L'identificazione di nuovi geni cicloossigenasi-2-dipendente a infezione da Helicobacter pylori in vivo

identificazione di nuovi geni cicloossigenasi-2-dipendente Helicobacter pylori
infezione in vivo
astratta
sfondo
Helicobacter pylori
è determinante cruciale nella patogenesi delle malattie gastriche benigne e neoplastiche. Cicloossigenasi-2 (COX-2) è l'enzima chiave inducibile del metabolismo dell'acido arachidonico ed è un mediatore centrale nella infiammazione e cancro. L'espressione della COX-2
gene è up-regolati nella mucosa gastrica durante H. pylori
infezione, ma le conseguenze di questo patobiologici migliorato Cox-2 non sono ancora caratterizzati. Lo scopo di questo studio è stato quello di identificare nuovi geni a valle di Cox-2 in un vivo
modello, identificando così potenziali bersagli per lo studio del ruolo della Cox-2 in H. pylori
patogenesi ed il l'inizio di cambiamenti cancerosi pre.
Risultati profili di espressione genica nella mucosa gastrica dei topi trattati con uno specifico inibitore COX-2 (NS398) o di un veicolo sono stati analizzati in diversi momenti (6, 13 e 19 settimana) secondo H. pylori
infezione. H. pylori
infezione influenzato l'espressione di 385 geni nel corso del periodo di sperimentazione, tra cui le autorità di regolamentazione di fisiologia gastrica, la proliferazione, l'apoptosi e la difesa della mucosa. In condizioni di Cox-2 inibizione, 160 geni bersaglio sono stati regolati a seguito di H. pylori
infezione. Il sottoinsieme dipendente di Cox-2 inclusi quelli che influenzano la fisiologia gastrica (gastrina, Galr1
), la funzione di barriera epiteliale (Tjp1, connexin45, AQP5
), infiammazione (ICAM1
), apoptosi (Clu
) e proliferazione (GDF3, Igf2
). Il trattamento con NS398 solo causato espressione differenziale di 140 geni, di cui 97 erano unico, indicando che questi geni sono regolati in condizioni di basale Cox-2.
Conclusione
Questo studio ha identificato un gruppo di romanzo Cox-2 geni dipendenti influenzato sotto sia normale che le condizioni infiammatorie indotte da H. pylori
infezione. Questi dati forniscono importanti nuovi collegamenti tra Cox-2 e processi infiammatori, la riparazione e l'integrità epiteliale.
Sfondo
Helicobacter pylori
infezione è associato ad una varietà di disturbi gastrici tra cui gastrite cronica, ulcera peptica, mucose associato tessuto linfatico (MALT) linfoma, e adenocarcinoma gastrico [1, 2]. La patogenicità del batterio è determinato da influenze epidemiologici, nonché fattori batterici e host [1, 3]. colonizzazione batterica della mucosa gastrica porta allo sviluppo di un infiltrato infiammatorio cronica, che è accompagnato da aumento del rilascio di mediatori infiammatori, fattori di crescita e metaboliti reattivi dell'ossigeno [2, 4].
Il inducibile enzima COX-2 e la sua costitutivamente espresso isoforma Cox-1 sono i regolatori chiave del metabolismo delle prostaglandine umana [5-7]. I prodotti finali della loro attività enzimatica comprendono un pannello di prostaglandine e trombossani, che sono stati identificati come regolatori critici di processi fisiologici e patologici fondamentali, tra cui l'aggregazione piastrinica, il parto, lo sviluppo delle cellule T, l'infiammazione e cancro [5-7]. Cox-2 attività enzimatica è in gran parte regolato da de novo
sintesi di COX-2 proteine ​​[5, 6].
