Identifisering av nye syklooksygenase-2-avhengige gener i Helicobacter pylori-infeksjon in vivo

Identifisering av nye syklooksygenase-2-avhengige gener i Helicobacter pylori
infeksjon in vivo
Sammendrag Bakgrunn
Helicobacter pylori
er en viktig avgjørende faktor i patogenesen av godartet og neoplastisk mage sykdommer. Cyklooksygenase-2 (COX-2) er den induserbare nøkkelenzymet av arachidonsyre metabolismen, og er en sentral formidler i betennelse og kreft. Uttrykk av Cox-2
genet er oppregulert i mageslimhinnen under H. pylori
infeksjon, men de pathobiological konsekvensene av denne forbedrede Cox-2 uttrykk er ennå ikke karakterisert. Målet med denne studien var å identifisere nye gener nedstrøms av COX-2 i en in vivo modell
, for derved å identifisere potensielle mål for å studere rollen til COX 2 i H. pylori
patogenese og initiering av premalign endringer.
Resultater
genekspresjonsprofiler i mageslimhinnen hos mus som ble behandlet med en spesifikk COX-2 inhibitor (NS398) eller bærer ble analysert ved forskjellige tidspunkter (6, 13 og 19 wk) etter H. pylori
infeksjon. H. pylori
infeksjon påvirket uttrykket av 385 gener i løpet av forsøksperioden, herunder regulatorer av mage fysiologi, spredning, apoptose og slimhinnene forsvar. Under tilstander med COX-2-inhibering, ble 160 målgener reguleres som følge av H. pylori-infeksjon
. Cox-2-avhengige undergruppe inkludert de som påvirker mage fysiologi (Gastrin, Galr1
), epitelial barrierefunksjon (Tjp1, connexin45, Aqp5
), betennelse (Icam1
), apoptose (Clu
) og spredning (Gdf3, Igf2
). Behandling med NS398 alene forårsaket differensial uttrykk på 140 gener, 97 av dem var unik, noe som indikerer at disse genene er regulert under forhold med basal Cox-2 uttrykk.
Konklusjon
Denne studien har identifisert et panel av romanen Cox-2 avhengige gener påvirket under både normale og inflammatoriske tilstander forårsaket av H. pylori
infeksjon. Disse dataene gir viktige nye koblinger mellom Cox-2 og inflammatoriske prosesser, epithelial reparasjon og integritet.
Bakgrunn
Helicobacter pylori
infeksjon er assosiert med en rekke mage lidelser, inkludert kronisk magekatarr, magesår sykdom, slimhinnen forbundet lymfatisk vev (MALT) lymfom, og adenokarsinom i ventrikkel [1, 2]. Patogenitet bakterien er bestemt av epidemiologiske påvirkninger samt bakterielle og vertsfaktorer [1, 3]. Bakteriell kolonisering av gastrisk mucosa fører til utvikling av en kronisk inflammatorisk infiltrat, som er ledsaget av økt frigjøring av inflammatoriske mediatorer, vekstfaktorer og reaktive oksygen metabolitter [2, 4].
Induserbar cyklooksygenase-2-enzym og dens konstitutivt uttrykte isoform Cox-1 er de viktigste regulatorer av menneskelig prostaglandin metabolismen [5-7]. Sluttproduktene deres enzymatisk aktivitet utgjør et panel av prostaglandiner og tromboxaner, som har blitt identifisert som kritiske regulatorer av grunnleggende fysiologiske og patologiske prosesser, inkludert blodplateaggregasjon, fødsel, T-celle utvikling, betennelse og kreft [5-7]. Cox-2 enzymatisk aktivitet er i hovedsak regulert gjennom de novo
syntesen av COX-2-protein [5, 6].
