Identifikation af hidtil ukendte cyclooxygenase-2-afhængige gener i Helicobacter pylori infektion in vivo

Identifikation af nye cyclooxygenase-2-afhængige gener i Helicobacter pylori
infektion in vivo
Abstrakt
Baggrund
Helicobacter pylori
er en afgørende afgørende faktor i patogenesen af ​​godartet og neoplastisk gastrisk sygdomme. Cyclooxygenase-2 (COX-2) er den inducerbare nøgleenzym af arachidonsyre metabolisme og er en central mediator i inflammation og cancer. Ekspression af cox-2
genet opreguleres i maveslimhinden under H. pylori
infektion, men de patobiologiske konsekvenser af denne forbedrede Cox-2-ekspression er endnu ikke karakteriseret. Formålet med denne undersøgelse var at identificere hidtil ukendte gener nedstrøms for Cox-2 i en in vivo
model, hvorved der identificeres potentielle mål for studiet af den rolle, COX 2 i H. pylori
patogenese og initiering af præ- kræft ændringer. Search Results Salg genekspressionsprofiler i maveslimhinden hos mus behandlet med et specifikt Cox-2-inhibitor (NS398) eller vehikel blev analyseret på forskellige tidspunkter (6, 13 og 19 wk) efter H. pylori
infektion. H. pylori
infektion påvirkede ekspressionen af ​​385 gener i løbet af forsøgsperioden, herunder regulatorer af gastrisk fysiologi, proliferation, apoptose og slimhinde forsvar. Under forhold med Cox-2-hæmning, blev 160 målgener reguleret som følge af H. pylori
infektion. Cox-2 afhængig delmængde inkluderet dem påvirke gastrisk fysiologi (Gastrin, Galr1
), epitelial barrierefunktion (Tjp1, connexin45, AQP5
), inflammation (ICAM1
), apoptose (Clu
) og proliferation (GDF3, Igf2
). Behandling med NS398 alene forårsagede differentieret udtryk for 140 gener, 97 af dem var enestående, hvilket indikerer, at disse gener er reguleret under forhold med basal Cox-2-ekspression.
Konklusion
Denne undersøgelse har identificeret et panel af roman Cox-2 afhængige gener påvirkes under både normale og de inflammatoriske tilstande induceret af H. pylori
infektion. Disse data giver vigtige nye forbindelser mellem Cox-2 og inflammatoriske processer, epitelial reparation og integritet.
Baggrund
Helicobacter pylori
infektion er associeret med en række af gastriske lidelser, herunder kronisk gastritis, mavesår sygdom, slimhinde associeret lymfatisk væv (MALT) lymfom, og gastrisk adenocarcinom [1, 2]. Patogenicitet af bakterien bestemmes ved epidemiologiske påvirkninger samt bakterie- og vært faktorer [1, 3]. Bakteriel kolonisering af maveslimhinden fører til udvikling af en kronisk inflammatorisk infiltrat, som er ledsaget af forøget frigivelse af inflammatoriske mediatorer, vækstfaktorer og reaktive oxygen metabolitter [2, 4].
Inducerbare Cox-2-enzymet og dets udtrykte konstitutivt isoform Cox-1 er de vigtigste regulatorer af menneskelig prostaglandin stofskifte [5-7]. De endelige produkter af deres enzymatiske aktivitet omfatter et panel af prostaglandiner og thromboxaner, der er blevet identificeret som kritiske regulatorer af grundlæggende fysiologiske og patologiske processer, herunder trombocytaggregation, fødsel, T-celle udvikling, betændelse og kræft [5-7]. Cox-2 enzymatisk aktivitet er i vid udstrækning reguleres gennem de novo
syntese af cox-2-proteinet [5, 6].