Nello stomaco, arricchito di Cox-2
espressione è stata trovata durante H. pylori
-triggered gastrite così come nelle lesioni da stress mucose, ulcere gastroduodenali e dopo che il danno da ischemia /riperfusione [8-10]. Cox-2 e le sue prostanoidi correlate sembrano anche contribuire alla patogenesi del cancro gastrico. adenocarcinoma e precancerose lesioni della mucosa gastrica spesso sovra-esprimono la COX-2
gene [11-14], ed elevati livelli intratumorale Cox-2 sembrano essere associati con più profonda invasione tumorale [15] e un aumento della frequenza di metastasi linfatica [ ,,,0],16]. Inoltre, inibitori Cox-2 hanno dimostrato di sopprimere potentemente la proliferazione delle cellule di cancro gastrico umano in vitro
[1, 17, 18] così come sperimentali adenocarcinoma gastrico in topi nudi [17]. Recentemente, tuttavia, una serie di relazioni hanno messo in discussione l'idea che questa attività anti-tumorale è dovuto alla inibizione della COX-2 stesso [19]. Gli individui che assumono COX-inibitori sono stati riportati per visualizzare un rischio ridotto per lo sviluppo di carcinoma gastrico [20], ma gli effetti collaterali cardiovascolari associate alla somministrazione di coxib cronica significa che l'uso clinico degli inibitori COX per il trattamento anti-cancerogena è controversa (recensito in [21])
. l'espressione della COX-2
gene sembra quindi essere un passo importante nella patogenesi di malattie gastriche benigne e maligne e, pertanto, chiarire non solo del suo contributo alla H. pylori
patogenesi-dipendente, ma anche gli effetti a valle di Cox farmaci inibitori è di particolare significato clinico.
Abbiamo precedentemente dimostrato che H. pylori
possono influenzare direttamente l'espressione di COX-2
nelle cellule epiteliali gastriche attraverso meccanismi trascrizionali, e l'attivazione di MAPK-ERK-dipendente identificati di una prossimali cis
-regulatory elemento CRE-Ebox come un passo fondamentale nel H. pylori
-response della Cox-2
gene [22] . Mentre questi risultati hanno confermato ulteriormente il legame fisiopatologico tra il batterio e Cox-2
, effettori molecolari a valle di Cox-2 durante H. pylori
infezione gastrica rimasta non identificata.
Qui abbiamo analizzato l'espressione genica nel gastrica epitelio di topi trattati con l'inibitore specifico di Cox-2 NS398, in diversi momenti dopo H. pylori
infezione utilizzando DNA microarray e sono stati in grado di definire profili di espressione genica regolati da H. pylori
attraverso Cox-2-dipendente e meccanismi indipendenti.
Risultati
Determinazione della concentrazione di inibitore COX-2
Per determinare la concentrazione adeguata di inibitore nel nostro H. pylori
modello di infezione, i livelli di PGE2 sono stati misurati a livello della mucosa gastrica secondo H. pylori
infezione in presenza o assenza di Cox-2 inibizione NS398. topi infettati hanno mostrato un aumento del 50% del livello di PGE2 nella mucosa gastrica. Il trattamento di topi infettati con NS398 (10 mg /kg) ha portato ad una riduzione del PGE2 tale da non differire dal gruppo di controllo (dati non mostrati). Abbiamo quindi concluso che una dose di 10 mg /kg è stato sufficiente per sopprimere Cox 2 attività in presenza di un H. pylori
infezione.
Somministrazione a lungo termine dello specifico inibitore COX-2 NS398 non influenza in modo significativo batterica colonizzazione o punteggi infiammatori in tutte le nazioni topi nei gruppi infetti sono stati colonizzati da H. pylori
, come determinato dalla cultura quantitativa. La carica batterica è aumentato solo leggermente nel periodo compreso tra 6 e 19 settimane (Figura 1A). La somministrazione di NS398 non sembrano avere un effetto significativo sulla colonizzazione batterica. L'infezione da H. pylori