I magesekken, forsterket Cox-2
ekspresjon ble funnet i løpet av H. pylori
-triggered gastritt, så vel som i slimhinnespennings lesjoner, gastroduodenalsår og etter ischemi /reperfusjonsskade [8-10]. Cox-2 og dets beslektede prostanoider også synes å bidra til patogenesen av magekreft. Adenokarsinom i ventrikkel og premaligne slimhinnere ofte over-uttrykke Cox-2
genet [11-14], og forhøyede intratumorale Cox-2 nivåer synes å være assosiert med dypere tumorinvasjon [15] og en økt frekvens av lymfatisk metastaser [ ,,,0],16]. I tillegg har COX-2-inhibitorer blitt vist å potente undertrykke proliferasjon av humane magecancerceller in vitro
[1, 17, 18], så vel som forsøks gastrisk adenokarsinomer i nakne mus [17]. Nylig har imidlertid en rekke rapporter utfordret forestillingen om at denne antitumoraktivitet skyldes hemming av COX-2 selv [19]. Personer som tar COX-hemmere er rapportert å vise en redusert risiko for utvikling av magekreft [20], men de rapporterte kardiovaskulære bivirkninger forbundet med kronisk Koksiber administrasjon bety at klinisk bruk av COX-hemmere for anti-kreftfremkallende behandling er kontroversielt (Anmeldte i [21]).
uttrykk for Cox-2
genet synes derfor å være et viktig skritt i patogenesen av godartede og ondartede mage sykdommer, og derfor avklaring ikke bare for sitt bidrag til H. pylori
-avhengig patogenese, men også nedstrøms virkningene av Cox inhiberende legemidler er av spesiell klinisk betydning.
Vi har tidligere vist at H. pylori
kan direkte påvirke ekspresjon av COX-2
i gastriske epitelceller via transkripsjons mekanismer, og identifisert MAPK-ERK-avhengig aktivering av et proksimale cis
regulatoriske CRE-Ebox element som et viktig skritt i H. pylori
-response av Cox-2
genet [22] . Selv om disse resultatene ytterligere bekreftet den patofysiologiske sammenheng mellom bakterien og Cox-2
, molekylære effektorer plassert nedstrøms av COX-2 i løpet av gastrisk H. pylori-infeksjon
forble uidentifisert.
Her analyserte vi genekspresjon i den gastriske epitel av mus behandlet med Cox-2 spesifikk hemmer NS398, på ulike tidspunkter etter H. pylori
infeksjon ved hjelp av DNA-mikromatriser og var i stand til å definere genuttrykk profiler regulert av H. pylori
gjennom Cox-2-avhengige og uavhengige mekanismer.
Resultater
Fastsettelse av Cox-2-hemmer konsentrasjon
å bestemme passende konsentrasjon av inhibitor i vår H. pylori
infeksjonsmodell, PGE2 nivåene ble målt i mageslimhinnen etter H. pylori
infeksjon i nærvær eller fravær av COX-2-inhibering med NS398. Infiserte mus viste en 50% økning i PGE2-nivået i mageslimhinnen. Behandling av infiserte mus med NS398 (10 mg /kg) førte til en reduksjon i den PGE2 slik at det ikke var forskjellig fra kontrollgruppen (data ikke vist). Vi konkluderer derfor med at en dose på 10 mg /kg var tilstrekkelig til å undertrykke Cox 2-aktivitet i nærvær av et Helicobacter pylori-infeksjon
.
Langvarig bruk av den spesifikke COX-2 inhibitor NS398 påvirker ikke signifikant bakteriell kolonisering eller betennelses score
Alle mus i de infiserte grupper ble kolonisert med H. pylori
, som bestemmes av kvantitativ kultur. Den bakteriemengde økte bare svakt i perioden mellom 6 og 19 uker (figur 1A). Administrasjon av NS398 ikke ut til å ha en betydelig effekt på bakteriekolonisering. Infeksjon med H. pylori
