Identification de nouveaux gènes de la cyclooxygénase-2-dépendante infection à Helicobacter pylori in vivo

L'identification des gènes Cyclooxygenase-2-dépendants nouveaux dans l'infection de Helicobacter pylori dans le fond de vivo
Résumé
Helicobacter pylori
est un facteur déterminant crucial dans la pathogenèse de gastrique bénin et néoplasiques maladies. Cyclooxygénase-2 (COX-2) est l'enzyme clé inductible du métabolisme de l'acide arachidonique et est un médiateur central dans l'inflammation et le cancer. L'expression du gène
Cox-2 est régulée à la hausse dans la muqueuse gastrique pendant H. pylori
infection, mais les conséquences de cette pathobiologiques améliorée Cox-2 expression sont pas encore caractérisés. Le but de cette étude était d'identifier de nouveaux gènes en aval de la Cox-2 dans un modèle in vivo en, permettant ainsi d'identifier des cibles potentielles pour l'étude du rôle de la COX-2 dans H. pylori
pathogenèse et initiation des changements précancéreuses. les profils d'expression génique de
Résultats dans la muqueuse gastrique des souris traitées avec un inhibiteur COX-2 spécifique (NS398) ou d'un véhicule ont été analysés à des moments différents (6, 13 et 19 sem) après l'infection de H. pylori. L'infection par H. pylori affecté l'expression de gènes de 385 au cours de la période expérimentale, y compris les régulateurs de la physiologie de l'estomac, de la prolifération, l'apoptose et la défense de la muqueuse. Dans des conditions de Cox-2 inhibition, 160 gènes cibles ont été réglées à la suite de l'infection de H. pylori. Le sous-ensemble dépendant de la Cox-2 inclus ceux qui influent sur la physiologie gastrique (Gastrin, GalR1
), la fonction de barrière épithéliale (Tjp1, connexin45, AQP5
), l'inflammation (ICAM1
), l'apoptose (Clu
) et prolifération (GdF3, Igf2
). Le traitement avec NS398 seul provoqué l'expression différentielle de 140 gènes, dont 97 étaient uniques, ce qui indique que ces gènes sont régulés dans des conditions de base de la Cox-2 expression.
Conclusion
Cette étude a identifié un panel de roman Cox-2 gènes dépendants influencé dans normal et les conditions inflammatoires induites par l'infection de H. pylori. Ces données fournissent de nouveaux liens importants entre Cox-2 et les processus inflammatoires, la réparation et de l'intégrité épithéliale.
Fond
Helicobacter pylori
infection est associée à une variété de troubles gastriques, y compris la gastrite chronique, la maladie de l'ulcère gastro-duodénal, de la muqueuse associée le tissu lymphatique (MALT), un lymphome, un adénocarcinome gastrique et [1, 2]. La pathogénicité de la bactérie est déterminée par des facteurs épidémiologiques ainsi que les facteurs bactériens et l'hôte [1, 3]. la colonisation bactérienne de la muqueuse gastrique, conduit au développement d'un infiltrat inflammatoire chronique, qui est accompagnée d'une libération accrue de médiateurs inflammatoires, des facteurs de croissance et les métabolites réactifs de l'oxygène [2, 4]. Le plus inductible enzyme COX-2 et de sa forme constitutivement exprimé isoforme de la COX-1 sont les principaux régulateurs du métabolisme des prostaglandines humaine [5-7]. Les produits finaux de leur activité enzymatique comprennent un panneau de Prostaglandines et les thromboxanes, qui ont été identifiés comme des régulateurs critiques de processus physiologiques et pathologiques fondamentaux, notamment l'agrégation plaquettaire, la parturition, le développement des cellules T, l'inflammation et le cancer [5-7]. Cox-2 activité enzymatique est largement réglementée par de novo
synthèse de Cox-2 protéines [5, 6].
