Identificación de nuevos genes de la ciclooxigenasa-2-dependiente de la infección por Helicobacter pylori en vivo

identificación de nuevos genes de la ciclooxigenasa-2-dependiente en Helicobacter pylori in vivo

Resumen Antecedentes

Helicobacter pylori
es un factor determinante crucial en la patogénesis de las enfermedades gástricas benignas y neoplásicas. La ciclooxigenasa-2 (COX-2) es la enzima clave inducible del metabolismo del ácido araquidónico y es un mediador central en la inflamación y el cáncer. La expresión de la Cox-2
gen está regulado en la mucosa gástrica durante la infección por H. pylori
pero las consecuencias de esta patobiológicas una mayor expresión de la Cox-2 todavía no se caracterizan. El objetivo de este estudio fue identificar nuevos genes aguas abajo de la Cox-2 en un modelo in vivo
en, identificando con ello los objetivos potenciales para el estudio del papel de la Cox-2 en H. pylori patogénesis y la
la iniciación de los cambios precancerosos.
Resultados
perfiles de expresión de genes en la mucosa gástrica de los ratones tratados con un inhibidor específico de Cox-2 (NS398) o vehículo se analizaron a diferentes puntos de tiempo (6, 13 y 19 sem) después de la infección por H. pylori
. H. pylori
infección afectó a la expresión de 385 genes en el período experimental, incluyendo los reguladores de la fisiología gástrica, la proliferación, la apoptosis y la defensa de la mucosa. En condiciones de inhibición de la COX-2, 160 genes diana se regulan como resultado de H. pylori
infección. El subconjunto dependiente de la Cox-2 incluidos los que influyen en la fisiología gástrica (gastrina, GALR1
), función de la barrera epitelial (Tjp1, connexin45, AQP5
), inflamación (ICAM1
), la apoptosis (Clu
) y la proliferación (GDF3, Igf2
). El tratamiento con NS398 solo causó la expresión diferencial de 140 genes, de los cuales 97 eran únicos, lo que indica que estos genes están regulados en condiciones basales de expresión COX-2.
Conclusión
Este estudio ha identificado un panel de la novela de la Cox-2 genes dependientes influido tanto en condiciones normales y las condiciones inflamatorias inducidas por H. pylori
infección. Estos datos proporcionan nuevas e importantes vínculos entre la COX-2 y los procesos inflamatorios, la reparación y la integridad epitelial.
Antecedentes
Helicobacter pylori
la infección se asocia con una variedad de trastornos gástricos incluyendo la gastritis crónica, úlcera péptica, la mucosa asociada tejido linfático (MALT), y el adenocarcinoma gástrico [1, 2]. La patogenicidad de la bacteria está determinado por influencias epidemiológicos así como los factores bacterianos y del huésped [1, 3]. La colonización bacteriana de la mucosa gástrica conduce al desarrollo de un infiltrado inflamatorio crónico, que se acompaña de una mayor liberación de mediadores inflamatorios, factores de crecimiento y metabolitos reactivos de oxígeno [2, 4].
La enzima inducible COX-2 y su expresaron constitutivamente isoforma COX-1 son los principales reguladores del metabolismo de la prostaglandina humana [5-7]. Los productos finales de su actividad enzimática comprenden un panel de prostaglandinas y tromboxanos, que han sido identificados como reguladores críticos de procesos fisiológicos y patológicos fundamentales incluyendo la agregación de plaquetas, el parto, el desarrollo de células T, la inflamación y el cáncer [5-7]. Cox-2 actividad enzimática se regula en gran medida a través de novo
síntesis de la proteína COX-2 [5, 6].
En el estómago, mejora de la cox-2
expresión se ha encontrado durante el H. pylori
-motivado gastritis, así como en las lesiones de estrés de las mucosas, úlceras gastroduodenales y después de un daño por isquemia /reperfusión [8-10]. Cox-2 y sus prostanoides relacionados también parecen contribuir a la patogénesis del cáncer gástrico. adenocarcinoma y premalignas lesiones de la mucosa gástrica con frecuencia sobre-expresar la Cox-2
genes [11-14], y intratumorales Cox-2 niveles elevados parecen estar asociadas con más profunda invasión tumoral [15] y una mayor frecuencia de metástasis linfática [ ,,,0],dieciséis]. Además, los inhibidores de la Cox-2 se han demostrado para suprimir potencialmente la proliferación de células de cáncer gástrico humano in vitro