forårsaket en lav til middels klasse gastritt i infiserte mus som hadde en tendens til å øke i alvorlighetsgrad over tid, men førte ikke til sårdannelse eller bevis for metaplasi (se figur 1B, og figur 1C for sammenligninger av mus i hver gruppe ved uke 13). Disse observasjoner er i overensstemmelse med rapportene fra andre undersøkelser hvor mus ble infisert etter tilsvarende tidsperioder [23, 24]. Histologisk analyse viste administrasjon av kjøretøy og NS398 alene induserer en lavgradig gastritt over tid (figur 1B). Figur 1 Administrasjon av den spesifikke Cox-2-hemmer NS398 påvirker ikke signifikant bakteriell kolonisering eller betennelses score. A. Behandling med NS398 påvirker ikke H. pylori
kolonisering i C57 BL /6 mus. CFU hentet fra magen til individuelle mus på 6, 13 og 19 uker etter infeksjon (fylte sirkler). B. Fordeling av patologi score i infiserte og kontroll mus. Patologi ble scoret i henhold til Sydney systemet som følger: ingen betennelse (0), lav karakter, ikke-aktiv gastritt og lav karakter mild aktiv gastritt (1), middels klasse mild aktiv gastritt (2). C. Hematoxylin og Eosin farget parafinsnitt fra 13 uker etter infeksjon, representative bilder fra ikke-infiserte mus behandlet med bare kjøretøyet (V), ikke-infiserte mus behandlet med NS398 (NS398), infiserte mus (V + Hp
), og infiserte mus behandlet med NS398 (NS398 + Hp
). Ved uke 13 (17 uker etter infeksjon), ble moderat aktiv gastritt observert i både V + Hp Hotell og NS398 + Hp
grupper. Original forstørrelse 20 ×, skala bar = 50 mikrometer
RNA fra dyr med lignende score og kolonisering nivåer (3 mus per gruppe) ble slått sammen og brukes til å utføre de tre eksperimentelle sammenligninger. Ikke-infisert versus infisert (V vs
V + Hp
), infisert versus NS398 behandlet og infisert (V + Hp vs
NS398 + Hp
), og ikke-infisert versus ikke-infisert og NS398 behandlet (V vs
NS398) (Figur 2A). Eksperimentet er designet for å gjøre oss i stand til å avgjøre genuttrykk profiler i magen på mus som fikk bilen alene eller NS398 i bilen, og å isolere disse fra virkningene av H. pylori
infeksjon. Figur 2 Global genuttrykk i mageslimhinnen av mus infisert med H. pylori. A. Venn-diagram som illustrerer fordelingen av differensielt uttrykte gener (mer enn 3 ganger opp eller ned) over perioden av studien. Antallet gener passerer de cut-off kriterier er angitt for hver eksperimentell sammenligning: Infected versus ikke-infiserte mus (V vs
V + Hp
), infiserte mus versus NS398 behandlet og infiserte mus (V + Hp vs
NS398 + Hp
), og ikke-infiserte mus versus NS398 behandlet (V vs
NS398). Tallene i parentes representerer antall total genene forskjellig uttrykt i de tre eksperimentelle sammenligninger. B. Trend tomter representerer global genekspresjon målt i de 3 eksperimentelle sammenligninger. Hvert punkt på y-aksen representerer den gjennomsnittlige uttrykket ratio for gener som passerer de cut-off kriterier i uke 6, 13 og 19 etter behandlingen starter, dvs. en linje representerer ett gen. De 33 infeksjonsrelaterte gener som var forskjellig uttrykt som et resultat av NS398 behandling er uthevet i rødt for alle sammenligninger. Cox-2 (Ptgs2) er angitt av den gule linje.
Global genekspresjon i gastrisk mucosa av H. pylori
infiserte mus
RNA anvendt i denne studien ble ekstrahert fra gastrisk mucosa
bare har og histologiske analyser av mager forberedt på denne måten bekreftet at muskel eller annet bindevev underliggende slimhinnen ikke var inkludert i våre forberedelser (ikke vist). Endringene i genuttrykk sett i denne studien er derfor høyst sannsynlig til å reflektere en transkripsjonen svar begrenset til at av mage epitelceller og utviklings lymfatisk og granulocytiske infiltrater som karakteriserer kronisk H. pylori
infeksjon. Cut-offs for vesentlige endringer i genuttrykk ble satt til p < 0,05 og tre ganger endring [25].