ha causato un basso grado di gastrite mezzo a topi infettati che tendeva ad aumentare in gravità nel corso del tempo, ma non ha portato alla formazione di ulcere o evidenza di metaplasia (vedere Figura 1B, 1C e Figura per il confronto di topi in ogni gruppo alla settimana 13). Queste osservazioni sono conformi rapporti da altri studi in cui topi sono stati infettati per periodi di tempo simile [23, 24]. L'analisi istologica ha evidenziato la somministrazione di veicolo e NS398 da solo induce una gastrite basso grado nel tempo (Figura 1B). Figura 1 Amministrazione dello specifico inibitore COX-2 NS398 non influenza significativamente la colonizzazione batterica o punteggi infiammatori. A. Il trattamento con NS398 non influenza H. pylori
colonizzazione C57 BL /6 topi. CFU recuperate dallo stomaco dei topi individuale a 6, 13 e 19 settimane dopo l'infezione (cerchi pieni). B. distribuzione dei punteggi patologia nei topi infetti e di controllo. Patologia è stato segnato in base al sistema di Sydney come segue: nessuna infiammazione (0), a basso grado, gastrite non -Active e basso grado lieve-attiva gastrite (1), di grado medio lieve gastrite attiva (2). C. ematossilina e eosina macchiato sezioni di paraffina da 13 settimane dopo l'infezione, immagini rappresentative dai topi non infetti trattati con solo veicolo (V), i topi non infettati trattati con NS398 (NS398), topi infettati (V + Hp
), e topi infetti trattati con NS398 (NS398 + Hp
). A settimana 13 (17 settimane dopo l'infezione), moderata gastrite attiva è stata osservata in entrambi i NS398 + Hp
gruppi V + Hp
e. ingrandimento originale × 20, bar scala = 50 micron
RNA da animali con punteggi simili e livelli di colonizzazione (3 topi per gruppo) sono stati messe in comune e utilizzato per svolgere le tre confronti sperimentali:. non infetto contro infetto (V vs
V + Hp
), infettato contro NS398 trattata e infettato (V + Hp vs
NS398
+ Hp), e non infetti rispetto a non-infetti e NS398 trattata (V vs
NS398) (Figura 2A). L'esperimento è stato progettato per consentire di determinare profili di espressione genica nello stomaco di topi trattati con solo veicolo o NS398 nel veicolo, e di isolare questi dagli effetti di H. pylori
infezione. Figura 2 l'espressione genica globale nella mucosa gastrica dei topi infettati da H. pylori. diagramma di Venn A. illustra la ripartizione dei geni espressi in modo differenziale (più di 3 volte verso l'alto o verso il basso) durante il periodo dello studio. Il numero di geni che rispondono ai criteri di cut-off è indicato per ogni confronto sperimentale: Infected contro topi non infetti (V vs
Hp
V +), i topi infettati contro NS398 trattata e topi infettati (V + Hp vs
NS398 + Hp
), e non infetti topi contro NS398 trattata (V vs
NS398). I numeri tra parentesi rappresentano il numero totale di geni espressi in modo diverso nei tre confronti sperimentali. B. Trend trame che rappresenta l'espressione genica globale misurata nei 3 confronti sperimentali. Ogni punto sulle assi Y rappresenta il rapporto medio di espressione per i geni che rispondono ai criteri di cut-off alle settimane 6, 13 e 19 dopo l'avvio di trattamento, vale a dire una linea rappresenta un gene. Le 33 geni correlati alle infezioni che sono stati diversamente espressi come conseguenza del trattamento NS398 sono evidenziati in rosso per tutti i confronti. COX-2 (Ptgs2) è indicato dalla linea gialla.
Espressione genica globale nella mucosa gastrica di H. pylori
topi infettati
L'RNA utilizzato in questo studio è stato estratto dalla mucosa gastrica
solo, e analisi istologiche di stomaco così preparati hanno confermato che il muscolo o altri tessuti connettivi sottostanti mucosa non sono stati inclusi nei nostri preparazioni (non mostrati). I cambiamenti nell'espressione genica osservati in questo studio sono quindi altamente probabile che riflettere una risposta trascrizionale limitato a quello delle cellule gastriche epiteliali e la linfocitica in via di sviluppo e infiltrati granulocitari che caratterizzano cronica H. pylori
infezione. Cut-off per cambiamenti significativi nell'espressione genica sono stati fissati a p < 0,05 e tre volte il cambiamento [25].