I maven, forstærkede cox-2
ekspression er blevet fundet under H. pylori
-triggered gastritis samt i mucosale stress læsioner, gastroduodenale ulcera og efter iskæmi /reperfusionsskade [8-10]. Cox-2 og dets beslægtede prostanoider synes også at bidrage til patogenesen af ​​gastrisk cancer. Gastrisk adenocarcinom og præmaligne slimhindelæsioner ofte over-udtrykke Cox-2
genet [11-14], og forhøjede intratumorale Cox-2 niveauer synes at være forbundet med dybere tumor invasion [15], og en øget hyppighed af lymfatisk metastaser [ ,,,0],16]. Desuden har Cox-2-hæmmere blevet påvist at potent undertrykke proliferation af humane gastriske kræftceller in vitro
[1, 17, 18] samt eksperimentelle gastriske adenokarcinomer i nøgne mus [17]. For nylig har imidlertid en række rapporter udfordret den opfattelse, at denne anti-tumor aktivitet skyldes hæmning af Cox-2 selv [19]. Enkeltpersoner tager COX-inhibitorer er blevet rapporteret at vise en nedsat risiko for udvikling af gastrisk karcinom [20], men de rapporterede kardiovaskulære bivirkninger forbundet med kronisk coxib administration betyder, at klinisk anvendelse af COX-inhibitorer til kræfthæmmende behandling er kontroversiel (Anmeldt i [21]).
Ekspression af Cox-2
gen synes derfor at være et vigtigt skridt i patogenesen af ​​godartede og ondartede gastriske sygdomme og derfor afklaring ikke alene af dets bidrag til H. pylori
-afhængig patogenese, men også de nedstrøms virkninger af Cox inhiberende stoffer er af særlig klinisk betydning.
Vi har tidligere vist, at H. pylori
kan direkte påvirke ekspression af cox-2
i gastriske epitelceller gennem transkriptionelle mekanismer, og identificerede MAPK-ERK-afhængig aktivering af en proksimal cis
reguleringsmyndigheder CRE-Ebox element som et vigtigt skridt i den H. pylori
-svar af Cox-2
gen [22] . Mens disse resultater yderligere bekræftet den patofysiologiske forbindelse mellem bakterien og Cox-2
, molekylære effektorer placeret nedstrøms for Cox-2 under gastrisk H. pylori
infektion forblev ukendt.
Her analyserede vi genekspression i det gastriske epitel hos mus behandlet med Cox-2-specifikke inhibitor NS398, på forskellige tidspunkter efter H. pylori
infektion under anvendelse af DNA microarrays og var i stand til at definere genekspressionsprofiler reguleres af H. pylori
gennem Cox-2-afhængige og uafhængige mekanismer.
Resultater
Bestemmelse af Cox-2-hæmmer koncentrationen
for at bestemme den passende koncentration af inhibitor i vores H. pylori
infektion model blev PGE2-niveauer målt i maveslimhinden efter H. pylori
infektion i nærvær eller fravær af Cox-2-inhibering med NS398. Inficerede mus viste en stigning på 50% i PGE2 niveau i maveslimhinden. Behandling af inficerede mus med NS398 (10 mg /kg) førte til en nedsættelse af PGE2 sådan, at den ikke afviger fra kontrolgruppen (data ikke vist). Vi konkluderede derfor, at en dosis på 10 mg /kg var tilstrækkelig til at undertrykke Cox 2-aktivitet i nærvær af en H. pylori
infektion.
Langvarig administrering af det specifikke Cox-2-inhibitor NS398 påvirker ikke signifikant bakteriel kolonisering eller inflammatoriske scoringer
Alle mus i de inficerede grupper blev koloniseret med H. pylori
, som bestemt ved kvantitativ kultur. Den bakterielle belastning steg kun en smule i perioden mellem 6 og 19 uger (figur 1A). Administration af NS398 syntes ikke at have en væsentlig effekt på bakteriel kolonisering. Infektion med H. pylori
forårsagede en lav til midterste klasse gastritis i inficerede mus, der havde tendens til at stige i sværhedsgrad over tid, men førte ikke til sårdannelse eller tegn på metaplasi (se figur 1B, og 1C for sammenligninger af mus i hver gruppe ved uge 13). Disse observationer er i overensstemmelse med rapporter fra andre studier, hvor mus blev inficeret lignende tidsperioder [23, 24]. Histologisk analyse viste administration af vehikel og NS398 alene inducerer en lav kvalitet gastritis over tid (figur 1B). Figur 1 Administration af den specifikke Cox-2-inhibitor NS398 påvirker ikke signifikant bakteriel kolonisering eller inflammatoriske scores. A. Behandling med NS398 ikke påvirker H. pylori