I H. pylori
infiserte mus, 385 gener passert avskårne kriteriene ved minst én gang i løpet av studien (figur 2A). H. pylori
infiserte mus som ble behandlet med NS398 hadde 160 differensielt uttrykte gener. I mus behandlet med NS398 alene, ble 140 gener uttrykt forskjellig (figur 2A). Ved hjelp av en subtraktiv tilnærming, ble genene delt inn i undergrupper som gjenspeiler de store eksperimentelle effekter:. H. pylori
infeksjon, Cox-2 undertrykkelse, og Cox-2 undertrykkelse under infeksjon
Infeksjon med H. pylori
induserte en komplekst mønster av global genekspresjon i løpet av perioden av eksperimentet (figur 2B). Behandling av infiserte mus med NS398 resulterte i en tydelig genekspresjon signatur, som var i tillegg til effekten av infeksjonen. Trettitre av genene forskjellig uttrykt i infiserte mus var et resultat av NS398 behandling (rød uthevet gener), i tillegg ytterligere 107 gener ble bare uttrykt i NS398 behandlet og infiserte mus. På denne måte kan en undergruppe av gener som definert Cox-2-avhengige genene ble etablert. Vi delt disse genene i undergrupper for å legge til rette for videre analyse basert på Gene Ontologi kategorier ved hjelp av DAVID verktøy for genet merknad på NCBI http: gov ///david abcc ncifcrf.... Tabell 1 inneholder utvalgte Cox-2 avhengige gener (en fullstendig liste kan finnes igjen Fil 1, Tabell S2). De fleste genene viste en varierende uttrykk mønster som indikerer at kontrollmekanismer og den kumulative effekten av både infeksjon og Cox-2 undertrykkelse spille en rolle i genekspresjon i løpet time.Table en eksperimentell design
uke

-4 & -3
0
6
13
19
Mus (n)
Vehicle bare product: (V )
17
Mock infeksjon
Behandling begynne
5
6
6
NS398 (10 mg /kg) plakater (NS398)
17
mock infeksjon
Behandling begynne
5
6
6
Vehicle pluss H. pylori plakater (V + Hp
)
24
infisere SS1
Treatment begynner
8
8
8
NS398 (10 mg /kg) pluss H. pylori product: (NS398 + Hp
)
24
infisere SS1
Behandling begynne
8
8
8
etter uke 0 mus fikk daglig sc. injeksjoner av NS398 eller bærer alene som angitt. Mus ble drept 6. 13 og 19 uker etter behandlingsstart og H. pylori
kolonisering (cfu), deretter patologi score ble bestemt og total RNA ble utarbeidet.
Effekt av NS398 på mage genuttrykk profiler
Tidligere studier på COX-2-inhibitor NS398 i en rekke in vitro og in vivo

-modeller har vist det er en spesifikk inhibitor av COX-2-aktivitet med liten eller ingen innflytelse på nært beslektet, konstitutivt uttrykt Cox-1 product: [26, 27]. I vår studie, langsiktig forvaltning syntes å ha effekter på genuttrykk som kan ha blitt løst eller kompensert for etter flere måneder, som en stor andel av de genene som var oppregulert etter uke 6 av administrasjonen ikke var annerledes uttrykt etter uke 13 (figur 2B og tabell 1). Kun 33 av genene som ble påvirket av NS398 ble også regulert som svar på infeksjon. En fullstendig liste over genene regulert som et resultat av NS398 behandling er vist (Tilleggs Fil 1, tabell S3.
For å komplettere den "subtraktiv" metode for å klassifisere gener, data ble samlet ved hjelp av en ukontrollert måte. En selv bestilling matrise (SOM) ble opprettet ved bruk av alle COX-2-avhengige gener, Figur 3 viser et SOM plott av Cox2-avhengige gener som er identifisert i studien (venstre panel), viser den høyre panel en grunnmasse av de samme genene for å indikere virkningen av H- . pylori-infeksjon
alene på de samme genene (se også tabell 2). i store trekk de regulerte gener falt inn i de funksjonelle grupper av den er knyttet til epitelial barrierefunksjon, proliferasjon og vedlikehold eller inflammasjon (oppsummert i figur 3B) .table 2 Brett endring i genekspresjon av utvalgte gener reguleres som følge av infeksjon med H. pylori Hotell og /eller behandling med spesifikke Cox-2-hemmer NS398
SYMBOL
GENE NAVN
GENE ontologi

V vs V + Hp
V + Hp vs NS398 + Hp
V vs Ns398
6
13
19
6
13
19
6
13
19
ADN
adipsin
chymotrypsin, aktivitet.
komplement activation.
3.06
1.9
-1.32
-2.4
1.93
-1.07
-1.53
-2.56
-1.97
Akt3
thymoma viral proto-onkogen 3
protein aminosyre phosphorylation
-1.52
6.68
-1.02
-1.09
1.28
1.33
-1.44
-1.03
-1.06
AV148957
Connexin 45
vann transport
1.39
-3.25
-1.04
1.29
-1.11
1.39
1
1.09
-1.01
Ccl5
chemokine (CC motiv) ligand 5
chemokin aktivitet.