Dans l'estomac, améliorée Cox-2
expression a été trouvé au cours de H. pylori
-triggered gastrite, ainsi que dans les lésions de la muqueuse de stress, ulcères gastro-duodénaux et après une lésion d'ischémie /reperfusion [8-10]. Cox-2 et ses prostanoïdes connexes semblent également contribuer à la pathogenèse du cancer gastrique. adénocarcinome et précancéreuses lésions de la muqueuse gastrique souvent surexpriment le gène
Cox-2 [11-14], et élevées intratumoral Cox-2 niveaux semblent être associés à une invasion plus profonde de la tumeur [15] et une augmentation de la fréquence des métastases lymphatiques [ ,,,0],16]. En outre, les inhibiteurs de la COX-2 ont été mis en évidence pour supprimer puissamment la prolifération de cellules de cancer gastrique humain in vitro
[1, 17, 18], ainsi que les adénocarcinomes gastriques expérimentales chez la souris nude [17]. Récemment, toutefois, un certain nombre de rapports ont contesté l'idée que cette activité anti-tumorale est due à l'inhibition de la Cox-2 lui-même [19]. Les personnes qui prennent Cox-inhibiteurs ont été rapportés pour afficher un risque réduit pour le développement du carcinome gastrique [20], mais les effets secondaires cardiovasculaires rapportés associés à l'administration des coxibs chroniques signifient que l'utilisation clinique des inhibiteurs de la COX pour le traitement anti-cancérigène est controversée (Avis dans [21]) de. expression du gène
Cox-2 semble donc être une étape importante dans la pathogenèse des maladies gastriques bénignes et malignes et, par conséquent, la clarification non seulement de sa contribution à H. pylori
pathogenèse dépendante, mais aussi les effets en aval de Cox médicaments inhibiteurs est d'une importance clinique particulière.
Nous avons déjà démontré que H. pylori
peut influer directement sur l'expression de Cox-2
dans les cellules épithéliales gastriques par mécanismes de transcription, et identifié activation MAPK-ERK-dépendante de l'élément CRE-règlementaires Ebox d'un cis proximales comme une étape clé dans le H. pylori
-response du
gène Cox-2 [22] . Bien que ces résultats confirment en outre le lien entre physiopathologique la bactérie et la Cox-2
, effecteurs moléculaire située en aval de la COX-2 au cours de l'infection par H. pylori
gastrique est restée non identifiée.
Ici, nous avons analysé l'expression du gène dans l'estomac épithélium des souris traitées avec le Cox-2 inhibiteur spécifique NS398, à différents moments après l'infection de H. pylori en utilisant des puces à ADN et ont été en mesure de définir des profils d'expression des gènes régulés par H. pylori
par Cox-2-dépendante Détermination des résultats de et mécanismes indépendants de la concentration. Cox-2 inhibiteur
Pour déterminer la concentration appropriée de l'inhibiteur dans notre H. pylori modèle d'infection, les taux de PGE2 ont été mesurés dans la muqueuse gastrique après H.
pylori infection en présence ou en l'absence de l'inhibition de la COX-2 avec NS398. les souris infectées ont montré une augmentation de 50% du niveau PGE2 dans la muqueuse gastrique. Le traitement des souris infectées par le NS398 (10 mg /kg) a conduit à une réduction de la PGE2, de telle sorte qu'elle ne diffère pas du groupe témoin (données non présentées). Nous avons donc conclu que la dose de 10 mg /kg était suffisante pour supprimer Cox activité 2 en présence de l'infection d'un H. pylori.
Administration à long terme de l'Cox-2 inhibiteur spécifique NS398 ne modifie pas significativement bactérienne colonisation ou scores inflammatoires
Toutes les souris dans les groupes infectés ont été colonisés par H. pylori
, tel que déterminé par la culture quantitative. La charge bactérienne n'a que légèrement augmenté dans la période comprise entre 6 et 19 semaines (figure 1A). L'administration de NS398 ne semble pas avoir un effet significatif sur la colonisation bactérienne. L'infection par H. pylori