[1, 17, 18], así como adenocarcinomas gástricos experimentales en ratones desnudos [17]. Sin embargo, recientemente, un número de informes han cuestionado la noción de que esta actividad anti-tumor se debe a la inhibición de la Cox-2 en sí [19]. Los individuos que toman Cox inhibidores han sido reportados para mostrar un menor riesgo de desarrollo de carcinoma gástrico [20], sin embargo los efectos secundarios cardiovasculares asociados con la administración reportados coxib crónica significa que el uso clínico de los inhibidores de COX-para el tratamiento anti-cancerígeno es controvertido (revisado en [21]).
la expresión de la Cox-2
gen, por tanto, parece ser un paso importante en la patogénesis de las enfermedades gástricas benignas y malignas y, por tanto, no sólo una aclaración de su contribución a H. pylori
patogénesis dependiente, sino también los efectos aguas abajo de fármacos inhibidores de la Cox es de especial significación clínica.
Hemos demostrado previamente que el H. pylori
puede influir directamente en la expresión de la Cox-2 Hoteles en células epiteliales gástricas a través los mecanismos de transcripción, e identificó la activación de MAPK-ERK-dependiente de un cis-regulador proximales
elemento CRE-Ebox como un paso clave en el H. pylori
-response de la Red gen Cox-2 [22] . Si bien estos resultados confirman aún más el vínculo fisiopatológico entre la bacteria y la COX-2
, efectores moleculares situado aguas abajo de la Cox-2 durante la infección gástrica por H. pylori
permanecido sin identificar.
Aquí hemos analizado la expresión génica en la gástrico epitelio de los ratones tratados con el inhibidor de la Cox-2 específica NS398, en diferentes puntos de tiempo después de la infección por H. pylori
utilizando microarrays de ADN y fueron capaces de definir los perfiles de expresión de genes regulados por H. pylori
través de la Cox-2-dependiente y mecanismos independientes.
resultados
Determinación de la concentración de la Cox-2 inhibidor
Para determinar la concentración apropiada de inhibidor en nuestra H. pylori
modelo de infección, los niveles de PGE2 se midieron en la mucosa gástrica después de H. pylori
infección en presencia o ausencia de inhibición de la COX-2 con NS398. Los ratones infectados mostraron un aumento del 50% en el nivel de PGE2 en la mucosa gástrica. El tratamiento de ratones infectados con NS398 (10 mg /kg) dio lugar a una reducción de la PGE2 tal que no difería de la del grupo de control (datos no mostrados). Por lo tanto, la conclusión de que una dosis de 10 mg /kg fue suficiente para suprimir la actividad de la Cox 2 en presencia de un H. pylori
infección.
La administración a largo plazo del inhibidor específico de la Cox-2 NS398 no afecta significativamente bacteriana la colonización o puntuaciones inflamatorias MyBestPlay Todos los ratones en los grupos infectados fueron colonizados con H. pylori
, según lo determinado por cultivo cuantitativo. La carga bacteriana se incrementó sólo ligeramente en el periodo de entre 6 y 19 semanas (figura 1A). La administración de NS398 no parecen tener un efecto significativo en la colonización bacteriana. La infección con H. pylori
causó una baja para la gastritis grado medio en los ratones infectados que tendió a aumentar en intensidad con el tiempo, pero que no conduce a la formación de úlceras o evidencia de metaplasia (véase la Figura 1B, 1C y la figura para las comparaciones de los ratones en cada grupo en la semana 13). Estas observaciones están de acuerdo con los informes de otros estudios en los ratones fueron infectados por períodos de tiempo similares [23, 24]. El análisis histológico mostró administración de vehículo y solo NS398 induce una gastritis de bajo grado con el tiempo (Figura 1B). Figura 1 La administración de la NS398 específicos de la COX-2 inhibidor no afecta significativamente a la colonización bacteriana o las puntuaciones inflamatorias. A. El tratamiento con NS398 no influye en la colonización por H. pylori en
BL /6 ratones C57. UFC recuperada de los estómagos de los ratones individuales a los 6, 13 y 19 semanas después de la infección (círculos rellenos). B. Distribución de las puntuaciones de patología en ratones infectados y de control. Patología se obtuvo de acuerdo con el sistema de Sydney de la siguiente manera: ninguna inflamación (0), de bajo grado, la gastritis no -active y bajo grado de gastritis leve-activo (1), de grado medio leve gastritis activa (2). C. hematoxilina y eosina tiñen las secciones de parafina de 13 semanas después de la infección, las imágenes representativas de los ratones no infectados tratados con único vehículo (V), los ratones no infectados tratados con NS398 (NS398), los ratones infectados (V + Hp
), y de los ratones infectados tratados con NS398 (NS398 + Hp
). En la semana 13 (17 semanas después de la infección), se observó moderada gastritis activa tanto en el NS398 + Hp Barcelona Grupos V + Hp y