kolonisering i C57 BL /6-mus. CFU hentet fra maver individuelle mus ved 6, 13 og 19 uger efter infektion (fyldte cirkler). B. Fordeling af patologiske scorer i inficerede og kontrolmus. Patologi blev scoret i henhold til Sydney-systemet på følgende måde: ingen inflammation (0), lav kvalitet, ikke -Active gastritis og lav kvalitet mild-aktiv gastritis (1), midterste klasse mild aktiv gastritis (2). C. Hematoxylin og eosin farvede paraffinsnit fra 13 uger efter infektion, repræsentative billeder fra ikke-inficerede mus behandlet med kun køretøj (V), ikke inficerede mus behandlet med NS398 (NS398), inficerede mus (V + Hp
), og inficerede mus behandlet med NS398 (NS398 + Hp
). Ved uge 13 (17 uger efter infektion), blev moderat aktiv gastritis observeret i både V + Hp
NS398 + Hp
grupper. Oprindelig forstørrelse 20 ×, skala bar = 50 um
RNA fra dyr med lignende scores og kolonisering niveauer (3 mus pr gruppe) blev samlet og anvendt til at udføre de tre eksperimentelle sammenligninger:. Ikke-inficeret versus inficerede (V vs
V + Hp
), inficeret versus NS398 behandlet og inficeret (V + Hp vs
NS398 + Hp
), og ikke-inficerede versus ikke-inficerede og NS398 behandlet (V vs
NS398) (figur 2A). Eksperimentet blev designet til at gøre det muligt at bestemme genekspressionsprofiler i maverne af mus, der modtager bærer alene eller NS398 i køretøjet, og at isolere disse fra virkningerne af H. pylori
infektion. Figur 2 Global genekspression i maveslimhinden af ​​mus inficeret med H. pylori. A. Venn diagram, som illustrerer nedbrydningen af ​​differentielt udtrykte gener (mere end 3 gange op eller ned) i perioden af ​​studiet. Antallet af gener, der passerer de afskæringskriterierne er angivet for hvert eksperimentel sammenligning: Inficeret versus ikke-inficerede mus (V vs
V + Hp
), inficerede mus versus NS398 behandlet og inficerede mus (V + Hp vs
NS398 + Hp
), og ikke-inficerede mus versus NS398 behandlet (V vs
NS398). Tal i parentes repræsenterer antallet samlede gener forskelligt udtrykt i de tre eksperimentelle sammenligninger. B. Trend diagrammer, der viser global genekspression måles i 3 eksperimentelle sammenligninger. Hvert punkt på y-akserne repræsenterer den gennemsnitlige udtryk ratio for gener, som opfyldte kriterierne cut-off på ugen 6, 13 og 19 efter behandlingen starter, dvs. én linje repræsenterer et gen. De 33 infektion gener, der var anderledes udtrykt som et resultat af NS398 behandling er fremhævet med rødt for alle sammenligninger. Cox-2 (Ptgs2) er angivet af den gule linje.
Global genekspression i maveslimhinden af ​​H. pylori
inficerede mus
RNA anvendt i denne undersøgelse blev ekstraheret fra maveslimhinden
kun har og histologiske analyser af maver fremstillet på denne måde bekræftet, at muskel eller andre bindevæv underliggende slimhinden ikke indgik i vores forberedelser (ikke vist). De ændringer i genekspression set i denne undersøgelse er derfor meget sandsynligt, at afspejle en transkriptionel respons begrænset til det af gastriske epitelceller og udviklingslandene lymfocytiske og granulocytiske infiltrater, der karakteriserer kronisk H. pylori
infektion. Cut-offs for væsentlige ændringer i genekspression blev fastsat til p < 0,05 og tre gange ændring [25]. Salg In H. pylori
inficerede mus, 385 gener bestået afskårne kriterier ved mindst en gang i løbet af undersøgelsen (figur 2A). H. pylori
inficerede mus, der blev behandlet med NS398 havde 160 differentielt udtrykte gener. I mus behandlet med NS398 alene, blev 140 gener differentielt udtrykt (figur 2A). Ved hjælp af en subtraktiv tilgang blev gener inddeles i undergrupper, der afspejler de store eksperimentelle effekter:. H. pylori
