Um romance difundir variante suscetibilidade ao câncer gástrico em E-caderina (CDH1) intron 2: Um estudo de caso-controle em uma população italiana

Um romance difundir variante suscetibilidade ao câncer gástrico em E-caderina (CDH1
) intron 2: Um estudo de caso-controle em uma população italiana da arte abstracta
Fundo
Herdado fatores genéticos, como a E-caderina (CDH1
) variantes do promotor são acreditados para influenciar o risco ao câncer gástrico difuso esporádica (DGC). Recentemente, uma nova região reguladora essencial para CDH1
transcrição foi identificada em CDH1
intron 2.
Métodos
Nós genotipados todos os polimorfismos conhecidos localizados dentro de sequências conservadas de CDH1
intron 2 (rs10673765, rs9932686, rs1125557, rs9282650, rs9931853) em uma população italiana que consiste em 134 casos DGC e 100 controles saudáveis ​​(55 parentes de pacientes e 45 independentes, os indivíduos pareados). A influência das variantes individuais no risco DGC foi avaliada usando χ 2-testes e regressão logística. A contribuição relativa dos alelos foi estimada pela análise de haplótipos
Resultados
Observamos uma significativa. (P < 0,0004) associação da CDH1
163 + 37235G > Uma variante (rs1125557) com o risco de DGC. odds ratio foram 4,55 (IC 95% = 2,09-9,93) e 1,38 (IC 95% = 0,75-2,55) para operadoras de AA e GA, respectivamente. Quando ajustado para idade, sexo, tabagismo, consumo de álcool e infecção por H. pylori
, as estimativas de risco permaneceu em grande parte significativa das transportadoras AA. análise de haplótipos sugeriu os 163 contribui + 37235A de alelo para o risco de doença de forma independente das outras variantes estudadas
Conclusão
O CDH1
163 + 37235G >. Um polimorfismo pode representar uma nova variante de susceptibilidade para a DGC esporádica, se confirmado em outras populações. Considerando a ampla expressão de E-caderina em epitélios, este estudo exploratório encoraja uma avaliação mais aprofundada do 163 + 37235A-alelo como uma variante da susceptibilidade em outros carcinomas.
Fundo
O câncer gástrico é uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer e é geralmente classificada em dois tipos histológicos, o intestinais ea forma difusa (classificação Lauren [1]). As taxas gerais de incidência de câncer de estômago estão em um declínio constante, principalmente devido à diminuição das taxas do tipo ou tipos de câncer intestinal. Esta frequência caindo acredita-se ser o resultado de uma melhor nutrição e condições sanitárias. Em contraste, a incidência de cancro gástrico difuso (DGC) sozinho parece ser mais estável ao longo das últimas décadas [1, 2]. Tal taxa constante sugere uma contribuição maior de risco genético herdado ao invés de fatores ambientais para a forma difusa de câncer de estômago.
Devido ao seu desenvolvimento precoce debaixo da superfície da mucosa gástrica [3], DGC é geralmente diagnosticado numa fase avançada e consequentemente, associado a um pior resultado [1]. Assim, os marcadores genéticos podem DGC facilitar a identificação de indivíduos em risco, contribuindo assim para uma melhoria em diagnóstico e terapia.
A um nível molecular DGC, DGC é distinto do tipo intestinal, com base em sua expressão anormal da célula molécula de adesão -cell E-caderina [4]. E-caderina é o principal componente da junção adherens epiteliais e, como tal, é necessária para a adesão intercelular funcional dentro de folhas epiteliais [5]. Em contraste com muitos outros cancros epiteliais, E-caderina é regulada negativamente muito cedo durante o desenvolvimento DGC, sugerindo um papel na iniciação da doença [3]. A mutação e hipermetilação do promotor do gene da caderina-E (CDH1
) são as alterações genéticas mais consistente observado em DGC esporádica [6, 7]. Além disso, CDH1
mutações germinativas predispor a DGC hereditária [8] consistente com uma função de iniciação da deficiência de E-caderina em DGC. CDH1
mutações germinativas normalmente co-segregar com um padrão dominante de doença entre as famílias afetadas e, ocasionalmente, pode ser encontrada em casos isolados DGC diagnosticados em uma idade jovem (< 45 y) [9]. No entanto, eles representam apenas cerca de 1% de todos os casos DGC [9] e, portanto, não pode explicar a etiologia genética postulou a contribuir para aparentes casos DGC esporádicos. que não CDH1
mutações germinativas alterações genéticas são, portanto, susceptíveis de aumentar o risco de desenvolvimento de DGC, na ausência de uma história familiar clara ou uma idade jovem no momento do diagnóstico.