In H. pylori
topi infetti, 385 geni superato il cut-off criteri in almeno una volta durante lo studio (Figura 2A). H. pylori
infettato topi che sono stati trattati con NS398 avuto 160 geni differenzialmente espressi. Nei topi trattati con sola NS398, 140 geni erano differenzialmente espressi (Figura 2A). Utilizzando un approccio sottrattiva, i geni sono stati divisi in sottogruppi che riflettono i principali effetti sperimentali:. H. pylori
infezione, Cox-2 di soppressione, e Cox-2 soppressione durante l'infezione
infezione da H. pylori
indotto un complesso schema di espressione genica globale nel periodo dell'esperimento (Figura 2B). Il trattamento di topi infettati con NS398 comportato una diversa espressione genica, che era addizionale effetto dell'infezione. Trentatré dei geni diversamente espressi in topi infettati era un risultato del trattamento NS398 (rosso evidenziato geni), in aggiunta altri 107 geni sono stati espressi solo in topi trattati NS398 e infetti. In questo modo un sottogruppo di geni definito Cox-2 geni dipendenti è stato stabilito. Abbiamo suddiviso questi geni in sottogruppi per facilitare ulteriormente l'analisi in base alle categorie di Gene Ontology utilizzando lo strumento DAVID per il gene di annotazione al http NCBI:... //David ABCC ncifcrf gov /. La tabella 1 contiene selezionata Cox-2 geni dipendenti (una lista completa può essere trovata nel file aggiuntivo 1, Tabella S2). La maggior parte dei geni hanno mostrato un pattern di espressione fluttuante che indica che i meccanismi di controllo e gli effetti cumulativi di entrambe le infezioni e Cox-2 soppressione svolgere un ruolo nella espressione genica nel corso time.Table 1 disegno sperimentale
settimana

-4 & -3
0
6
13
19
Mice (n)
veicolo solo
(V )
17
infezione Mock
Trattamento iniziare
5 Pagina 6 Pagina 6
NS398 (10 mg /kg)
(NS398)
17
infezione Mock
Trattamento iniziare
5 Pagina 6 Pagina 6
veicolo più H. pylori
(V + Hp
)
24
Infect SS1
Trattamento cominciano Pagina 8 Pagina 8 Pagina 8
NS398 (10 mg /kg) più H. pylori
(NS398 + Hp
)
24
Infettare SS1
Trattamento iniziare Pagina 8 Pagina 8 Pagina 8
dopo settimana 0 topi hanno ricevuto sc quotidiana. iniezioni di NS398 o di un veicolo da solo come indicato. I topi sono stati uccisi a 6. 13 e 19 settimane dopo l'inizio del trattamento e H. pylori
colonizzazione (cfu), poi i punteggi patologia sono stati determinati e RNA totale è stato preparato.
Effetto del NS398 su profili di espressione genica gastrici
precedenti studi sulla Cox-2 inibitori NS398 in una varietà di in vitro Comprare e in vivo hanno dimostrato
è un inibitore specifico di attività Cox-2 con poca o nessuna influenza sul strettamente correlati, costitutivamente espresso Cox-1
[26, 27]. Nel nostro studio, la somministrazione a lungo termine sembrava avere effetti sull'espressione genica che possono essere stati risolti o il risarcimento del dopo diversi mesi, come gran parte dei geni che erano up-regolati dopo la settimana 6 di amministrazione non sono stati diversamente espressi dopo settimana 13 (Figura 2B e Tabella 1). Solo 33 dei geni che sono stati influenzati da NS398 sono stati regolati anche in risposta alle infezioni. Un elenco completo dei geni regolati a seguito di trattamento NS398 è mostrato (file aggiuntivo 1, Tabella S3.
Per completare il metodo 'sottrattiva' di classificazione dei geni, i dati sono stati raggruppati utilizzando un approccio senza sorveglianza. Una matrice di auto-ordinazione (SOM) è stato creato utilizzando tutte Cox-2 geni dipendenti, la figura 3 mostra un diagramma SOM dei geni Cox2 dipendenti identificati nello studio (pannello di sinistra), il pannello di destra mostra una matrice degli stessi geni per indicare l'effetto di H . pylori
infezione da solo sugli stessi geni (vedi anche tabella 2). in generale, i geni regolati cadde nelle categorie funzionali di parentela con funzione di barriera epiteliale, la proliferazione e la manutenzione o infiammazione (riassunto nella Figura 3B) .table 2 piegare cambiamento di espressione genica di geni selezionati regolamentati a seguito di infezione da H. pylori
e /o il trattamento con lo specifico inibitore COX-2 NS398
SYMBOL
GENE NOME
Gene Ontology
Il V vs V + Hp
V + Hp vs NS398 + Hp
V vs Ns398
6
13
19
6
13
19
6
13
19
Adn
Adipsin
chimotripsina, l'attività.
complemento activation.
3.06
1.9
-1.32
-2.4
1.93
-1.07
-1.53
-2.56
-1.97
Akt3
thymoma virale proto-oncogene 3
acido proteina amino phosphorylation
-1.52
6.68
-1.02
-1.09
1.28
1.33
-1.44
-1.03
-1.06
AV148957
Connexin 45
acqua transport
1.39
-3.25
-1.04
1.29
-1.11
1.39
1
1.09
-1.01
Ccl5
chemokine (CC motivo) ligando 5
attività chemochine.