infektion, Cox-2 undertrykkelse, og Cox-2 undertrykkelse under infektion
Infektion med H. pylori
inducerede en komplekst mønster af global genekspression i perioden af ​​eksperimentet (figur 2B). Behandling af inficerede mus med NS398 resulterede i et distinkt genekspression signatur, som var ud over virkningen af ​​infektion. Treogtredive af generne forskelligt udtrykt i inficerede mus var et resultat af NS398 behandling (rød fremhævet gener), foruden yderligere 107 gener kun blev udtrykt i NS398 behandlede og inficerede mus. På denne måde defineres en undergruppe af gener Cox-2-afhængige gener blev etableret. Vi opdelt disse gener i undergrupper for at lette yderligere analyse baseret på Gene ontologi kategorier ved hjælp af DAVID værktøj til gen annotation på NCBI http:... //David abcc ncifcrf gov /. Tabel 1 indeholder udvalgte Cox-2 afhængige gener (en komplet liste kan findes i supplerende File 1, tabel S2). De fleste gener viste en svingende udtryk mønster indikerer, at kontrolmekanismer og de kumulative virkninger af både infektion og Cox-2 undertrykkelse spille en rolle i genekspression i time.Table 1 Eksperimentel design
Week

-4 & -3
0
6
13
19
Mus (n)
Vehicle kun
(V )
17
Mock infektion
Behandling begynde
5
6
6
NS398 (10 mg /kg) Hotel (NS398)
17
mock infektion
behandling begynde
5
6
6
Vehicle plus H. pylori
(V + Hp
)
24
inficere SS1
Behandling begynder
8
8
8
NS398 (10 mg /kg) plus H. pylori
(NS398 + Hp
)
24
inficere SS1
Behandling begynder
8
8
8
efter uge 0 mus modtog dagligt sc. injektioner af NS398 eller bærestof som angivet. Mus blev aflivet ved 6. 13 og 19 uger efter behandlingens start og H. pylori
kolonisering (cfu), derefter patologi scores blev bestemt og total RNA blev fremstillet.
Virkning af NS398 på gastriske genekspressionsprofiler
Tidligere undersøgelser af Cox-2-inhibitor NS398 i en række in vitro
og in vivo
modeller har vist det er en specifik inhibitor af COX-2-aktivitet med ringe eller ingen indflydelse på den nært beslægtede, konstitutivt udtrykte Cox-1
[26, 27]. I vores undersøgelse, langsigtet administration syntes at have effekter på genekspression, der kan have været løst eller kompenseres for efter flere måneder som en stor del af de gener, som var opreguleret efter uge 6 i administrationen ikke var anderledes udtrykt efter uge 13 (figur 2B og tabel 1). Kun 33 af de gener, der var påvirket af NS398 blev også reguleret som respons på infektion. En komplet liste over de gener, der reguleres som følge af NS398 behandling er vist (Ekstra File 1, tabel S3.
Som supplement til "subtraktiv" metode til at klassificere gener, data blev grupperet ved hjælp af en uovervåget tilgang. En selvstændig bestilling matrix (SOM) blev oprettet ved hjælp af alle Cox-2 afhængige gener, Figur 3 viser en SOM plot af COX2-afhængige gener identificeret i undersøgelsen (venstre panel), det højre panel viser en matrix af de samme gener for at angive effekten af ​​H . pylori
infektion alene på de samme gener (se også tabel 2). i store træk de regulerede gener faldt i funktionelle kategorier er relateret til epitelial barrierefunktion, spredning og vedligeholdelse eller inflammation (opsummeret i figur 3B) .table 2 fold ændring i genekspression af udvalgte gener reguleres som følge af infektion med H. pylori
og /eller behandling med den specifikke Cox-2-inhibitor NS398
SYMBOL
GENE NAVN
GENE ontologi
V vs V + Hp
V + Hp vs NS398 + Hp
V vs Ns398
6
13
19
6
13
19
6
13
19
ADN
adipsin
chymotrypsin, aktivitet.
supplement activation.
3.06
1.9
-1.32
-2.4
1.93
-1.07
-1.53
-2.56
-1.97
Akt3
thymoma viral proto-onkogen 3
protein aminosyre phosphorylation
-1.52
6.68
-1.02
-1.09
1.28
1.33
-1.44
-1.03
-1.06
AV148957
Connexin 45
vand transport
1.39
-3.25
-1.04
1.29
-1.11
1.39
1
1.09
-1.01
Ccl5
chemokine (CC motiv) ligand 5
kemokinaktivitet.