. Aumento original 20 ×, barra de escala = 50 micras
ARN a partir de animales con puntuaciones similares y niveles de colonización (3 ratones por grupo) se reunieron y se utiliza para realizar las tres comparaciones experimentales:. no infectados frente infectada (V vs
v + Hp
), infectados frente NS398 tratado e infectado (v + Hp vs
NS398 + Hp
), y no infectados frente a no infectados y tratados NS398 (v vs
NS398) (Figura 2A). El experimento fue diseñado para permitirnos determinar los perfiles de expresión génica en los estómagos de los ratones que recibieron el vehículo solo o NS398 en el vehículo, y para aislar estos de los efectos de la infección por H. pylori
. La figura 2 la expresión génica global en la mucosa gástrica de los ratones infectados con H. pylori. A. diagrama de Venn que ilustra la descomposición de los genes expresados ​​diferencialmente (más de 3 veces arriba o hacia abajo) durante el período del estudio. El número de genes que pasan los criterios de exclusión se indica para cada comparación experimental: Infected frente a ratones no infectados (V vs
Hp
V +), los ratones infectados en comparación con los ratones tratados y NS398 infectados (V + Hp vs
NS398 + Hp
), y los ratones no infectados tratados frente a NS398 (V vs
NS398). Los números entre paréntesis representan los genes expresados ​​de manera diferente total en las tres comparaciones experimentales. B. Tendencia parcelas que representa la expresión génica global medido en las 3 comparaciones experimentales. Cada punto de los ejes Y representa la proporción promedio de expresión de los genes que pasan los criterios de exclusión en las semanas 6, 13 y 19 de iniciado el tratamiento, es decir, una línea representa un gen. Los 33 genes relacionados con las infecciones que son expresados ​​de manera diferente como resultado de un tratamiento NS398 se resaltan en rojo para todas las comparaciones. Cox-2 (Ptgs2) se indica mediante la línea amarilla.
La expresión génica global en la mucosa gástrica de H. pylori
ratones infectados Francia El ARN usado en este estudio se extrae de la mucosa gástrica
solamente, y los análisis histológicos de los estómagos preparados de esta manera han confirmado que el músculo u otro tejido conjuntivo subyacente a la mucosa no se incluyeron en nuestras preparaciones (no mostrados). Los cambios en la expresión génica observados en este estudio son por lo tanto altamente probable que refleje una respuesta transcripcional restringida a la de las células gástricas epiteliales y la linfocítica desarrollo e infiltrados granulocítica crónica que caracterizan H. pylori
infección. Cortes de los cambios significativos en la expresión génica se fijó en p < 0,05 y tres veces el cambio [25]. Hoteles en pylori
ratones infectados H., 385 genes pasó el cut-off criterios en por lo menos una vez durante el estudio (Figura 2A). H. pylori
ratones que fueron tratados con NS398 tenido 160 genes expresados ​​diferencialmente infectado. En los ratones tratados con NS398 solo, 140 genes fueron expresados ​​diferencialmente (Figura 2A). Utilizando un enfoque de sustracción, genes se dividieron en subgrupos que reflejan los principales efectos experimentales:. H. pylori
de infección, supresión de Cox-2, y de supresión de la Cox-2 durante la infección
La infección con H. pylori
indujo una complejo patrón de expresión génica global durante el período del experimento (Figura 2B). El tratamiento de ratones infectados con NS398 resultó en una expresión genética distinta, que era adicional al efecto de la infección. Treinta y tres de los genes expresados ​​de manera diferente en los ratones infectados fue resultado de un tratamiento NS398 (rojo destacó genes), además de otros 107 genes sólo se expresaron en ratones tratados NS398 e infectadas. De esta manera, un subgrupo de genes que define la Cox-2 genes dependientes se estableció. Hemos dividido estos genes en subgrupos para facilitar su posterior análisis basado en las categorías de ontología de genes utilizando la herramienta DAVID para la anotación de genes en el NCBI http:... //David ABCC ncifcrf gov /. La Tabla 1 contiene una selección de la Cox-2 genes dependientes (una lista completa se puede encontrar en el archivo adicional 1, el cuadro S2). La mayoría de los genes mostraron un patrón de expresión fluctuante que indica que los mecanismos de control y los efectos acumulativos de la infección y la supresión de la Cox-2 juegan un papel en la expresión génica durante time.Table 1 Diseño experimental
Semana