a provoqué un faible pour gastrite classe moyenne chez des souris infectées qui a tendance à augmenter en gravité au fil du temps, mais n'a pas conduit à la formation d'ulcères ou des preuves de métaplasie (voir la figure 1B et 1C Figure pour les comparaisons de souris dans chaque groupe à la semaine 13). Ces observations sont en accord avec les rapports d'autres études où les souris ont été infectées pendant des périodes similaires de temps [23, 24]. L'analyse histologique a montré l'administration du véhicule et NS398 seul induit une gastrite à faible teneur au fil du temps (figure 1B). Figure 1 Administration de la Cox-2 spécifique inhibiteur NS398 ne modifie pas significativement la colonisation bactérienne ou les scores inflammatoires. A. Le traitement par NS398 n'a aucune influence sur la colonisation de H. pylori dans C57 BL /6 souris. CFU récupérées dans les estomacs de souris individuelles à 6, 13 et 19 semaines après l'infection (cercles pleins). B. Répartition des scores de pathologie chez les souris infectées et de contrôle. Pathologie a été marqué selon le système Sydney comme suit: pas d'inflammation (0), de bas grade, la gastrite non-active et de bas grade doux-actif gastrite (1), classe moyenne gastrite légère (2). C. hématoxyline et de l'éosine colore les coupes de paraffine de post-infection 13 semaines, des images représentatives des souris non infectées traitées avec le véhicule seul (V), des souris non infectées traitées avec NS398 (NS398), les souris infectées (V + Hp
), et les souris infectées traitées avec NS398 (NS398 + Hp
). Par semaine 13 (17 semaines après l'infection), gastrite modérée a été observée à la fois dans V + Hp
et les groupes de NS398 + Hp. grossissement 20 x, barre d'échelle = 50 pm
ARN à partir d'animaux avec des scores similaires et des niveaux de colonisation (3 souris par groupe) ont été regroupées et utilisées pour effectuer les trois comparaisons expérimentales:. non-infectés par rapport infecté (V vs
V + Hp
), infectés par rapport NS398 traité et infecté (V + Hp vs
NS398 + Hp
), et non infectés et non-infectés et NS398 traité (V vs
NS398) (figure 2A). L'expérience a été conçue pour nous permettre de déterminer les profils d'expression des gènes dans les estomacs des souris recevant le véhicule seul ou NS398 dans le véhicule, et d'isoler ceux-ci contre les effets de l'infection de H. pylori. La figure 2 l'expression génique globale dans la muqueuse gastrique des souris infectées par H. pylori. schéma A. Venn illustrant la répartition des gènes exprimés de manière différentielle (plus de 3 fois vers le haut ou vers le bas) sur la période de l'étude. Le nombre de gènes qui passent les critères de coupure est indiqué pour chaque comparaison expérimentale: Infecté par rapport à des souris non infectées (V vs
V + Hp
), les souris infectées par rapport NS398 traitées et des souris infectées (V + Hp vs
NS398 + Hp
), et non infectés des souris par rapport à NS398 traité (V vs
NS398). Les chiffres entre parenthèses représentent le nombre total de gènes différemment exprimés dans les trois comparaisons expérimentales. B. Tendance parcelles représentant l'expression génique globale mesurée dans les 3 comparaisons expérimentales. Chaque point sur les axes y représente le rapport d'expression moyen pour les gènes qui passent les critères de coupure aux semaines 6, 13 et 19 après le début du traitement, à savoir une ligne représente un gène. Les 33 gènes liés à une infection qui sont différemment exprimés à la suite d'un traitement NS398 sont surlignés en rouge pour toutes les comparaisons. Cox-2 (PTGS2) est indiqué par la ligne jaune.
Expression génique globale dans la muqueuse gastrique de H. pylori
souris infectées
L'ARN utilisé dans cette étude a été extrait de la muqueuse gastrique
seulement, et les analyses histologiques des estomacs préparés de cette manière ont confirmé que le muscle ou d'un autre tissu conjonctif sous-jacente de la muqueuse ne sont pas inclus dans nos préparations (non représentées). Les changements dans l'expression des gènes observés dans cette étude sont donc très probablement le reflet d'une réponse transcriptionnelle limitée à celle des cellules épithéliales gastriques et le développement et infiltrats lymphocytaires granulocytes qui caractérisent l'infection par H. pylori chronique. Les seuils de changements significatifs dans l'expression des gènes ont été fixés à la p < 0,05 et trois fois le changement [25].