Betennelsesreaksjon
1,23
-1,13
3.01
1,08
-1,13
-1,54
-1,21
1,48
1,08
CRPD. Dmbt1
slettet i ondartede hjernesvulster 1 /crp ductin, muclin
scavenger reseptor aktivitet.
svulst suppressor
4.15
-3.15
7.74
-2.64
-2.09
-2.15
1.78
1.28
-1
Gast
gastrin
hormone aktivitet
6,37
-1,21
1,8
-8,41
-1,87
-1,01
1 -2,35
1,45
Hsp70-3
heat shock protein 1A
anstand activity
5.3
-1.86
1.31
-5.41
1.13
-1.15
3.23
-1.35
1.11
Icsbp1
interferon konsensus seq bindende protein en
immunrespons;. transkripsjon regulation
1
-1.31
3.36
1.19
1.23
-1.39
1
2.04
-1.37
Ifi47
interferon gamma induserbar protein
ATP-binding activity
1.3
-1.29
6.03
1.2
-1.13
-1.97
-1.85
-1.29
1.45
Ly75
lymphocyte antigen 75
forsvar respons
1,23
-2,25
3,37
1.36
-1,15
1 1
1 1,39
Mup5
større urinprotein 5
feromon bindingsaktivitet, transport; transporter activity
4.94
-1.08
3
-6.56
-1.23
-2.5
7.56
-1.5
1.31
Ptgs1
prostaglandin-endoperoxide syntase en
prostaglandin biosynthesis
-1.36
-1.03
-1.02
1.16
1.03
1
1.26
1.47
1.12
Ptgs2
prostaglandin-endoperoxide syntase 2
prostaglandin biosynthesis
1.27
4.34
1.47
-1.02
1.17
1
-1.55
-1.24
-1.47
Odc
Ornithine decarboxlyase
karboksy- lyase aktivitet
1.05
-1,69
-1,19
-1,34
-3,12
-1,11
1.94
-1,4
1,23
Slc7a11. cd98 lys
oppløst stoff bærefamilie syv medlem 11. cD98 lys
kationiske aminosyre transporter
1.37
3.42
1.19
1.09
2.24
1.33
-1.7
-1.64
-1.07
Tff1
trefoil faktor 1
respons wounding
-2.94
5.57
-3.06
-2.28
9.16
-1.56
-1.37
-6.56
2.84
Tgtp
T-cell spesifikk GTPase
GTP-bindende aktivitet
1,26
-1,24
8.29
1.55
-1,17
-2,72
-1,37
1,31
1,43
The Gene ontologi (GO) klassifiseringen angir gen-funksjon. En fullstendig liste over uttrykket nivået av alle genene i studien kan finnes igjen Fil 1, Bord S1-3.
Figur 3 Expression mønster av Cox-2-avhengige . gener A. To-dimensjonal selv bestilling matrise (sOM) klynge som viser relative uttrykk nivå av alle Cox-2 avhengige gener identifisert i denne studien (p > 0,05). Opp- eller ned-regelverket er merket med en rød eller blå henholdsvis skyggelegging. Svart skyggelegging indikerer lignende genuttrykk i begge prøvene. høyre panel viser klynge avledet fra genuttrykk mønster i NS398 behandlede mus (V + Hp
vs NS398 + Hp
). det venstre panelet viser . ekspresjon av de samme genene i infiserte mus (unclustered) genfunksjoner og litteraturreferanser som er relevante for H. pylori
infeksjon er vist i tabell 3. gener som passer de mest fremtredende funksjonelle kategorier er markert med farge: proliferasjon /apoptose (blek blå ), epitelial integritet (orange), inflammatorisk respons (rød) og gastrisk fysiologi (grønn) B. Diagram oppsummerer den generelle fysiologiske effekten av Cox-2 avhengige gener i løpet av den periode av forsøket, blir genet kategorier farget som i A.
bekreftelse av uttrykk av utvalgte Cox-2 avhengige gener
gjennomsnittlig endring i uttrykket nivået av Cox1 (Ptgs1) Hotell og Cox2 (Ptgs2)
, og et utvalg av Cox2-avhengige gener involvert i inflammasjon (intracellulær adhesjonsmolekyl 1, Icam1
; Transformerende vekstfaktor b1, Tgfb1
), gastrisk funksjon (Gastrin, Gast
), barrierefunksjon (aquaporin 5, Aqp5;
Tight krysset protein 1, Tjp1
) og spredning /kreftutvikling (ornitindekarboksylase , Odc1
) ble bestemt for individuelle mus ved alle tidspunkter ved real-time PCR (Tilleggs Fil 1, tabell S4). I 94% av tilfellene endringen i uttrykket kunne bekreftes (opp- eller ned- regulert over tre ganger avskåret kriterier).