Risposta infiammatoria
1.23 -1.13

3.01
1.08 -1.13

-1,54
-1.21
1.48
1.08
CRPD. Dmbt1
cancellato nei tumori maligni al cervello 1 /CRP ductin, muclin
attività del recettore scavenger.
tumore suppressor
4.15
-3.15
7.74
-2.64
-2.09
-2.15
1.78
1.28
-1
Gast
gastrin
hormone Attività
6.37 -1.21

1.8
-8,41
-1.87 -1.01

1 -2.35
1.45
Hsp70-3
shock termico proteine ​​1A
chaperone activity
5.3
-1.86
1.31
-5.41
1.13
-1.15
3.23
-1.35
1.11
Icsbp1
interferon consenso ss binding protein 1
risposta immunitaria;. trascrizione regulation
1
-1.31
3.36
1.19
1.23
-1.39
1
2.04
-1.37
Ifi47
interferon gamma proteina inducibile
legame ATP activity
1.3
-1.29
6.03
1.2
-1.13
-1.97
-1.85
-1.29
1.45
Ly75
lymphocyte antigene 75 risposta
difesa
1.23 -2.25

3.37
1.36 -1.15

1 1
1 1.39
Mup5
importante urinaria di proteine ​​5
feromone attività di legame; trasporto; trasportatore activity
4.94
-1.08
3
-6.56
-1.23
-2.5
7.56
-1.5
1.31
Ptgs1
prostaglandin-endoperoxide sintasi 1
prostaglandina biosynthesis
-1.36
-1.03
-1.02
1.16
1.03
1
1.26
1.47
1.12
Ptgs2
prostaglandin-endoperoxide sintasi 2
prostaglandina biosynthesis
1.27
4.34
1.47
-1.02
1.17
1
-1.55
-1.24
-1.47
Odc
Ornithine decarboxlyase
carbossi attività liasi
1.05
-1,69
-1.19 -1.34

-3,12
-1.11
1.94
-1.4
1.23
Slc7a11. CD98 luce
famiglia vettore soluto 7 membro luce 11. CD98
amminoacido cationico transporter
1.37
3.42
1.19
1.09
2.24
1.33
-1.7
-1.64
-1.07
Tff1
trefoil Fattore 1
risposta wounding
-2.94
5.57
-3.06
-2.28
9.16
-1.56
-1.37
-6.56
2.84
Tgtp
T-cell specifica GTPasi attività
GTP di legame
1.26 -1.24

8.29
1.55 -1.17

-2,72 -1,37

1.31
1.43
il gene Ontology (GO) la classificazione indica la funzione del gene. Una lista completa dei livelli di espressione di tutti i geni nello studio può essere trovato nel file aggiuntivo 1, Tavoli S1-3.
figura 3 espressione modello di Cox 2-dipendente . geni A. matrice di auto-ordinazione bidimensionale (SOM) di cluster mostrando relativo livello di espressione di tutti i geni Cox-2 dipendenti identificati in questo studio (p > 0,05). Up o verso il basso e decreti di attuazione sono indicati con colore rosso, o blu ombreggiatura rispettivamente. ombreggiatura nera indica l'espressione genica simile in entrambi i campioni. il pannello di destra mostra il cluster derivato dal pattern di espressione genica in NS398 topi trattati (V + Hp
vs NS398 + Hp
). il pannello di sinistra mostra la . espressione degli stessi geni nei topi infettati (non cluster) funzioni geniche e riferimenti bibliografici rilevanti per H. pylori
infezione sono riportati nella Tabella 3. i geni che corrispondono alle categorie funzionali più importanti sono evidenziati con il colore: blu proliferazione /apoptosi (pallido ), integrità epiteliale (arancione), risposta infiammatoria (rosso) e fisiologia gastrica (verde) B. Schema riassume l'effetto fisiologico complessiva dei geni Cox-2 dipendente nel periodo dell'esperimento, categorie gene sono colorati come in A.
Conferma di espressione dei geni Cox-2 dipendenti selezionati
La variazione media del livello di espressione di COX1 (COX-1)
e Cox2
(Ptgs2), e una selezione di geni Cox2-dipendenti coinvolti nel processo infiammatorio (intracellulare molecola di adesione 1, ICAM1
; Fattore di crescita trasformante b1, Tgfb1
), la funzione gastrica (gastrina, Gast
), la funzione di barriera (Aquaporin 5, AQP5;
stretta giunzione proteina 1, Tjp1
) e la proliferazione /carcinogenesi (decarbossilasi , odc1
) è stato determinato per le singole topi in tutti i punti di tempo di real-time PCR (file aggiuntivo 1, Tabella S4). Nel 94% dei casi il cambiamento di espressione potrebbe essere confermata (up- o down-regolato sopra il triplice tagliato criteri).