Chez la souris H. pylori
infectées, 385 gènes a passé la coupure des critères au moins une fois pendant l'étude (figure 2A). H. pylori
infecté des souris qui ont été traités avec NS398 eu 160 Les gènes exprimés de manière différentielle. Chez les souris traitées avec NS398 seul, 140 gènes ont été exprimés de manière différentielle (figure 2A). En utilisant une approche soustractive, les gènes ont été divisés en sous-groupes reflétant les principaux effets expérimentaux:. H. pylori
infection, Cox-2 suppression, et Cox-2 suppression lors de l'infection
infection par H. pylori
induit une motif complexe de l'expression génique globale au cours de la période de l'expérience (figure 2B). Le traitement des souris infectées par le NS398 a donné lieu à une signature d'expression de gène distinct, qui est complémentaire à l'effet de l'infection. Trente-trois des gènes différemment exprimés chez des souris infectées a été le résultat d'un traitement NS398 (rouge a mis en évidence des gènes), en outre encore 107 gènes ont été exprimés uniquement chez les souris traitées et infectées NS398. De cette manière, un sous-groupe de gènes défini Cox-2 gènes dépendants a été créé. Nous subdivisé ces gènes en sous-groupes afin de faciliter une analyse plus approfondie sur la base des catégories Gene Ontology en utilisant l'outil DAVID pour l'annotation des gènes au http NCBI:... //David abcc ncifcrf gov /. Le tableau 1 contient une sélection Cox-2 gènes dépendants (une liste complète peut être trouvée dans le fichier complémentaire 1, tableau S2). La plupart des gènes ont montré un modèle d'expression fluctuant indiquant que les mécanismes de contrôle et les effets cumulatifs de l'infection et de la Cox-2 suppression jouent un rôle dans l'expression des gènes sur time.Table 1 design expérimental
semaine

-4 & -3
0
6
13
19
souris (n)
Véhicule seulement
(V )
17
infection Mock
traitement commence
5
6
6
NS398 (10 mg /kg)
(NS398)
17
infection Mock
traitement commence
5
6
6
véhicule plus H. pylori
(V + Hp
)
24
Infect SS1 de traitement begin 8
8 8
NS398 (10 mg /kg) plus H. pylori
(NS398 + Hp
)
24
Infect SS1 Traitement
commencer 8
8 8
Après semaine 0 souris ont reçu sc quotidienne. injections de NS398 ou du véhicule comme indiqué. Les souris ont été tuées à 6. 13 et 19 semaines après le début du traitement et de H. pylori
colonisation (ufc), Effet de puis scores de pathologie ont été déterminées et l'ARN total a été préparé. Du NS398 sur les profils d'expression génique gastriques
des études antérieures sur la Cox-2 inhibitor NS398 dans une variété de in vitro
et dans des modèles in vivo
ont démontré qu'il est un inhibiteur spécifique de la Cox-2 activité avec peu ou pas d'influence sur la étroitement liée, constitutivement exprimé Cox-1
[26, 27]. Dans notre étude, l'administration à long terme semble avoir des effets sur l'expression des gènes qui peuvent avoir été résolus ou compensés après plusieurs mois, comme une grande partie des gènes qui étaient régulés à la hausse après la semaine 6 de l'administration ont pas différemment exprimé après semaine 13 (figure 2B et tableau 1). Seulement 33 des gènes qui ont été influencés par NS398 ont également été réglementés en réponse à l'infection. Une liste complète des gènes régulés à la suite d'un traitement NS398 est affiché (Fichier supplémentaire 1, tableau S3.
Pour compléter la méthode «soustractive» de classer les gènes, les données ont été regroupées en utilisant une approche non supervisée Une matrice d'auto-commande. (SOM) a été créée en utilisant tous les Cox-2 gènes dépendants, la figure 3 montre un tracé SOM des gènes Cox2-dépendants identifiés dans l'étude (à gauche), le panneau de droite montre une matrice des mêmes gènes pour indiquer l'effet de H . infection pylori
seul sur les mêmes gènes (Voir également le tableau 2). de façon générale, les gènes régulés est tombé dans les catégories fonctionnelles d'être liée à la fonction de barrière épithéliale, la prolifération et le maintien ou l'inflammation (résumé dans la figure 3B) .Table 2 Pliez changement dans l'expression génique de gènes sélectionnés réglementés à la suite de l'infection par H. pylori
et /ou un traitement avec la Cox-2 inhibiteur spécifique NS398
Gene Ontology de> SYMBOLE
GENE NOM

V vs V + Hp
V + Hp vs
V NS398 + Hp vs NS398
6
13
19
6
13
19
6
13
19
Adn
adipsine
chymotrypsine, activité.
complément activation.
3.06
1.9
-1.32
-2.4
1.93
-1.07
-1.53
-2.56
-1.97
Akt3
thymoma proto-oncogène viral 3
protéine acide aminé phosphorylation
-1.52
6.68
-1.02
-1.09
1.28
1.33
-1.44
-1.03
-1.06
AV148957
Connexin 45
eau transport
1.39
-3.25
-1.04
1.29
-1.11
1.39
1
1.09
-1.01
Ccl5
chemokine (CC motif) ligand 5
activité de chimiokine.