I NS398 behandlede mus, etter uttrykket av Tjp1 økt dramatisk i de tidlige stadier av studien sammenlignet med infiserte mus (figur 3). Musen EST homologt med connexin 45 (AV148957, Gja7) ble også redusert i infiserte mus, uavhengig av NS398 behandling, som var en gastrisk aquaporin Aqp5 (figur 3). Dette antydet at COX-2-inhibering har en effekt på H. pylori
mediert påvirkning av magebarrierefunksjon, derfor har vi undersøkt dette videre i en in vitro modell
. Western blot analyse viste at infeksjon med H. pylori
også ført til økning i Zona okkludens 1 (ZO1, Human homolog til Tjp1) protein uttrykk in vitro
i MKN28 mage epitelceller, og at denne økningen ble hemmet i tilstedeværelsen av NS398 (figur 4A). Interessant nok denne effekten var uavhengig av tilstedeværelsen av et intakt type IV sekresjon system, eller tilstedeværelse av cytotoksinet Vaca, som H. pylori
delesjonsmutanter også indusert ZO1 uttrykk (figur 4B). Ekspresjon av ODC var redusert i MKN28 celler behandlet med NS398 (figur 4C), og var også uavhengig av tilstedeværelsen av en funksjonell type IV seksjon apparat eller Vaca. Figur 4 Cox-2 avhengig uttrykk for ZO1 og ornitindekarboksylase i MKN28 celler avhengige i H. pylori infeksjon. A. Ekspresjon av zona okkludens-1 (ZO1) ble bestemt ved western blot ved 6 timer etter infeksjon i MKN28 celler med enten H. pylori
vill type P12 eller isogene mutanter som mangler hele cag PAI (PAI), eller Vaca (Vaca). ZO1 ble regulert opp etter infeksjon, uavhengig av CagA PAI eller Vaca (øvre), mens ekspresjon ble redusert i celler behandlet med NS398 (nedre). B. Expression of ornitindekarboksylase protein (ODC) ble ikke påvirket av H. pylori
infeksjon, men ble redusert i nærvær av NS398.
Diskusjon
Hensikten med denne studien var å øke kunnskapen om rollen cyklooksygenase-2 i H. pylori
-triggered slimhinnebetennelse ved å identifisere nye nedstrøms molekylære effektorer. In vivo
forsøker vi har også gitt innsikt i transkriptomet nivå, i de komplekse endringer som oppstår som et resultat av kronisk inflammatoriske respons på H. pylori-infeksjon og
til COX-2-inhibering.
både H. pylori
infeksjon, og NS398 behandling fremkalte unike transkripsjons signaturer i mageslimhinnen hos mus, til tross for likheten i patologi score og kolonisering tetthet mellom de ulike gruppene (figur 1). Dette er av interesse, fordi i en annen rapport som anvender en modell av mukosa-assosiert lymfoid vev lymfom (MALT lymfom), transkripsjonelle profiler i BALB /c-mus infisert med H. heilmannii
ble bestemt etter 12 til 24 måneder, og de store endringer i genregulering skjedde i de tidligere stadier av sykdommen (< 12 måneder, milde til moderate sykdomslære) [28]. Etter denne tid, gruppering av de 300 mest differensielt uttrykte gener tillot isolering av infiserte mus i grupper som svarer nesten nøyaktig sammen med deres patologiske karakterisering. I lys av våre data, kan vi konkludere med at i løpet av den tidlige utviklingsfase av kronisk aktiv gastritt, er standard patologi analyse ikke er i stand til å detektere subtile, men viktige endringer i slimhinnen.
NS398 hemmer spesielt aktiviteten av COX-2- protein, og endringer i Cox-2
genekspresjon kan forventes når infiserte mus ble behandlet med en spesifikk COX-2-inhibitor, enten som følge av en mulig tilbakekoplingsmekanisme som omfatter PGE 2 [29], eller så en kompenserende mekanisme for å overvinne den enzymatiske hemming. Ingen signifikant endring i Cox-2
ekspresjon ble observert in vivo
imidlertid, som støtter ideen om at ekspresjon av COX-2
genet i magen blir styrt av en rekke faktorer. COX-2 er uttrykt ved både inflammatoriske og gastriske epitel-celler [22] og dets ekspresjon kan kontrolleres ved forskjellige mekanismer i forskjellige celletyper.