Nei topi trattati NS398, l'espressione di Tjp1
drammaticamente aumentata nelle fasi iniziali dello studio rispetto ai topi infettati (figura 3). Il mouse EST omologa alla connessina 45 (AV148957, Gja7) è stato anche diminuita in topi infettati, indipendentemente dal trattamento NS398, come era un aquaporin gastrica AQP5 (Figura 3). Questo suggerisce che l'inibizione COX-2 ha un effetto sul H. pylori
mediata influenza della funzione di barriera gastrica, quindi abbiamo studiato questo ulteriore in vitro
modello. Western blot analisi mostrava che l'infezione da H. pylori
anche portato agli aumenti di Zona occludere 1 (ZO1, omologo umano di Tjp1) l'espressione della proteina in vitro
in MKN28 cellule epiteliali gastriche, e che questo aumento è stato inibito nel presenza di NS398 (Figura 4A). È interessante notare, questo effetto era indipendente dalla presenza di un sistema di secrezione di tipo IV intatto, o la presenza della citotossina VacA, come H. pylori
mutanti di delezione indotta anche espressione ZO1 (Figura 4B). Espressione dei ODC era diminuita in MKN28 cellule trattate con NS398 (Figura 4C), ed era anche indipendente dalla presenza di un apparato tipo sezione IV funzionale o VacA. Figura 4 Cox-2 dipendente di ZO1 e decarbossilasi nelle cellule MKN28 dipendenti a infezione da H. pylori. A. L'espressione di occludere-1 Zona (ZO1) è stata determinata mediante Western Blot a infezione dopo 6 ore in celle MKN28 sia con H. pylori
P12 selvaggio tipo o mutanti isogenici mancante, l'intera cag PAI (PAI), o VacA (VacA). ZO1 è stato fino regolata dopo l'infezione, indipendentemente CagA PAI o VacA (superiore), mentre l'espressione era diminuita nelle cellule trattate con NS398 (inferiore). B. L'espressione della proteina ornitina decarbossilasi (ODC) non è stata influenzata da H. pylori
infezione, ma è stata ridotta in presenza di NS398.
Discussione
Lo scopo di questo studio è stato quello di migliorare la nostra conoscenza del ruolo della cicloossigenasi-2 in H. pylori
-triggered infiammazione delle mucose, individuando nuovi effettori molecolari a valle. Il vivo
approccio adottato qui ha anche fornito informazioni a livello trascrittoma, nei complessi cambiamenti che si verificano a seguito della risposta infiammatoria cronica di H. pylori
infezione e COX-2.
Entrambi H. pylori
infezione e trattamento NS398 suscitato firme trascrizionali uniche nella mucosa gastrica dei topi, nonostante la somiglianza dei punteggi patologia e la densità di colonizzazione tra i diversi gruppi (Figura 1). Questo è interessante perché in un altro rapporto che impiega un modello di linfoma associato alle mucose tessuto linfoide (MALT linfoma), i profili di trascrizione in topi BALB /c con infezione da H. heilmannii
sono stati determinati dopo 12 a 24 mesi, e le trasformazioni rilevanti nel gene regolamento si è verificato nelle prime fasi della malattia (< 12 mesi, da lieve a moderata patologia) [28]. Dopo questo periodo, il raggruppamento dei 300 geni differenzialmente espressi più permesso segregazione dei topi infettati in gruppi corrispondenti quasi esattamente con la loro caratterizzazione patologica. In vista dei nostri dati, vorremmo concludere che durante la fase di sviluppo precoce di gastrite cronica attiva, analisi patologia standard non è in grado di rilevare sottili ma importanti cambiamenti della mucosa.
NS398 inibisce specificamente l'attività del Cox-2 proteine, e alterazioni Cox-2
genica potrebbe aspettare quando topi infettati sono stati trattati con uno specifico inibitore COX-2, sia a causa di un possibile meccanismo di feedback coinvolgendo PGE 2 [29], o come un meccanismo di compensazione per superare l'inibizione enzimatica. Non è stata osservata variazione significativa Cox-2
espressione in vivo
tuttavia, sostenendo l'idea che l'espressione del gene Cox-2
nello stomaco è controllato da una varietà di fattori. Cox-2 è espresso da entrambe le cellule infiammatorie e gastriche epiteliali [22] e la sua espressione può essere controllato da diversi meccanismi di tipi differenti di cellule.