Inflammatorisk respons
1,23
-1,13
3.01
1,08
-1,13
-1,54
-1,21
1,48
1,08
CRPD. Dmbt1
slettet i maligne hjernetumorer 1 /crp ductin, muclin
scavenger receptor aktivitet.
tumor suppressor
4.15
-3.15
7.74
-2.64
-2.09
-2.15
1.78
1.28
-1
Gast
gastrin
hormone aktivitet
6,37
-1,21
1.8
-8,41
-1,87
-1,01
1
-2,35
1,45
Hsp70-3
varmechokprotein 1A
anstandsdame activity
5.3
-1.86
1.31
-5.41
1.13
-1.15
3.23
-1.35
1.11
Icsbp1
interferon konsensus seq bindende protein 1
immunrespons;. transkription regulation
1
-1.31
3.36
1.19
1.23
-1.39
1
2.04
-1.37
Ifi47
interferon gamma inducerbare protein
ATP-binding activity
1.3
-1.29
6.03
1.2
-1.13
-1.97
-1.85
-1.29
1.45
Ly75
lymphocyte antigen 75
forsvar reaktion
1,23
-2,25
3,37
1,36
-1,15
1
1
1
1,39
Mup5
større urinprotein 5
feromon bindende aktivitet, transport, transporter activity
4.94
-1.08
3
-6.56
-1.23
-2.5
7.56
-1.5
1.31
Ptgs1
prostaglandin-endoperoxide syntase 1
prostaglandin biosynthesis
-1.36
-1.03
-1.02
1.16
1.03
1
1.26
1.47
1.12
Ptgs2
prostaglandin-endoperoxide syntase 2
prostaglandin biosynthesis
1.27
4.34
1.47
-1.02
1.17
1
-1.55
-1.24
-1.47
Odc
Ornithine decarboxlyase
carboxy- lyaseaktivitet
1,05
-1,69
-1,19
-1,34
-3,12
-1,11
1,94
-1,4
1,23
Slc7a11. cd98 lys
solut luftfartsselskab familie 7 medlem 11. cD98 lys
kationiske aminosyre transporter
1.37
3.42
1.19
1.09
2.24
1.33
-1.7
-1.64
-1.07
Tff1
trefoil faktor 1
reaktion på wounding
-2.94
5.57
-3.06
-2.28
9.16
-1.56
-1.37
-6.56
2.84
Tgtp
T-cell specifik GTPase
GTP bindende aktivitet
1,26
-1,24
8,29
1.55
-1,17
-2,72
-1,37
1,31
1,43
det Gene Ontology (GO) klassifikation indikerer genfunktion. En komplet liste over ekspressionsniveauet af alle gener i undersøgelsen kan findes i supplerende Fil 1, tabeller S1-3.
figur 3 Expression mønster af Cox-2 afhængige . gener A. To-dimensionelle selv-bestilling matrix (sOM) klynge viser relative udtryk niveau af alle Cox-2 afhængige gener er identificeret i denne undersøgelse (p > 0,05). op- eller ned-regler er angivet med rød eller blå shading henholdsvis. Sort shading indikerer lignende genekspression i begge prøver. højre panel viser klyngen afledt af genekspression mønster i NS398 behandlede mus (V + Hp
vs NS398 + Hp
). det venstre panel viser . udtryk for de samme gener i inficerede mus (unclustered) Gene funktioner og litteraturhenvisninger er relevante for H. pylori
infektion er vist i tabel 3. gener passer de mest fremtrædende funktionelle kategorier er fremhævet med farve: proliferation /apoptose (lyseblå ), epithelial integritet (orange), inflammatorisk respons (rød) og gastrisk fysiologi (grøn) B. Diagram sammenfatter den samlede fysiologiske virkning af COX-2 afhængige gener i perioden af ​​eksperimentet, er gen-kategorier farvet som i A.
Bekræftelse af ekspressionen af ​​udvalgte Cox-2 afhængige gener
gennemsnitlige ændring i ekspressionsniveauet af Cox1 (Ptgs1)
og COX2 (Ptgs2)
, og et udvalg af COX2-afhængige gener involveret i inflammation (intracellulær adhæsionsmolekyle 1, ICAM1
; Transformerende vækstfaktor b1, Tgfb1
), gastrisk funktion (Gastrin, Gast
), barrierefunktion (Aquaporin 5, AQP5,
Tight junction protein 1, Tjp1
) og proliferation /carcinogenese (ornithindecarboxylase , Odc1
) blev bestemt for de enkelte mus på alle tidspunkter af real-time PCR (Ekstra File 1, tabel S4). I 94% af tilfældene kunne bekræftes ændringen i udtrykket (op- eller ned- reguleres over tre gange afbrød kriterier).
