wir hier beobachtet, ist in der Tat mit einer Wirkung der COX-2-Hemmung an der Entzündungsreaktion (siehe Abbildung 3 und Tabelle 1), obwohl die Veränderungen in der Expression der klassischen Th1 /Th2 Mediatoren, wie IL-12 im Einklang, I-10 und IL-4 nicht signifikant in unserer Studie unterscheiden.
Infektion mit H. pylori
berichtet wurde epithelialen Integrität und mehrere mögliche Mechanismen beschädigt dies berichtet wurde (beschrieben in [54]). CagA, eine wichtige H. pylori
Pathogenitätsfaktor wird in Epithelzellen über die Typ IV-Sekretion Gerät transloziert [55, 56]. Untersuchungen in einer Hundenierenzellmodell (MDCK) zeigte, dass CagA Mitarbeiter mit dem Tight-Junction-Adapterprotein zona Occludens 1 (ZO-1, Maus-Homolog -Straffe Junction Protein 1, Tjp1) und das junctional Adhäsionsmolekül (Jcam oder Jam), was eine langfristige Störung der epithelialen Barrierefunktion in vitro
[57]. Während wir die Expression von Tjp1
auf der Transkriptionsebene in NS398 behandelten infizierten Mäusen erhöht beobachtet wurde Jcam
Ausdruck nicht betroffen. Darüber hinaus ist eine EST mit Homologie zu Connexin 45 (AV148957, Gja7
) und AQP5
von H. pylori beeinflusst wurden
Infektion unabhängig von NS398 Behandlung (Abbildung 3). Da beide Connexin 45 und AQP5 werden wissen, eine Rolle bei der interzellulären Transport von Wasser und kleinen Molekülen zu spielen, und es gibt experimentelle Hinweise darauf, dass Connexin 45 direkt mit Tjp1 interagiert [58, 59], so scheint es, dass Cox-2 hat auch eine Rolle in der Aufrechterhaltung der Wasserbilanz in dem Magenepithel. Diese Idee wird von unseren in vitro
Beobachtungen eines COX-2-abhängige Zunahme der ZO-1-Proteinexpression in MKN28 Zellen unterstützt. Im Gegensatz zu den Berichten von Amieva et al. [57] wurde dieser Effekt nicht auf die CagA Status von H. pylori
(Abbildung 4) bezogen. Barrierefunktion Effekte im Mausmodell sind in jedem Fall unwahrscheinlich, dass die Aktionen von CagA wegen, da, obwohl wir fanden, dass H. pylori
SS1 CagA-Protein exprimiert, waren wir nicht in der Lage, die Translokation in entweder in vitro zu erkennen
oder in vivo
Experimente (Daten nicht gezeigt). Daher scheint es, dass H. pylori Infektion
zusätzliche Mechanismen hat epithelialen Integrität zu beeinflussen. Es ist auch bemerkenswert, dass eine andere H. pylori
Pathogenitätsfaktor, vakuolisierendes Toxin (VacA) verursacht die Bildung von flüssigkeitsgefüllten Vakuolen in Epithelzellen und weiterhin kann diese Aktivität inhibiert werden, in vitro und Videos NS398 Behandlung [60] . Da die Magen Aquaporin AQP5 in den Magen-Krypten auf den seitlichen und interzellulären Membranen exprimiert [59], spekulieren wir, dass diese Pore durch Änderungen an tight junction-Proteine ​​beeinflusst wird, und dass es eine Rolle bei der Entwicklung von Ödemen im Epithel spielt während Infektion.
Eine Reihe von veröffentlichten Berichte haben versucht, Licht in der H. pylori-Infektion
auf die Genregulation zu vergießen die Microarray-Ansatz zu studieren Ausdruck globalen Gen in Magenepithelzellen in vitro
[61-63] ( Bewertung in [64]), eine schnelle hoch~~POS=TRUNC von Entzündungsmediatoren und eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren, berichten die Markenzeichen des Expressionsmusters zu sein.

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