Réponse inflammatoire
1,23
-1.13
3.01
1,08
-1.13 -1.54

-1.21
1,48
1,08
CDPH. DMBT1
supprimé dans les tumeurs cérébrales malignes 1 /crp ductin, muclin
activité de récepteur scavenger.
tumeur suppressor
4.15
-3.15
7.74
-2.64
-2.09
-2.15
1.78
1.28
-1
Gast
gastrin
hormone activité
6,37
-1.21
1.8
-8.41 -1.87

-1.01 1
-2.35
1,45
Hsp70-3
protéine de choc thermique 1A
chaperon activity
5.3
-1.86
1.31
-5.41
1.13
-1.15
3.23
-1.35
1.11
Icsbp1
interferon consensus suivants binding protein 1
réponse immunitaire;. transcription regulation
1
-1.31
3.36
1.19
1.23
-1.39
1
2.04
-1.37
Ifi47
interferon gamma protéine inductible
liaison de l'ATP activity
1.3
-1.29
6.03
1.2
-1.13
-1.97
-1.85
-1.29
1.45
Ly75
lymphocyte antigène 75 réponse
de défense
1,23
-2.25
3,37
1,36
-1.15 1
1 1
1,39
Mup5
activité de liaison urinaire de protéine 5
phéromone majeure, les transports, le transporteur activity
4.94
-1.08
3
-6.56
-1.23
-2.5
7.56
-1.5
1.31
Ptgs1
prostaglandin-endoperoxide synthase 1
prostaglandine biosynthesis
-1.36
-1.03
-1.02
1.16
1.03
1
1.26
1.47
1.12
Ptgs2
prostaglandin-endoperoxide synthase 2
prostaglandine biosynthesis
1.27
4.34
1.47
-1.02
1.17
1
-1.55
-1.24
-1.47
Odc
Ornithine decarboxlyase
carboxy- activité lyase
1,05
-1.69 -1.19

-1.34
-3.12 -1.11

1,94
-1.4
1,23
Slc7a11. famille de support en soluté 7 membres 11. CD98 de de lumière CD98 lumière
acide aminé cationique transporter
1.37
3.42
1.19
1.09
2.24
1.33
-1.7
-1.64
-1.07
Tff1
trefoil facteur 1
réponse à wounding
-2.94
5.57
-3.06
-2.28
9.16
-1.56
-1.37
-6.56
2.84
Tgtp
T-cell GTPase activité spécifique
GTP
1,26
-1.24
8,29
1,55
-1.17 -2.72

-1.37
1,31
1,43
le Gene Ontology (GO) classification indique la fonction du gène. Une liste complète du niveau de tous les gènes de l'étude d'expression peut être trouvée dans le fichier complémentaire 1, tableaux S1-3.
Figure 3 expression modèle de Cox-2 dépendante . gènes A. Deux dimensions matrice auto-commande (SOM) grappe montrant le niveau d'expression relative de tous les gènes de la Cox-2 dépendantes identifiés dans cette étude (p > 0,05). Up- ou vers le bas-réglementation sont indiqués par le rouge, ou bleu ombrage respectivement. ombrage noir indique l'expression du gène similaire dans les deux échantillons. le panneau de droite montre le cluster dérivé du modèle d'expression des gènes dans les NS398 souris traitées (V + Hp
vs NS398 + Hp
). le panneau de gauche montre la . expression des mêmes gènes chez les souris infectées (unclustered) fonctions des gènes et des références bibliographiques pertinentes à H. pylori
infection sont présentés dans le Tableau 3. gènes adaptant les catégories fonctionnelles les plus importants sont mis en évidence avec la couleur: bleu prolifération /apoptose (pâle ), l'intégrité épithéliale (orange), la réponse inflammatoire (rouge) et de la physiologie gastrique (vert) B. Schéma résumant l'effet physiologique global des gènes Cox-2 dépendantes sur la période de l'expérience, les catégories de gènes sont colorés comme dans A.
Confirmation de l'expression des gènes de la Cox-2 dépendantes sélectionnées
Le changement moyen au niveau de Cox1 (Ptgs1)
et Cox2 (PTGS2)
expression, et une sélection de gènes Cox2-dépendants impliqués dans l'inflammation (intracellulaire molécule d'adhésion 1, ICAM1
; Facteur de croissance transformant b1, TGFb1
), la fonction gastrique (Gastrin, Gast
), la fonction de barrière (Aquaporin 5, AQP5;
Tight protéines de jonction 1, Tjp1
) et la prolifération /carcinogenèse (ornithine décarboxylase , ODC1
) a été déterminée pour les souris individuelles à tous les points de temps par PCR en temps réel (fichier additionnel 1, tableau S4). Dans 94% des cas, le changement d'expression pouvait être confirmée (en amont ou en aval régulé au cours des trois fois coupé critères).