-4 & -3
0
6
13
19
ratones (n)
chasis de sólo gratis (V ): perfil 17
infección simulada
El tratamiento comienza página 5 página 6 página 6
NS398 (10 mg /kg) gratis (NS398): perfil 17
infección simulada
El tratamiento comienza página 5 página 6 página 6
vehículo más H. pylori gratis (V + Hp
): perfil 24
Infect SS1
Tratamiento Comience página 8 página 8 página 8
NS398 (10 mg /kg), además de H. pylori gratis (NS398 + Hp
)
24
Infect SS1 El tratamiento comienza
página 8 página 8 página 8
Después de la semana 0, los ratones recibieron sc diaria. inyecciones de NS398 o vehículo solo como se indica. Los ratones se sacrificaron a las 6. 13 y 19 semanas después del inicio del tratamiento y H. pylori
colonización (ufc), a continuación, se determinaron las puntuaciones de patología y se preparó RNA total.
Efecto de NS398 en perfiles de expresión génica gástricos
los estudios previos sobre el inhibidor de la Cox-2 NS398 en una variedad de ensayos in vitro Opiniones y en modelos in vivo
han demostrado que es un inhibidor específico de la actividad de la Cox-2, con poca o ninguna influencia sobre la estrecha relación, constitutivamente expresó Cox-1 | [26, 27]. En nuestro estudio, la administración a largo plazo parece tener efectos sobre la expresión de genes que pueden haber sido resueltos o compensaron después de varios meses, ya que una gran proporción de los genes que son regulados hasta después de la semana 6 de la administración no se expresaron de manera diferente después de la semana 13 (Figura 2B y Tabla 1). Sólo 33 de los genes que fueron influenciados por NS398 también son objeto de regulación en respuesta a la infección. Se muestra una lista completa de los genes regulados como resultado del tratamiento NS398 (archivo adicional 1, el cuadro S3.
Para complementar el método "sustractivo" de la clasificación de los genes, los datos se agruparon utilizando un enfoque no supervisado. Una matriz auto-pedido (SOM) se ha creado usando todos los genes dependientes de la Cox-2, la figura 3 muestra un diagrama SOM de los genes COX2 dependientes identificadas en el estudio (panel izquierdo), el panel derecho muestra una matriz de los mismos genes para indicar el efecto de H . pylori
infección solo en los mismos genes (Véase también la Tabla 2). en términos generales, los genes regulados cayó en las categorías funcionales de estar relacionada con la función de barrera epitelial, la proliferación y el mantenimiento o la inflamación (que se resumen en la Figura 3B) .Tabla 2 doble cambio en la expresión génica de los genes seleccionados regulados como consecuencia de la infección con H. pylori
y /o el tratamiento con el inhibidor específico de la COX-2 NS398
SÍMBOLO
nombre de gen
ontología de genes