variantes alélicas comuns com um efeito funcional leve pode influenciar o risco para a doença esporádica. Com efeito, um único polimorfismo de nucleótidos (SNP) dentro da CDH1
promotor (-160C > A) tem sido associado com um aumento significativo do risco de DGC esporádicos em certas populações de elevada incidência [10-13]. Do estudada CDH1
SNPs, o alelo promotor -160A é até agora o único variante implicados no risco DGC mas parece actuar em combinação com outros CDH1
polimorfismos [10, 13].
Recentemente, um novo CDH1 e região reguladora foi descrito [14]. Esta região está contida dentro CDH1
intrão 2, a maior não codificante CDH1
segmento (66% da sequência total) e foi demonstrado ser necessário tanto para a iniciação e manutenção de actividade transcricional CDH1
em epitélios diferenciada. Importante, intrão 2 sequências também são necessárias para a transcrição
CDH1 normais durante a vida adulta, proporcionando a possibilidade de que as variantes dentro desta região pode afectar carcinogénese gástrica difusa.
Neste estudo, foram genotipados todas as variantes conhecidas, localizadas dentro das sequências conservadas de CDH1
intron 2 e determinou suas freqüências alélicas em grupos de casos esporádicos DGC italianos e indivíduos saudáveis ​​para desvendar possíveis associações com a doença.
Métodos
pacientes
amostras de DNA foram obtidas de 134 pacientes que estavam DGC nativos do Distrito de Pesaro-Urbino, Região Marche, Itália central. Após a cirurgia, o diagnóstico DGC foi confirmado independentemente por dois patologistas. Os pacientes foram avaliados clinicamente no Serviço de Oncologia Unidade locais Médica (Hospital d'Urbino), onde também completou uma folha demográficas, incluindo a sua história de câncer pessoal e familiar. Os dados foram verificados durante as entrevistas com seus médicos de oncologia e sua história familiar foi rastreada para ≥ 3 gerações e lateralmente com 2 parentes º e 3 grau rd. Com base nesta avaliação, nenhum dos pacientes preencheram os critérios clínicos para câncer hereditário conhecidos. Os critérios de inclusão para os pacientes elegíveis foram: Europeu, nativa da área geográfica estudada e falta de histórico familiar de câncer. Os mesmos critérios além de falta de histórico pessoal de câncer foram adotados para controles. As amostras de ADN de controlo foram obtidos a partir de 55 parentes saudáveis, que eram ambos os pais não afectados (n = 15), irmãos (22) ou crianças (18) dos pacientes estudados DGC. Como parentes saudáveis ​​não estavam disponíveis para cada paciente DGC, amostras de DNA de um grupo de indivíduos saudáveis ​​não relacionados (n = 45) identificados através da associação de antigos e atuais doadores de sangue do Hospital d'Urbino foram incluídos rendendo um total de 100 controles. controles não relacionados foram selecionados aleatoriamente com frequências correspondentes a casos por idade e sexo. A idade média dos pacientes DGC, sem parentes foi de 54,6 y ± 11.41SD, enquanto que a dos seus controles foi de 52,2 y ± 10.21SD. Todos os indivíduos foram entrevistados sobre seus hábitos de fumar e beber. H. pylori
estatuto foi determinada por exame patológico de amostras gástricas de casos, e por exames de sangue ou respiração para controles. As exigências éticas foram verificados e aprovados pela Comissão de Ética interna (Hospital d'Urbino) e todos os participantes do estudo deram o seu consentimento informado por escrito.