Siamo stati in grado di identificare un sottogruppo di geni che erano differenzialmente espressi come risultato di Cox soppressione -2, mettendo in evidenza l'ambito di influenza della COX-inibitori in infiammazione gastrica. Cox-2 geni dipendenti è caduto in numerose categorie funzionali, soprattutto quelli coinvolti nella fisiologia gastrica (secrezione acida, motilità), riparazione epiteliale e la proliferazione, e mediatori infiammatori
. Gastrina (Gast
) è un importante mediatore nello stomaco [30-34] ed espressione nella mucosa è stata fortemente influenzata, non solo da infezione da H. pylori
, ma anche dalla soppressione dell'attività Cox-2 (Figura 3, File complementare 1, Tabella S4). Oltre al suo ruolo nella regolazione della secrezione acida gastrica, gastrina ha effetti trofici e regola la proliferazione e la riparazione della mucosa. Infatti INS-GAS topi transgenici che soffrono di ipergastrinemia sviluppare carcinoma dopo l'infezione da H. pylori
[35]. Lo sviluppo del carcinoma è tuttavia limitato ai maschi di questo modello [35]. Altri lavoratori hanno anche osservato che l'inibizione della COX-2 ha influenzato l'espressione gastrina in vitro
modello di cancro del colon-retto in [34] e anche a H. pylori
pazienti positivi cancro gastrico [36].
Mentre l'espressione della apoptosi mediare fattore di differenziazione di crescita 3 (GDF3
) e c-Myc (Mycs
) geni ha raggiunto un picco alla settimana 13, l'apoptosi inibendo gene clusterina (Clu
) è diminuita fortemente a questo punto di tempo. Presi insieme, il pattern di espressione genica è indicativa di una variazione del tasso di proliferazione /apoptosi dell'epitelio dopo 13 settimane di infezione a seguito di trattamento NS398. studi a lungo termine sarebbero tenuti a stabilire se questo effetto continua o si ripresenta. Un certo numero di geni che sono stati precedentemente osservati per essere sovraespresso nei tumori (Mycs, Clu
) [37], soppressori tumorali (rattoppato, Ptch
), o comunque coinvolti in metastasi o riparazione del DNA: bikunin ( Ambp
) [38], gene decarbossilasi (ODC
), fattore di trifoglio 1 (TFF1
) [39], l'insulina come fattore di crescita (Igf2
) [40] e il DNA delle proteine ​​di riparazione 1 (DDB1
), sono stati anche differenzialmente espressi in NS398 trattati topi infettati (figura 3). Il pattern di espressione era complesso tuttavia, e alcuni mediatori tendeva ad essere rafforzata da Cox-2 soppressione, mentre la maggior parte sono stati down-regolato (Figura 3). Ciò riflette probabilmente un ruolo di regolamentazione per la COX-2 come parte di una rete di meccanismi di controllo per la manutenzione epiteliale. ODC
gene, per esempio, codifica un enzima regolatore chiave nella produzione di poliammine che sono essenziali per la proliferazione cellulare [41] e ha dimostrato di giocare un ruolo accanto Cox-2 nello sviluppo della gastrite atrofica [42, 43]. E 'stato proposto che inibitori Cox-2 possono inibire Odc, e in questo modo essere responsabili delle osservati effetti anti-proliferativi di inibitori Cox-2 [44]. La nostra osservazione delle diminuzioni nell'espressione Odc come risultato di NS398 trattata H. pylori
infezione sia in vivo che in vitro

studi (Tabella 1 e Figura 4C) è in accordo con questa visione.