v vs v + Hp
v + Hp vs NS398 + Hp
v vs NS398
6 página 13 página 19 página 6 página 13 página 19
6 página 13 página 19
Adn
adipsina
quimotripsina, actividad.
complemento activation.
3.06
1.9
-1.32
-2.4
1.93
-1.07
-1.53
-2.56
-1.97
Akt3
thymoma proto-oncogén viral 3
amino de la proteína ácida phosphorylation
-1.52
6.68
-1.02
-1.09
1.28
1.33
-1.44
-1.03
-1.06
AV148957
Connexin 45
agua transport
1.39
-3.25
-1.04
1.29
-1.11
1.39
1
1.09
-1.01
Ccl5
chemokine (Motivo CC) ligando 5
actividad de quimioquinas.
Respuesta inflamatoria
1.23 -1.13

3.01 1.08

-1.13 -1.54

-1.21
1,48 1,08

CDPD. DMBT1
eliminada en los tumores cerebrales malignos 1 /CRP ductin, muclin
la actividad del receptor scavenger.
tumoral suppressor
4.15
-3.15
7.74
-2.64
-2.09
-2.15
1.78
1.28
-1
Gast
gastrin
hormone actividad
6.37 -1.21

1.8
-8.41 -1.87

-1.01 -2.35
1 |
1,45
Hsp70-3
proteína de choque térmico 1A
chaperona activity
5.3
-1.86
1.31
-5.41
1.13
-1.15
3.23
-1.35
1.11
Icsbp1
interferon ss consenso proteína 1 | respuesta inmune vinculante;. la transcripción regulation
1
-1.31
3.36
1.19
1.23
-1.39
1
2.04
-1.37
Ifi47
interferon inducible proteína de unión a ATP gamma
activity
1.3
-1.29
6.03
1.2
-1.13
-1.97
-1.85
-1.29
1.45
Ly75
lymphocyte 75 antígeno respuesta
defensa
1,23 -2,25

3,37
1.36 -1.15

1 | 1 | 1 | 1,39
Mup5
importante actividad de unión de proteína urinaria 5
feromona, transporte, transportador activity
4.94
-1.08
3
-6.56
-1.23
-2.5
7.56
-1.5
1.31
Ptgs1
prostaglandin-endoperoxide sintasa de prostaglandina 1 | biosynthesis
-1.36
-1.03
-1.02
1.16
1.03
1
1.26
1.47
1.12
Ptgs2
prostaglandin-endoperoxide sintasa 2
prostaglandina biosynthesis
1.27
4.34
1.47
-1.02
1.17
1
-1.55
-1.24
-1.47
Odc
Ornithine decarboxlyase
carboxi actividad liasa
1,05 -1,69

-1.19 -1.34

-3.12 -1.11

1,94
-1.4 1.23

Slc7a11. familia de transportadores de soluto luz CD98 página 7 miembro de luz 11. CD98
aminoácido catiónico transporter
1.37
3.42
1.19
1.09
2.24
1.33
-1.7
-1.64
-1.07
Tff1
trefoil 1 | factor de respuesta a wounding
-2.94
5.57
-3.06
-2.28
9.16
-1.56
-1.37
-6.56
2.84
Tgtp
T-cell GTPasa específica actividad de unión de GTP