Vi var i stand til å identifisere en delmengde av gener som er differensielt uttrykt som et resultat av Cox -2 undertrykkelse, fremhever omfanget av påvirkning av COX-hemmere i mage betennelse. Cox-2-avhengige gener falt i mange funksjonelle kategorier, hovedsakelig de som er involvert i mage fysiologi (magesyre, motilitet), epitelial reparasjon og spredning, og inflammatoriske mediatorer
. Gastrin (Gast
) er en viktig mediator i magen [30-34] og ekspresjon i mukosa ble sterkt påvirket, ikke bare ved infeksjon med H. pylori
, men også ved undertrykkelse av COX-2-aktivitet (figur 3, Ytterligere Fil 1, tabell S4). I tillegg til sin rolle i regulering av mavesyresekresjon, er gastrin trofiske effekter og regulerer proliferasjon og reparasjon i slimhinnen. Faktisk INS-GAS transgene mus som lider av hypergastrinemi utvikle karsinom etter infeksjon med H. pylori product: [35]. Utviklingen av karsinom er imidlertid begrenset til menn i denne modellen [35]. Andre forskere har også observert at COX-2-inhibering påvirket gastrin-ekspresjon i en in vitro
kolorektal cancer modell [34] og også i H. pylori
positive cancerpasienter gastriske [36].
Mens ekspresjon av apoptose medierende vekst differensiering faktor 3 (Gdf3
) og c-myc (Mycs
) gener nådde uke 13, apoptose hemme genet Clusterin (Clu
) sterkt redusert på dette tidspunkt. Til sammen er det genuttrykk mønster som antyder et skifte i frekvensen av spredning /apoptose av epitel etter 13 uker med infeksjon som følge av NS398 behandling. Lengre sikt studier vil være nødvendig for å fastslå om denne effekten fortsetter eller gjenoppstår. En rekke gener som tidligere har blitt observert å være over-uttrykt i tumorer (Mycs, Clu
) [37], tumor dempere (lappet, ptch
), eller annen måte er involvert i metastaser eller DNA-reparasjon: bikunin ( Ambp
) [38], ornitindekarboksylase gen (ODC
), Trefoil faktor 1 (Tff1
) [39], insulinlignende vekstfaktor (Igf2
) [40] og DNA-reparasjon protein 1 (Ddb1
), ble også uttrykt forskjellig i NS398 behandlet infiserte mus (figur 3). Uttrykket Mønsteret var sammensatt imidlertid, og noen mediatorer tendens til å bli forsterket ved Cox-2-undertrykkelse, mens flertallet ble nedregulert (figur 3). Dette gjenspeiler trolig en regulerende rolle for Cox-2 som en del av et nettverk av kontrollmekanismer for epitel vedlikehold. ODC-
genet, for eksempel koder for et nøkkel regulatorisk enzym i produksjon av polyaminer som er essensielle for celleformering [41], og har vist seg å spille en rolle ved siden av COX-2 i utviklingen av atrofisk gastritt [42, 43]. Det har blitt foreslått at Cox-2-hemmere kan hemme ODC, og på denne måten være ansvarlig for den observerte anti-proliferative effekter av Cox-2-hemmere [44]. Vår observasjon av nedgang i ODC uttrykk som følge av NS398 behandlet H. pylori
infeksjon i både in vivo Hotell og in vitro
studier (Tabell 1 og figur 4C) er i tråd med denne oppfatningen.
Helicobacter
infeksjon er sterkt assosiert med induksjon av en kraftig Th1-type inflammatoriske respons, sammen med høye nivåer av IFNy, som induserer ekspresjon av andre inflammatoriske mediatorer slik som iNOS og Cox-2
, og også sirkulerende vekstfaktorer slik som gastrin [45]. Støtte til forestillingen om at IFNy spiller en nøkkelrolle i å tiltrekke og aktivere lymfocytter [46, 47], observerte vi at uttrykket av T-celleoverflatemarkører Icam1 product: [48, 49] og CD86 Hotell og ligander (Selg
) [50] toppet seg i uke 13 i infiserte mus. Interferon-avhengige GTPases (Igtp
, Iigp søkt
) regulere antimikrobielle aktiviteter IFNy i en STAT1 avhengig måte [51, 52], og deres uttrykk ble dramatisk redusert i NS398 behandlet mus ved utgangen av studien. Totalt sett hemming av COX-2 aktivitet ført til redusert uttrykk av inflammatoriske mediatorer mellom uke 13 og 19 (figur 3); Interessant denne endringen ble ikke reflektert i patologi score. COX-2 er blitt vist å modulere Th1 /Th2 balanse i inflammatoriske responser og hemning av COX-2 ved anvendelse av NS398 førte til en polarisering av responsen av in vitro
stimulerte humane PBMC mot Th1 [53]. Forfatterne postulerte at kronisk ekspresjon av COX-2 og produksjon av PGE2 resulterer i en inhibering av effektiviteten av slimhinneimmunrespons ved å forbedre en tilstand av toleranse. Den genuttrykksmønstrene observerte vi her er faktisk i overensstemmelse med en effekt av COX-2 inhibering av inflammatorisk respons (se figur 3 og tabell 1), selv om forandringer i ekspresjon av klassiske Th1 /Th2-mediatorer så som IL-12, I-10 og IL-4 var ikke signifikant forskjellig i vår studie.