I NS398 behandlede mus,
udtryk for Tjp1 dramatisk forøget i de tidlige stadier af undersøgelsen sammenlignet med inficerede mus (figur 3). Musen EST homolog med connexin 45 (AV148957, Gja7) blev også reduceret i inficerede mus, uanset NS398 behandling, som var en gastrisk aquaporin AQP5 (figur 3). Dette antydede, at Cox-2-inhibering har en virkning på H. pylori
medieret indflydelse af gastrisk barrierefunktion, derfor har vi undersøgt dette yderligere i en in vitro
model. Western blot analyse viste, at infektion med H. pylori også
førte til øget Zona occludens 1 (ZO1, humane homolog til Tjp1) proteinekspression in vitro
i MKN28 gastriske epitelceller, og at denne stigning blev inhiberet i tilstedeværelse af NS398 (figur 4A). Interessant denne virkning var uafhængig af tilstedeværelsen af ​​et intakt type IV secerneringssystem, eller tilstedeværelsen af ​​cytotoksin VacA, som H. pylori
deletionsmutanter inducerede også ZO1 ekspression (figur 4B). Ekspression af ODC blev reduceret i MKN28 celler behandlet med NS398 (figur 4C), og var også uafhængig af tilstedeværelsen af ​​et funktionelt type IV sektion apparat eller VacA. Figur 4 Cox-2 afhængig udtryk for ZO1 og ornithindecarboxylase i MKN28 celler afhængige i H. pylori infektion. A. Ekspression af zona occludens-1 (ZO1) blev bestemt ved western blot ved 6 timer efter infektion i MKN28 celler med enten H. pylori
vildtype P12 eller de isogene mutanter mangler hele cag PAI (PAI), eller VacA (VacA). ZO1 blev opreguleret efter infektion, uafhængigt af CagA PAI eller VacA (øvre), hvorimod ekspressionen blev reduceret i celler behandlet med NS398 (lavere). B. Ekspression af ornithindecarboxylase protein (ODC) blev ikke påvirket af H. pylori
infektion, men faldt i overværelse af NS398.
Diskussion
Formålet med denne undersøgelse var at øge vores viden om rolle af cyclooxygenase-2 i H. pylori
-triggered slimhindebetændelse ved at identificere nye nedstrøms molekylære effektorer. In vivo
tilgang her har også givet indsigt på transkriptomet niveau, ind i de komplekse ændringer, som opstår som følge af den kroniske inflammatoriske respons på H. pylori
infektion og til Cox-2-inhibering.
både H. pylori
infektion, og NS398 behandling fremkaldte unikke transskriptionelle signaturer i maveslimhinden af ​​mus, på trods af ligheden i patologi scores og kolonisering densitet mellem de forskellige grupper (figur 1). Dette er interessant, fordi der i en anden rapport beskæftiger en model af slimhinde-associeret lymfevæv lymfom (MALT lymfom), transkriptionelle profiler i BALB /c mus inficeret med H. heilmannii
blev bestemt efter 12 til 24 måneder, og de store ændringer i genregulering fandt sted i de tidligere stadier af sygdommen (< 12 måneder, milde til moderate patologi) [28]. Efter denne tid, klyngedannelse af de 300 mest differentielt udtrykte gener tilladt adskillelse af inficerede mus i grupper svarende næsten nøjagtigt med deres patologiske karakterisering. I betragtning af vores data, ville vi konkludere, at under fasen tidlige udvikling af kronisk aktiv gastritis, standard patologi analyse er ikke i stand til at detektere subtile, men vigtige ændringer i slimhinden.
NS398 specifikt inhiberer aktiviteten af ​​cox-2 protein, og ændringer i Cox-2
genekspression kan forventes, når inficerede mus blev behandlet med en specifik Cox-2-inhibitor, enten som følge af en mulig feedback-mekanisme, der involverer PGE 2 [29], eller som en kompensatorisk mekanisme til at overvinde den enzymatiske inhibering. Der blev ikke observeret nogen signifikant ændring i Cox-2
ekspression in vivo
dog støtter opfattelsen af, at ekspressionen af ​​cox-2
gen i maven styres af en række faktorer. Cox-2 udtrykkes af både inflammatoriske og gastriske epitelceller [22] og dets ekspression kan styres af forskellige mekanismer i forskellige celletyper.