1.26 -1.24

8,29
1,55 -1,17

-2.72 -1.37

1,31 1,43

la ontología de genes (GO) clasificación indica la función del gen. Una lista completa del nivel de expresión de todos los genes en el estudio se puede encontrar en el archivo adicional 1, Mesas S1-3.
Figura 3 patrón de expresión de la COX-2 dependiente . A. genes clúster matriz auto-ordenamiento bidimensional (SOM) que muestra el nivel relativo de expresión de todos los genes de la Cox-2 dependientes identificados en este estudio (p > 0,05). arriba-abajo o regulaciones están indicados por el rojo o azul sombreado respectivamente. sombreado Negro indica la expresión génica similar en ambas muestras. el panel derecho muestra el clúster derivado del patrón de expresión génica en ratones tratados NS398 (V + Hp
vs NS398 + Hp
). el panel de la izquierda muestra el . la expresión de los mismos genes en ratones infectados (no agrupado) las funciones de genes y referencias bibliográficas relevantes para H. pylori
se muestran en la Tabla 3. los genes adecuados para las categorías funcionales más importantes se destacan en color: azul proliferación /apoptosis (pálida ), la integridad epitelial (naranja), respuesta inflamatoria (rojo) y la fisiología gástrica (verde) B. Diagrama que resume el efecto fisiológico global de genes Cox-2 dependientes durante el período del experimento, las categorías de genes son de color como en A.
Confirmación de la expresión de los genes de la Cox-2 dependientes seleccionados comentario El cambio medio en el nivel de expresión de Cox1 gratis (ptgs1) y Cox2 (Ptgs2)
, y una selección de genes COX2 dependientes implicadas en la inflamación (intracelular molécula 1 de adhesión, ICAM1
; Factor de crecimiento transformante b1, TGFB1
), la función gástrica (gastrina, Gast
), la función de barrera (5 Acuaporina, AQP5;
proteínas de unión estrecha 1, Tjp1
) y la proliferación /carcinogénesis (ornitina descarboxilasa , ODC1
) se determinó para los ratones individuales en todos los puntos por PCR en tiempo real (Servicio de archivo 1, Tabla S4). En el 94% de los casos, el cambio en la expresión podría ser confirmado (hacia arriba o hacia abajo regulada por el triple criterio de corte).
En los ratones tratados NS398, la expresión de Tjp1
aumentado de manera espectacular en las primeras etapas del estudio en comparación con los ratones infectados (Figura 3). El ratón EST homólogos a la conexina 45 (AV148957, Gja7) también se redujo en los ratones infectados, independientemente del tratamiento NS398, como era una acuaporina gástrico AQP5 (Figura 3). Esto sugiere que la COX-2 inhibición tiene un efecto en el H. pylori
influencia de la función de barrera gástrica mediada, por lo tanto, se investigó más a fondo en un modelo in vitro
en. El análisis de transferencia Western mostró que la infección por H. pylori también
condujo a aumentos en la Zona 1 occludens (ZO1, homólogo humano de Tjp1) expresión de la proteína en las células epiteliales gástricas vitro
en MKN28, y que este aumento fue inhibido en el presencia de NS398 (Figura 4A). Curiosamente, este efecto fue independiente de la presencia de un sistema de secreción de tipo IV intacto, o la presencia de la citotoxina VacA, como H. pylori
mutantes de deleción también indujo la expresión ZO1 (Figura 4B). Expresión de ODC se redujo en las células tratadas con MKN28 NS398 (Figura 4C), y también fue independiente de la presencia de un aparato de la sección de tipo IV funcional o VacA. Figura 4 Cox-2 expresión dependiente de NPV1 y ornitina descarboxilasa en las células MKN28 dependientes de infección por H. pylori. A. Expresión de occludens-1 Zona (NPV1) se determinó por Western blot a las 6 horas después de la infección en las células MKN28, ya sea con H. pylori
P12 de tipo salvaje o los mutantes isogénicas que faltan del todo cag PAI (PAI), o VacA (VacA). ZO1 fue regulada hasta después de la infección, independientemente de CagA PAI o VacA (superior), mientras que la expresión se redujo en las células tratadas con NS398 (inferior). B. Expresión de la proteína ornitina descarboxilasa (ODC) no se vio afectada por H. pylori
infección, pero se redujo en presencia de NS398.
Discusión Francia El objetivo de este estudio fue mejorar nuestro conocimiento sobre la papel de la ciclooxigenasa-2 en H. pylori
inflamación de la mucosa -Accionados mediante la identificación de nuevos efectores moleculares aguas abajo. La in vivo
enfoque adoptado aquí también ha proporcionado información a nivel de transcriptoma, en los complejos cambios que se producen como resultado de la respuesta inflamatoria crónica a H. pylori
infección y a la inhibición de la Cox-2.
tanto H. pylori
infección, y el tratamiento NS398 suscitó firmas transcripcionales únicos en la mucosa gástrica de los ratones, a pesar de la similitud en las puntuaciones de la patología y la densidad de la colonización entre los diferentes grupos (Figura 1). Esto es de interés porque en otro informe que emplea un modelo de linfoma asociado a la mucosa del tejido linfoide (linfoma MALT), perfiles de transcripción en ratones BALB /c infectados con H. heilmannii