Chez les souris traitées NS398, l'expression de Tjp1
a considérablement augmenté dans les premiers stades de l'étude par rapport à des souris infectées (figure 3). La souris EST homologue à connexine 45 (AV148957, Gja7) a également diminué chez les souris infectées, quel que soit le traitement NS398, comme cela a été un aquaporin gastrique AQP5 (Figure 3). Cela suggère que la Cox-2 inhibition a un effet sur le H. pylori
médiation influence de la fonction barrière gastrique, donc nous avons étudié ce point dans un modèle in vitro dans. analyse par Western blot a montré que l'infection par H. pylori
a également conduit à des augmentations de Zona occludens 1 (ZO1, homologue humain à Tjp1) d'expression de protéine in vitro
en MKN28 cellules épithéliales gastriques, et que cette augmentation a été inhibée dans le présence de NS398 (figure 4A). Chose intéressante, cet effet était indépendant de la présence d'un système de sécrétion de type IV intacte, ou la présence de la cytotoxine VacA, comme les mutants de deletion de H. pylori ont également induit l'expression de la ZO1 (figure 4B). L'expression de l'ODC a été diminuée dans les cellules traitées avec MKN28 NS398 (figure 4C), et est également indépendant de la présence d'un appareil fonctionnel de la section de type IV ou d'une VacA. Figure 4 Cox-2 expression dépendante du ZO1 et ornithine décarboxylase dans les cellules MKN28 dépendantes de H. pylori. A. Expression du zona occludens-1 (DO1) a été déterminée par western blot après l'infection de 6 h dans les cellules MKN28 soit avec H. pylori
sauvage de type P12 ou les mutants isogéniques manquants l'ensemble cag PAI (PAI), ou VacA (VacA). ZO1 est régulée jusqu'à après l'infection, indépendamment de CagA PAI ou VacA (supérieur), alors que l'expression était diminuée dans les cellules traitées avec NS398 (inférieur). B. Expression de la protéine ornithine décarboxylase (ODC) n'a pas été affecté par l'infection de H. pylori, mais a diminué en présence du Rapport de NS398.
Le but de cette étude était d'améliorer nos connaissances sur le rôle de la cyclooxygénase-2 dans -triggered inflammation de la muqueuse de H. pylori en identifiant de nouveaux effecteurs moléculaires en aval. Le vivo
approche adoptée ici a également donné un aperçu au niveau du transcriptome, dans les changements complexes qui se produisent à la suite de la réponse inflammatoire chronique de l'infection à H. pylori et de Cox-2 inhibition.
les deux l'infection de H. pylori, et le traitement NS398 suscité signatures de transcription uniques dans la muqueuse gastrique de souris, malgré la similitude des scores de pathologie et de la densité de colonisation entre les différents groupes (Figure 1). Ceci est intéressant parce que, dans un autre rapport en utilisant un modèle de lymphome associé aux muqueuses tissu lymphoïde (lymphome de MALT), les profils de transcription dans BALB /c des souris infectées par H. heilmannii
ont été déterminées après 12 à 24 mois, et les changements majeurs dans le gène de règlement a eu lieu dans les premiers stades de la maladie (< 12 mois, doux à la pathologie modérée) [28]. Après ce temps, le regroupement des 300 gènes exprimés de manière différentielle la plus permis la ségrégation des souris infectées en groupes correspondant presque exactement à leur caractérisation pathologique. Compte tenu de nos données, nous pouvons conclure que pendant la phase de développement précoce de la gastrite chronique active, l'analyse de la pathologie standard n'est pas en mesure de détecter subtile, mais des changements importants dans la muqueuse.
NS398 inhibe spécifiquement l'activité de la Cox-2 des protéines et des altérations de la Cox-2
l'expression génique pourraient être attendus lorsque les souris infectées ont été traitées avec un inhibiteur de la COX-2 spécifique, que ce soit en raison d'un mécanisme de rétroaction possibles impliquant PGE 2 [29], ou comme un mécanisme de compensation pour surmonter l'inhibition enzymatique. Aucun changement significatif dans l'expression de la COX-2 a été observée in vivo
cependant, supportant la notion que l'expression du gène de la COX-2
dans l'estomac est contrôlée par une variété de facteurs. COX-2 est exprimée par les cellules inflammatoires et gastriques épithéliaux [22] et son expression peut être contrôlée par des mécanismes différents dans différents types de cellules.