Vi var i stand til at identificere en undergruppe af gener, som blev differentielt udtrykt som et resultat af cox -2 undertrykkelse, fremhæver omfanget af indflydelse af Cox-hæmmere i gastrisk betændelse. Cox-2 afhængige gener faldt i mange funktionelle kategorier, især dem, der er involveret i gastrisk fysiologi (syresekretion, motilitet), epitelial reparation og spredning, og inflammatoriske mediatorer.
Gastrin (Gast
) er en vigtig mediator i maven [30-34] og ekspression i slimhinden blev stærkt påvirket, ikke kun ved infektion med H. pylori
, men også ved undertrykkelse af Cox-2-aktivitet (figur 3, ekstra fil 1, tabel S4). Ud over sin rolle i reguleringen af ​​mavesyresekretion, gastrin har trofiske virkninger og regulerer proliferation og reparation i slimhinden. Faktisk INS-GAS transgene mus, der lider af hypergastrinæmi udvikle karcinom efter infektion med H. pylori
[35]. Udviklingen af ​​carcinoma er imidlertid begrænset til hanner i denne model [35]. Andre forskere har også observeret, at Cox-2-inhibering påvirket gastrin ekspression i en in vitro
kolorektal cancer model [34] og også i H. pylori
positive gastriske kræftpatienter [36].
Betragtninger ekspression af apoptose mediere vækstdifferentieringsfaktor 3 (GDF3
) og c-myc (Mycs
) gener toppede i uge 13, den apoptose-inhiberende gen clusterin (Clu
) kraftigt nedsat på dette tidspunkt. Tilsammen genekspressionen mønster antyder et skift i hastigheden af ​​proliferation /apoptosis af epitelet efter 13 ugers infektion som følge af NS398 behandling. Langfristede undersøgelser ville være forpligtet til at afgøre, om denne effekt fortsætter eller gentager sig. En række gener, som tidligere er blevet observeret at være overudtrykt i tumorer (Mycs, Clu
) [37], tumorsuppressorer (Patched, ptch
), eller på anden måde involveret i metastase eller DNA-reparation: bikunin ( Ambp
) [38], ornithindecarboxylase genet (ODC
), trefoil-faktor 1 (TFF1
) [39], insulin-lignende vækstfaktor (Igf2
) [40] og DNA-reparation protein 1 (Ddb1
), blev også udtrykkes forskelligt i NS398 behandlede inficerede mus (figur 3). Udtrykket mønster var kompleks dog, og nogle mæglere tendens til at blive styrket af Cox-2 undertrykkelse, mens størstedelen blev nedreguleret (Figur 3). Dette afspejler formentlig en regulerende rolle for Cox-2 som en del af et netværk af kontrolmekanismer for epitelial vedligeholdelse. ODC
gen, for eksempel koder for et nøgle regulatorisk enzym i produktionen af ​​polyaminer, der er væsentlige for celleproliferation [41] og er blevet vist at spille en rolle ved siden Cox-2 i udviklingen af ​​atrofisk gastritis [42, 43]. Det er blevet foreslået, at COX-2-inhibitorer kan inhibere ODC, og på denne måde er ansvarlige for de observerede anti-proliferative virkninger af COX-2-inhibitorer [44]. Vores observation af fald i ODC udtryk som følge af NS398 behandlet H. pylori
infektion i både in vivo
og in vitro
studier (tabel 1 og figur 4C) er i overensstemmelse med dette begreb.
Helicobacter
infektion er stærkt forbundet med induktionen af ​​en stærk Th1-typen inflammatorisk respons, med høje niveauer af IFNy, der inducerer ekspression af andre inflammatoriske mediatorer, såsom iNOS og COX-2
, og også cirkulerende vækstfaktorer såsom gastrin [45]. Støtte til forestillingen om, at IFNy spiller en central rolle i at tiltrække og aktivere lymfocytter [46, 47], bemærkede vi, at ekspressionen af ​​T-celleoverflademarkører ICAM1
[48, 49] og CD86
og ligander (Sell
) [50] toppede i uge 13 i inficerede mus. Interferon afhængige GTPaser (Igtp
, Iigp verserende Salg) regulere antimikrobielle aktiviteter af IFNy i et STAT1 afhængig måde [51, 52], og deres ekspression blev dramatisk reduceret i NS398 behandlede mus ved udgangen af Studiet. Samlet, inhibering af Cox-2-aktivitet førte til en reduceret ekspression af inflammatoriske mediatorer mellem uge 13 og 19 (figur 3); interessant denne ændring blev ikke afspejlet i patologi scoringer. Cox-2 har vist sig at modulere Th1 /Th2 balance i inflammatoriske responser og inhibering af cox-2 ved anvendelse af NS398 førte til en polarisering af responset af in vitro
stimulerede humane PBMC'er mod Th1 [53]. Forfatterne postuleret, at kronisk ekspression af COX-2 og produktion af PGE2 resulterer i en inhibering af effektiviteten af ​​den mucosale immunreaktion ved at øge en tilstand af tolerance. Genet ekspressionsmønster observerede vi her er faktisk i overensstemmelse med en virkning af Cox-2-inhibering på det inflammatoriske respons (se figur 3 og tabel 1), skønt ændringerne i ekspression af klassiske Th1 /Th2 mediatorer, såsom IL-12, I-10 og IL-4 ikke adskiller sig væsentligt i vores undersøgelse.