se determinaron después de 12 a 24 meses, y los grandes cambios en la regulación de genes se produjo en las primeras etapas de la enfermedad (< 12 meses, de leve a moderada patología) [28]. Después de este tiempo, la agrupación de los 300 genes expresados ​​diferencialmente más permitió la segregación de los ratones infectados en grupos correspondientes casi exactamente con su caracterización patológica. A la vista de nuestros datos, llegamos a la conclusión de que durante la fase de desarrollo inicial de la gastritis crónica activa, análisis de patología estándar no es capaz de detectar sutiles, pero importantes cambios en la mucosa.
NS398 inhibe específicamente la actividad de la Cox-2 proteínas, y las alteraciones en la expresión de genes
-2 Cox podría esperarse que cuando los ratones infectados fueron tratados con un inhibidor específico de Cox-2, ya sea como resultado de un posible mecanismo de retroalimentación que implica PGE 2 [29], o como un mecanismo de compensación para superar la inhibición enzimática. No se observó ningún cambio significativo en la Cox-2
expresión in vivo
sin embargo, el apoyo a la idea de que la expresión del gen de la Cox-2
en el estómago es controlada por una variedad de factores. Cox-2 se expresa tanto por las células inflamatorias y gástricas epiteliales [22] y su expresión puede ser controlada por diferentes mecanismos en los tipos de células diferentes.
Hemos sido capaces de identificar un subconjunto de genes que son expresados ​​diferencialmente como resultado de Cox supresión -2, destacando el alcance de la influencia de la COX-inhibidores de la inflamación gástrica. Cox-2 genes dependientes cayó en numerosas categorías funcionales, principalmente a los involucrados en la fisiología gástrico (secreción de ácido, la motilidad), la reparación epitelial y la proliferación, y mediadores inflamatorios.
Gastrina (Gast
) es un mediador importante en el estómago [30-34] y la expresión en la mucosa fue fuertemente influenciado, no sólo por la infección con H. pylori
, sino también por la supresión de la actividad de la Cox-2 (Figura 3, archivo adicional 1, Tabla S4). Además de su papel en la regulación de la secreción de ácido gástrico, la gastrina tiene efectos tróficos y regula la proliferación y la reparación de la mucosa. De hecho INS-GAS ratones transgénicos que sufren de hipergastrinemia desarrollar carcinoma después de la infección con H. pylori
[35]. El desarrollo de carcinoma está sin embargo limitada a los hombres en este modelo [35]. Otros trabajadores han observado también que la COX-2 inhibición influenciada expresión de gastrina en un modelo in vitro
cáncer colorrectal en [34], y también en H. pylori
pacientes con cáncer gástrico positivos [36].
Mientras que la expresión de la apoptosis mediar factor de diferenciación de crecimiento del 3 (GDF3
) y c-Myc (Mycs
) genes alcanzó su punto máximo en la semana 13, la apoptosis inhibiendo la clusterina gen (Clu
) disminuyó fuertemente en este punto temporal. En conjunto, el patrón de expresión génica es sugerente de un cambio en la tasa de proliferación /apoptosis del epitelio después de 13 semanas de infección, como resultado de tratamiento NS398. Serían necesarios estudios a más largo plazo para determinar si este efecto persiste o reaparece. Un número de genes que se han observado previamente que sobre-expresan en tumores (Mycs, Clu
) [37], supresores tumorales (parcheado, Ptch
), o de otro modo implicadas en la metástasis o la reparación del ADN: la bikunina ( MAPA
) [38], el gen de la ornitina descarboxilasa (ODC
), factor trébol 1 (TFF1
) [39], similar a la insulina factor de crecimiento (Igf2
) [40] y las proteínas de reparación del ADN 1 (DDB1
), también fueron expresadas diferencialmente en NS398 tratada ratones infectados (Figura 3). El patrón de expresión era complejo sin embargo, y algunos mediadores tendía a ser reforzada por la Cox-2 supresión, mientras que la mayoría se redujeron reguladas (Figura 3). Esto probablemente refleja un papel regulador para la Cox-2 como parte de una red de mecanismos de control para el mantenimiento epitelial. El Odc
gen, por ejemplo, codifica una enzima reguladora clave en la producción de poliaminas que son esenciales para la proliferación celular [41] y se ha demostrado que desempeñan un papel al lado de la Cox-2 en el desarrollo de gastritis atrófica [42, 43]. Se ha propuesto que los inhibidores de la Cox-2 pueden inhibir Odc, y de esta manera ser responsable de los efectos anti-proliferativos observados de los inhibidores de la Cox-2 [44]. Nuestra observación de una disminución en la expresión Odc como resultado de NS398 tratada H. pylori
infección en tanto in vivo como in vitro