Nous avons été en mesure d'identifier un sous-ensemble de gènes qui étaient différentiellement exprimés à la suite de Cox suppression -2, en soulignant la portée de l'influence de la COX-inhibiteurs de l'inflammation gastrique. Cox-2 gènes dépendants est tombé dans de nombreuses catégories fonctionnelles, principalement ceux qui sont impliqués dans la physiologie gastrique (sécrétion acide, motilité), la réparation épithéliale et la prolifération, et des médiateurs inflammatoires
. Gastrin (Gast
) est un médiateur important dans l'estomac [30-34] et d'expression dans la muqueuse a été fortement influencée, non seulement par une infection par H. pylori
, mais aussi par la suppression de la Cox-2 activité (Figure 3, fichier supplémentaire 1, tableau S4). En plus de son rôle dans la régulation de la sécrétion d'acide gastrique, la gastrine a des effets trophiques et régule la prolifération et de la réparation de la muqueuse. En effet INS-GAS souris transgéniques qui souffrent de hypergastrinémie développer un cancer après une infection par H. pylori
[35]. Le développement d'un carcinome est cependant limitée aux hommes de ce modèle [35]. D'autres chercheurs ont également observé que la Cox-2 inhibition influencé l'expression de gastrine dans un vitro modèle de cancer colorectal dans [34], et aussi dans H. pylori
patients atteints de cancer gastrique positifs [36].
Considérant que l'expression de la apoptose médiation facteur de différenciation de croissance 3 (GdF3 de
) et c-Myc (myCS
) gènes ont culminé à la semaine 13, la clustérine de gène d'apoptose inhibant (Clu de
) a fortement diminué à ce point de temps. Pris dans leur ensemble, le motif d'expression génique suggère un changement dans la vitesse de prolifération /apoptose de l'épithélium après 13 semaines d'infection à la suite d'un traitement NS398. Des études à plus long terme seraient nécessaires pour déterminer si cet effet se poursuit ou se reproduit. Un certain nombre de gènes qui ont été observés précédemment pour être surexprimé dans les tumeurs (myCS, Clu
) [37], des suppresseurs de tumeurs (Patched, Ptch
), ou autrement impliqués dans la métastase ou la réparation d'ADN: bikunine ( AMBP
) [38], le gène de l'ornithine décarboxylase (ODC
), facteur de Trefoil 1 (TFF1 de
) [39], l'insuline comme facteur de croissance (Igf2
) [40] et de protéines de réparation de l'ADN 1 (DDB1
), ont été également exprimés de manière différentielle dans NS398 traité des souris infectées (figure 3). Le profil d'expression était complexe cependant, et certains médiateurs ont tendance à être renforcée par Cox-2 suppression, alors que la majorité a été régulée à la baisse (Figure 3). Cela reflète probablement un rôle régulateur pour la COX-2 dans le cadre d'un réseau de dispositifs de contrôle pour le maintien de l'épithélium. le gène de l'ODC, par exemple, code pour une enzyme régulatrice clé dans la production de polyamines qui sont essentielles pour la prolifération cellulaire [41] et a été montré à jouer un rôle aux côtés de la COX-2 dans le développement de la gastrite atrophique [42, 43]. Il a été proposé que les inhibiteurs de la COX-2 peuvent inhiber l'ODC et de cette manière être responsable des effets anti-prolifératifs observés des inhibiteurs Cox-2 [44]. Notre observation de la diminution de l'expression Odc à la suite de NS398 traite l'infection de H. pylori dans les deux in vivo et in vitro

études (Tableau 1 et la Figure 4C) est en accord avec cette notion.