Intron 2 regiões conservadas CDH1 e polimorfismos
regiões do CDH1 conservado
intron 2 (GenBank NC_000016) foram identificados por recuperar sequências de humano, chimpanzé, rato e de murganho correspondentes do banco de dados NCBI (NCBI, Entrez nucleotídeo) seguido de alinhamento usando o servidor NCBI (NCBI, Básico local Alignment Search Tool) e Invitrogen Vector NTI Avanço ™ 9.0 software (Accelrys software Inc, San Diego, EUA). regiões conservadas foram definidos como tendo variações de sequência inferior a 5% entre as diferentes espécies. As regiões conservadas foram amplificadas por PCR em fragmentos de cerca de 200 pb de tamanho de sobreposição. Os iniciadores correspondentes (ver Tabela 1 para as sequências e condições) foram concebidos utilizando a ferramenta online GeneFisher [15] e fabricada por Sigma-Proligo (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, EUA). foram usadas FastStart Taq DNA polimerase (Roche, Basileia, Suíça) e PTC-200 (MJ máquinas de PCR Research, Waltham, EUA). Os seguintes polimorfismos estão localizados (Ensemble GenomeBrowser [16]) dentro das regiões amplificadas: 163 + 14184ΔAGGG (rs10673765, localizado no fragmento de PCR C2F1), 163 + 14384C > T (rs9932686, C2F2), 163 + 37235G > A (rs1125557, C3F2 ), 163 + 37276T > A (rs9282650, C3F2), e 163 + 49526C > G (rs9931853, C4F1). A ferramenta online TESS [17] foi usado para procurar por sites de factor de ligação de transcrição putativo que podem ser afetados pela acima variants.Table 1 primers e condições de PCR

Atacante primário
iniciador inverso
Ta *
Mg ++ †
DMSO ‡
C1F1
ccgccttaaagaaactcttg
accggtggcaaatactag
65 ° C
1,5
- C1F2
tagaagggttgaacctgttc
tcttagtccacgagaagaag
65 ° C
1,5 viajantes -
C1F3
taggagagcttgtaacaagc
cactcggttctaccgaag
65 ° C
1,5
- C2F1
tgtattagccacagagaag
ctaaaactagaccacgaag
65 ° C
1,5 viajantes -
C2F2
gtcacaaaacagcttg
ccttccttgagcaaggc
65 ° C
1,5
- C3F1
ttgcctaaggccccctttttgttc
gaatctgcgaagtctacatc
65 ° C
1,5
-
C3F2
acactagccacacatgggactcaag
tgctggtgtggattcaaatgtg
65 ° C
1,5
- C4F1
acctccgcctcctgggttcaagc
ttcctcccgcttagtg
60 ° C
1,5
- C4F2
tggccaggcctgtcttaaactc
ttcttaggtccgtgggtttttacg
65 ° C
1,5
- C4F3
aaagtgctgggattacaggtgtgag
tcgataatcccgagaactc
55 ° C
1.0
+
C4F4
gaaccataggactttgactgatgg
actgatggttatccgggttcccttg
65 ° C
1,5
- C4F5
agctgttgagctgtcatcacaatcc
gaatttcctacccgtctatggtagg
65 ° C
1,5
- C5F1
tagtggggagtggggtcttagcttc
tcgttcaccctcctttcttcttacc
58 ° C
1,5
- C5F2
gggcatgttgaaatatacccagtc
tctgagtaatagaggggtacgttgg
65 ° C
1,5
- C5F3
cttgccagcgtgacagtg
cgaaaccccgtggagtag
65 ° C
1,5
- C5F4
caggttggggctcctcgtcatactg
cttccgacgtgacttaaggaaagag
65 ° C
1,5
- C5F5
gcttgtctcaactttcactgtc
gaatttcctacccgtctatggtagg
65 ° C
1,5
- C6F1
tggtattcaggaggatgcag
acctacgatcgtaaaaagt
65 ° C
1,5
- C6F2
cccatcaatgcttatttgttctt
gcctgggagacggagact
65 ° C
1,5
- C6F3
tgggctgtttgagttttgttc
cggtgtaaaaggttcgtgac
65 ° C
1,5
- * Ta temperatura de recozimento; † Mg ++ - concentração é dada em mM; ‡ DMSO foi adicionado a 5% fc
polimorfismo de conformação de filamento único
Single-Strand polimorfismo de conformação (SSCP) foi utilizado para digitalizar a região conservada intron 2 em 19 pacientes DGC italianos para a presença de comum adicional, mas população- polimorfismos específicos. SSCP foi realizada como descrito [18], com a excepção de que ULS ™ 495 fluoróforo (Kreatech Biotecnologia, Amsterdão, Holanda) foi usado em vez de radioactividade para marcar os fragmentos. Em resumo, 1 ul do produto de PCR foi incubada com 0,2 uL de corante de uma reacção de 20 ul. . Os géis foram varridos usando um gerador de imagens moleculares FX (BioRad, Hercules, EUA) a 488 nm
Genotipagem
as seguintes enzimas de restrição foram utilizados para a genotipagem de DNA variantes: 0,06 L BsaXI /ul para 163 + 14184ΔAGGG, 1 U /mL BanII Compra de 163 + 14384C > T, 0,2 U /mL MaeIII Compra de 163 + 37276T > a, e 0,4 U /mL HpaII Compra de 163 + 49526C > G. Todas as enzimas foram da New England Biolabs (Ipswich, EUA), com a excepção de MaeIII
a partir de Roche (Basileia, Suíça). As reacções foram incubadas durante a noite e os fragmentos foram separados em 4% (w /v) de geles de agarose
Polimorfismos 163 + 37235G >. A e 163 + 37276T > A foram genotipados em um ABI Prism 7900 (Applied Biosystems, Foster City, EUA) usando o em tempo real os ensaios de discriminação alélicas da Applied Biosystems PCR-based de acordo com as instruções fornecidas.