Helicobacter
infezione è fortemente associato con l'induzione di una risposta infiammatoria di tipo Th1 forte, con alti livelli di Ifnγ, che induce l'espressione di altri mediatori infiammatori come iNOS e COX-2
, e fattori di crescita anche circolanti quali gastrina [45]. Sostenere l'idea che Ifnγ svolge il ruolo chiave per attirare e attivare i linfociti [46, 47], abbiamo osservato che l'espressione di marcatori di superficie delle cellule T ICAM1
[48, 49] e CD86
e leganti (vendita
) [50] ha raggiunto la posizione settimana 13 nei topi infettati. Le GTPasi dipendenti interferone (Igtp
, Iigp in attesa di
) regolano le attività anti-microbiche di Ifnγ in modo STAT1 dipendente [51, 52], e la loro espressione è stata drasticamente ridotta a NS398 topi trattati entro la fine del lo studio. Complessivamente, inibizione dell'attività Cox-2 ha portato ad una ridotta espressione di mediatori infiammatori tra settimane 13 e 19 (figura 3); È interessante notare che questo cambiamento non si è riflesso nei punteggi patologia. Cox-2 ha dimostrato di modulare l'equilibrio Th1 /Th2 nelle risposte infiammatorie e l'inibizione della COX-2 utilizzando NS398 portato ad una polarizzazione della risposta in vitro
stimolato PBMC umani verso Th1 [53]. Gli autori hanno postulato che espressione cronica di Cox-2 e la produzione di risultati PGE2 in un'inibizione dell'efficacia della mucosa risposta immunitaria aumentando uno stato di tolleranza. Il pattern di espressione genica abbiamo osservato qui è infatti coerente con un effetto di Cox-2 inibizione della risposta infiammatoria (vedi Figura 3 e Tabella 1), anche se i cambiamenti nell'espressione dei classici mediatori Th1 /Th2 come IL-12, I-10 e iL-4 non ha mostrato differenze significative nel nostro studio.
infezione da H. pylori
è stata riportata a danneggiare l'integrità epiteliale e diversi meccanismi potenziali per questo sono stati segnalati (recensione in [54]). CagA, un importante fattore di H. pylori
patogenicità, viene traslocato in cellule epiteliali tramite l'apparato di secrezione tipo IV [55, 56]. Gli studi in un modello di cellule di rene canino (MDCK) hanno mostrato che associa CagA con la zona di giunzione proteina adattatore stretto occludere 1 (ZO-1, omologo del mouse -tight giunzione proteina 1, Tjp1) e la molecola di adesione giunzionale (JCam o marmellata), leader ad una perturbazione lungo termine della funzione di barriera epiteliale in vitro
[57]. Mentre abbiamo osservato un aumento dell'espressione del Tjp1
a livello trascrizionale nei topi infettati NS398 trattati, JCam
espressione non è stata influenzata. Inoltre, un EST con omologia con connessina 45 (AV148957, Gja7
) e AQP5
sono stati influenzati da H. pylori
infezione indipendentemente dal trattamento NS398 (Figura 3). Per quanto sia connessina 45 e AQP5 sono sanno di svolgere un ruolo nel trasporto intercellulare di molecole d'acqua e piccole, e non vi è evidenza sperimentale che connessina 45 interagisce direttamente con Tjp1 [58, 59], sembrerebbe che Cox-2 ha anche un ruolo nel mantenimento del bilancio idrico nell'epitelio gastrico. Questa idea è supportata dai nostri in vitro
osservazioni di un aumento di COX-2 dipendente Zo-1 espressione della proteina in cellule MKN28. In contrasto con le relazioni Amieva et al. [57] Questo effetto non è stato relativi allo stato CagA di H. pylori
(Figura 4). effetti funzione di barriera nel modello di topo sono in ogni caso improbabile che sia a causa delle azioni di CagA, come anche se abbiamo scoperto che H. pylori
SS1 espresso la proteina CagA, non siamo stati in grado di rilevare la traslocazione sia in vitro
o in vivo
esperimenti (dati non mostrati). Pertanto, sembrerebbe che H. pylori
infezione ha ulteriori meccanismi per influenzare l'integrità epiteliale. E 'anche di nota che un altro H. pylori
fattore di patogenicità, vacuolizzante tossina (VacA) provoca la formazione di vacuoli piene di liquido nelle cellule epiteliali e, inoltre, questa attività può essere inibita in vitro
da trattamento NS398 [60] . Come il aquaporin gastrica AQP5 è espresso sulle membrane laterali e intercellulari nelle cripte gastrica [59], ipotizziamo che questo poro è influenzato dai cambiamenti alle proteine ​​di derivazione stretti, e che essa svolge un ruolo nello sviluppo di edema a livello dell'epitelio durante l'infezione.
Una serie di studi pubblicati hanno tentato di far luce su regolazione genica in H. pylori
infezione utilizzando l'approccio microarray per studiare l'espressione genica globale in cellule epiteliali gastriche in vitro
[61-63] ( rivisto in [64]), registrando una rapida up-regolazione di mediatori infiammatori e una varietà di fattori di trascrizione di essere le caratteristiche del pattern di espressione.

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