Helicobacter l'infection est fortement associée à l'induction d'une réponse inflammatoire de type Th1 forte, avec des niveaux élevés d'IFN-y, ce qui induit l'expression d'autres médiateurs inflammatoires tels que l'iNOS et COX-2
, et également des facteurs de croissance circulants tels que la gastrine [45]. Soutenir l'idée que l'IFNy joue un rôle clé dans l'attraction et l'activation des lymphocytes [46, 47], nous avons observé que l'expression de marqueurs de surface des cellules T ICAM1
[48, 49] et CD86
et ligands (Vente
) [50] a atteint un sommet à la semaine 13 chez les souris infectées. GTPases dépendant de l'interféron (Igtp de

, Iigp en attente) régulent les activités anti-microbiennes de l'IFNy de manière dépendante de la STAT1 [51, 52], et leur expression a été considérablement réduits dans les souris traitées NS398 à la fin de l'étude. Dans l'ensemble, l'inhibition de la COX-2, l'activité a conduit à une expression réduite de médiateurs inflammatoires entre les semaines 13 et 19 (figure 3); intéressant ce changement n'a pas été reflété dans les scores de pathologie. Cox-2 a été montré pour moduler l'équilibre TH1 /TH2 de la réponse inflammatoire et une inhibition de la COX-2 en utilisant NS398 conduit à une polarisation de la réponse in vitro des PBMC humaines stimulées
vers Th1 [53]. Les auteurs ont émis l'hypothèse que l'expression chronique de la Cox-2 et la production des résultats de la PGE2 dans l'inhibition de l'efficacité de la réponse immunitaire mucosale par l'amélioration d'un état de tolérance. Le motif d'expression du gène, nous avons observé ici est en effet compatible avec l'effet de la Cox-2 une inhibition de la réponse inflammatoire (voir figure 3 et tableau 1), bien que les changements dans l'expression des médiateurs classiques Th1 /Th2 comme l'IL-12, I-10 et IL-4 ne diffère pas de manière significative dans notre étude.
infection par H. pylori
a été signalé à endommager l'intégrité épithéliale et plusieurs mécanismes potentiels pour cette ont été rapportés (revue dans [54]). CagA, le facteur de pathogénicité d'un grand H. pylori, est transloqué dans les cellules épithéliales via l'appareil de sécrétion de type IV [55, 56]. Des études dans un modèle de cellules de rein canin (MDCK) ont montré que associés CagA avec le serré zona jonction protéine adaptatrice occludens 1 (ZO-1, un homologue de souris -tight protéine de jonction 1, Tjp1) et la molécule d'adhésion jonctionnelle (JCAM ou confiture), conduisant une longue interruption de la durée de la fonction de barrière épithéliale
in vitro [57]. Alors que nous avons observé l'expression de Tjp1
augmenté au niveau de la transcription chez des souris infectées NS398 traitées, JCAM de l'expression n'a pas été affectée. En outre, une EST homologie avec la connexine 45 (AV148957, Gja7
) et AQP5
ont été influencés par H. pylori infection
quel que soit le traitement NS398 (Figure 3). Comme les deux connexine 45 et AQP5 sont savent jouer un rôle dans le transport intercellulaire de petites molécules d'eau et, et il y a des preuves expérimentales que la connexine 45 interagit directement avec Tjp1 [58, 59], il semblerait que la Cox-2 a également un rôle dans le maintien de l'équilibre hydrique dans l'épithélium gastrique. Cette idée est soutenue par nos in vitro
observations d'une augmentation de cox-2 dépendante de Zo-1 expression de la protéine dans les cellules MKN28. Par contraste avec les rapports Amieva et al. [57] cet effet n'a pas été liée à l'état de CagA de H. pylori
(Figure 4). effets de la fonction de barrière dans le modèle de la souris sont en tout cas peu probable en raison des actions de CagA, car même si nous avons constaté que H. pylori
SS1 protéine exprimée CagA, nous ne sommes pas en mesure de détecter la translocation soit in vitro
ou dans des expériences in vivo
(données non présentées). Par conséquent, il semblerait que l'infection de H. pylori a des mécanismes supplémentaires pour influer sur l'intégrité épithéliale. Il est également à noter qu'un autre H. pylori
facteur de pathogénicité, la toxine vacuolante (VacA) provoque la formation de vacuoles remplies de liquide dans les cellules épithéliales et de plus, cette activité peut être inhibée in vitro par un traitement
NS398 [60] . Comme le aquaporine gastrique AQP5 est exprimé sur les membranes latérales et intercellulaires dans les cryptes gastriques [59], nous pensons que cette porosité est influencée par des modifications de protéines de jonctions serrées, et qu'elle joue un rôle dans le développement d'un œdème dans l'épithélium pendant infection.
Un certain nombre de rapports publiés ont tenté de faire la lumière sur la régulation des gènes chez H. pylori
infection en utilisant l'approche des biopuces pour étudier l'expression globale des gènes dans les cellules épithéliales gastriques in vitro
[61-63] ( revue dans [64]), rendant une régulation à la hausse rapide de médiateurs de l'inflammation et d'une variété de facteurs de transcription soit les caractéristiques du motif d'expression. Dans notre étude, aucun des gènes de prolifération liés (c-Fos, b-Fos, c-Jun
et (PCNA de
cyclinD1)) déclarés par Sepulveda et al.
, Ni ceux signalés par Cox et al
.

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