sequenciação
variantes detectadas foram verificadas por sequenciação directa, utilizando o kit thermosequencing (USB, Cleveland, EUA) e um LiCor 4000L sequenciador de DNA (LiCor, Lincoln, Nebraska EUA). a análise estatística
Diferencial distribuições entre os casos e controles foram avaliados pelo χ 2-teste (com df = 2 para genótipos e df = 1 para alelos) . O risco foi estimado por análise uni e por regressão logística múltipla (software STATA, StataCorp LP, College Station, EUA). O χ 2-teste (df = 2) também foi utilizada para examinar os desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg. As diferenças de idade entre os pacientes portadores de diferentes genótipos foram calculados usando um teste t de duas caudas.
frequências dos haplótipos foram reconstruídos a partir de genótipos unphased e desequilíbrio de ligação (LD) entre SNPs foi estimada utilizando a plataforma SHEsis software [19, 20]. Apenas haplótipos com uma frequência relativa > 0,03 em ambos os casos ou os controlos foram incluídos na análise. associação global dos haplótipos com doença foi calculado por um χ 2-teste (df = 7). O 163 + 14184ΔAGGG e 163 + 14384C > variantes T não foram incluídos na análise final, pois não foram informativo. A associação de haplótipos individuais com doença foi baseado em 2 × 2 tabelas de contingência em comparação com o haplotipo A-A-C. LD foi expressa como r 2, com r 2 = 1 indicando LD completo, r 2 = 0 ausência de LD, e r 2 < 0,33 sugerindo LD mínima.

Resultados Seis regiões conservadas com um tamanho total de 3,2 kbp foram identificados dentro CDH1
intron 2. Para além dos cinco polimorfismos conhecidos (CDH1
163 + 14184ΔAGGG (rs10673765), 163 + 14384C > T (rs9932686), 163 + 37235G > a (rs1125557), 163 + 37276T > a (rs9282650) e 163 + 49526C > G (rs9931853)), há polimorfismos comuns adicionais específicos para a população italiana em estudo foram descoberto por SSCP nas seis regiões.
Usando restrição do comprimento do fragmento polimorfismo e ensaios de discriminação alélicas, as frequências relativas dos genótipos resultantes das cinco variantes foram determinados nos casos DGC e os controles. Seqüenciamento de amostras aleatórias confirmou os respectivos genótipos. Todos os polimorfismos estavam em Hardy-Weinberg para os dois casos e controles (p > 0,19). A Tabela 2 resume as distribuições genotípicas e suas diferenças entre casos e controls.Table 2 CDH1
distribuições intron 2 genótipos entre casos e controles
DGC + 14184ΔAGGG casos (n = 134)
+ 14184ΔAGGG controles (n = 100)
χ2-teste
OR (95% CI) *, †
OR (IC 95%) *, †
+ /+
+ /Δ
Δ /Δ
+ /+
+ /Δ
Δ /Δ
p
Δ /Δ vs + /+
+ /Δ vs + /+
128 4
2
96
3
1

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