Infektion med H. pylori
er blevet rapporteret at beskadige epitelial integritet og flere potentielle mekanismer for denne er blevet rapporteret (revideret i [54]). CagA, en stor H. pylori
patogenicitet faktor, translokeres ind i epitelceller via type IV sekretion apparat [55, 56]. Studier i en hund nyre celle model (MDCK) viste, at CagA forbinder med den tight junction adapter protein zona occludens 1 (zo-1, mus homolog -tight junction protein 1, Tjp1) og junktionel adhæsionsmolekyle (Jcam eller Jam), hvilket til en langsigtet afbrydelse af Epitelbarrierefunktionen in vitro
[57]. Mens vi observeret forøget ekspression af Tjp1 dele på transkriptionsniveauet i NS398 behandlede inficerede mus blev Jcam
udtryk ikke påvirket. Desuden en EST med homologi til connexin 45 (AV148957, Gja7
) og AQP5
var påvirket af H. pylori
infektion uanset NS398 behandling (figur 3). Da både connexin 45 og AQP5 er kendt for at spille en rolle i intercellulære transport af vand og små molekyler, og der er eksperimentelt bevis for, at connexin 45 interagerer direkte med Tjp1 [58, 59], ser det ud til, at Cox-2 har også en rolle i vedligeholdelse af vandbalancen i det gastriske epitel. Denne idé er understøttet af vores in vitro
observationer af en cox-2 afhængig stigning i Zo-1 protein-ekspression i MKN28 celler. I modsætning til rapporterne fra Amieva et al. [57] denne effekt blev ikke relateret til CagA status af H. pylori
(figur 4). Barrierefunktion effekter i musemodellen er under alle omstændigheder usandsynligt, at skyldes handlinger CagA, som skønt vi fandt, at H. pylori
SS1 udtrykt CagA-protein, var vi ikke i stand til at detektere translokation i enten in vitro
eller in vivo
eksperimenter (data ikke vist). Derfor ser det ud til, at H. pylori
infektion har yderligere mekanismer til at påvirke epitelial integritet. Det er også bemærkelsesværdigt, at en anden H. pylori
patogenicitet faktor, vakuolerende toksin (VacA) forårsager dannelse af væskefyldte vakuoler i epitelceller og desuden kan denne aktivitet hæmmes in vitro
af NS398 behandling [60] . Som den gastriske aquaporin AQP5 udtrykkes på de laterale og intercellulære membraner i mavens krypter [59], vi spekulere at denne pore påvirkes af ændringer i tight junction-proteiner, og at det spiller en rolle i udviklingen af ​​ødem i epithelet under infektion.
En række offentliggjorte rapporter har forsøgt at kaste lys over genregulering i H. pylori
infektion ved hjælp af microarray tilgang til at studere den globale genekspression i gastriske epitelceller in vitro
[61-63] ( revideret i [64]), rapporterer en hurtig opregulering af inflammatoriske mediatorer og en række transkriptionsfaktorer for at være kendetegnende for ekspressionsmønsteret. I vores undersøgelse, ingen af ​​spredning gener (c-Fos, b-Fos, c-Jun
og cyclinD1
(PCNA
)) rapporteret af Sepulveda et al
., Eller de rapporterede af Cox et al
.

• Fedmekirurgi og mekanismer T2DM forbedring: en matematisk model
• Antimikrobiel aktivitet af naturlige produkter mod Helicobacter pylori: en review