Infeksjon med H. pylori
har blitt rapportert å skade epitelial integritet og flere potensielle mekanismer for dette har blitt rapportert (anmeldt i [54]). CagA, en større H. pylori
patogenitet faktor, blir translokert inn i epitelceller via type IV-sekresjon apparat [55, 56]. Studier i en hjørnetann nyrecellemodell (MDCK) viste at CagA forbinder med den stramme krysset adapter protein zona okkludens 1 (zo-en, mus homolog sittende krysset protein 1, Tjp1) og junctional adhesjonsmolekyl (Jcam eller Jam), som fører til en langsiktig forstyrrelse av epitelial barrierefunksjonen in vitro product: [57]. Mens vi observert økt uttrykk av Tjp1
på transkripsjonsnivået i NS398 behandlede infiserte mus, ble Jcam
uttrykk ikke berørt. I tillegg er en EST med homologi til connexin 45 (AV148957, Gja7
) og Aqp5
ble påvirket av H. pylori
infeksjon uansett NS398 behandling (figur 3). Som både connexin 45 og Aqp5 er kjent for å spille en rolle i inter transport av vann og små molekyler, og det er eksperimentelle bevis for at connexin 45 samhandler direkte med Tjp1 [58, 59], ser det ut til at Cox-2 har også en rolle i opprettholdelse av vannbalansen i den gastriske epitel. Denne ideen er støttet av våre in vitro
observasjoner av en cox-2 avhengig økning i Zo-1 protein uttrykk i MKN28 celler. I motsetning til rapporter fra Amieva et al. [57] Dette ble ikke relatert til CagA status av H. pylori plakater (figur 4). Barrierefunksjon virkninger i musemodellen er i alle fall ikke til å bli på grunn av handlingene til CagA, så selv om vi fant at H. pylori
SS1 uttrykt CagA protein, var vi ikke i stand til å oppdage trans i enten in vitro
eller in vivo
eksperimenter (data ikke vist). Derfor ser det ut til at H. pylori
infeksjon har flere mekanismer for å påvirke epitel integritet. Det er også verdt å merke seg at en annen H. pylori
patogenitet faktor, vacuolating toksin (Vaca) dannes væskefylte vakuoler i epitelceller og dessuten kan denne aktiviteten være hemmet in vitro
av NS398 behandling [60] . Som gastrisk aquaporin Aqp5 uttrykkes på de laterale og inter membraner i mage krypter [59], spekulere vi at denne pore er påvirket av endringer i trange koblings proteiner, og at det spiller en rolle i utviklingen av ødem i epitelet i løpet infeksjon., En rekke publiserte rapporter har forsøkt å belyse genregulering i H. pylori
infeksjon ved bruk av microarray tilnærming for å studere global genekspresjon i mage epitelceller in vitro product: [61-63] ( anmeldt i [64]), rapporterer en rask oppregulering av inflammatoriske mediatorer og en rekke transkripsjonsfaktorer for å være kjennetegnene på uttrykket mønster. I vår studie, ingen av spredningsrelaterte gener (c-Fos, b-Fos, c-Jun Kjøpe og cyclinD1 plakater (PCNA
)) rapportert av Sepulveda et al
., Og heller ikke de som er rapportert av Cox et al
.

• Fedmekirurgi og diabetes mellitus type 2 forbedring mekanismer: en matematisk model
• Antimikrobiell aktivitet av naturlige produkter mot Helicobacter pylori: a review