estudios (Tabla 1 y Figura 4C) está en consonancia con esta noción.
Helicobacter
infección está fuertemente asociado con la inducción de una fuerte respuesta inflamatoria de tipo Th1, con altos niveles de IFN, que induce la expresión de otros mediadores inflamatorios tales como iNOS y COX-2
, y también factores de crecimiento circulantes tales como la gastrina [45]. El apoyo a la idea de que el IFN desempeña un papel clave en la atracción y la activación de los linfocitos [46, 47], se observó que la expresión de marcadores de superficie de células T ICAM1
[48, 49] y CD86 Opiniones y ligandos (Vender
) [50] alcanzó su punto máximo en la semana 13 en los ratones infectados. Las GTPasas dependientes interferón (IGTP
, Iigp pendiente
) regulan las actividades antimicrobianas de IFN de una manera dependiente de STAT1 [51, 52], y su expresión se redujo drásticamente en ratones tratados NS398 a finales de el estudio. En general, la inhibición de la actividad de la Cox-2 dio lugar a una expresión reducida de mediadores inflamatorios entre las semanas 13 y 19 (Figura 3); Es interesante que este cambio no se refleja en las puntuaciones de patología. Cox-2 se ha demostrado que modulan el equilibrio Th1 /Th2 en las respuestas inflamatorias y la inhibición de Cox-2 usando NS398 dio lugar a una polarización de la respuesta in vitro de
estimulado PBMCs humanos hacia Th1 [53]. Los autores postularon que la expresión crónica de Cox-2 y la producción de resultados de PGE2 en una inhibición de la eficacia de la respuesta inmune de la mucosa mediante la mejora de un estado de tolerancia. El patrón de expresión génica se observó aquí es de hecho consistente con un efecto de inhibición de la COX-2 sobre la respuesta inflamatoria (Véase la Figura 3 y la Tabla 1), aunque los cambios en la expresión de clásicos mediadores Th1 /Th2, tales como IL-12, I-10 e IL-4 no difirió significativamente en nuestro estudio.
la infección con H. pylori
ha informado a dañar la integridad epitelial y varios mecanismos posibles para esto se han reportado (revisado en [54]). CagA, un importante factor de H. pylori
patogenicidad, se transloca en las células epiteliales a través del aparato de secreción tipo IV [55, 56]. Los estudios realizados en un modelo de células de riñón canino (MDCK) mostraron que los asociados CagA con la estrecha zona adaptador de proteínas de unión occludens 1 (ZO-1, homólogo de ratón -tight proteína de unión 1, Tjp1) y la molécula de adhesión de la unión (JCAM o mermelada), lo que lleva a una interrupción a largo plazo de la función de la barrera epitelial in vitro
[57]. Mientras que se observó el aumento de expresión de Tjp1
a nivel transcripcional en ratones infectados tratados NS398, JCAM
expresión no se vio afectada. Además, una EST con homología con la conexina 45 (AV148957, Gja7
) y AQP5
fueron influenciados por H. pylori
infección, independientemente del tratamiento NS398 (Figura 3). Dado que tanto la conexina 45 y AQP5 se sabe que desempeñan un papel en el transporte intercelular de moléculas de agua y pequeñas, y no hay evidencia experimental de que la conexina 45 interactúa directamente con Tjp1 [58, 59], parece que la COX-2 también tiene un papel en el mantenimiento del balance de agua en el epitelio gástrico. Esta idea es apoyada por nuestras observaciones in vitro
en un aumento de la cox-2 dependiente de Zo-1 de expresión de proteínas en células MKN28. En contraste con los informes de Amieva et al. [57] Este efecto no se relaciona con el fenotipo CagA de H. pylori gratis (Figura 4). efectos de la función de barrera en el modelo de ratón son, en cualquier caso poco probable que sea debido a las acciones de CagA, ya que aunque se encontró que H. pylori SS1
expresa la proteína CagA, que no fueron capaces de detectar la translocación en tanto in vitro
o en experimentos in vivo
(datos no mostrados). Por lo tanto, parecería que H. pylori
infección tiene mecanismos adicionales para influir en la integridad epitelial. También es de notar que otra H. pylori
factor de patogenicidad, vacuolating toxina (VacA) provoca la formación de vacuolas llenas de líquido en las células epiteliales y, además, esta actividad puede ser inhibida in vitro fotos: por tratamiento NS398 [60] . A medida que la acuaporina gástrico se expresa AQP5 en las membranas laterales y intercelulares en las criptas gástricas [59], se especula que este poro se ve influenciada por los cambios en las proteínas de unión estrecha, y que desempeña un papel en el desarrollo de edema en el epitelio durante la infección.
Una serie de informes publicados han tratado de arrojar luz sobre la regulación de genes en H. pylori
utilizando el enfoque de microarrays para estudiar la expresión génica global en las células epiteliales gástricas in vitro
[61-63] ( revisado en [64]), reportando una rápida regulación de los mediadores de la inflamación y una variedad de factores de transcripción que es el sello distintivo del patrón de expresión.

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