Un romanzo diffuso gastrico variante cancro suscettibilità in E-caderina (CDH1) introne 2: uno studio caso-controllo in una popolazione italiana

Un romanzo diffuso gastrico variante cancro suscettibilità in E-caderina (CDH1
) introni 2: uno studio caso-controllo in una popolazione italiana
Abstract
sfondo
Inherited fattori genetici come la E-caderina (CDH1
) varianti promotore si ritiene di influenzare il rischio di cancro gastrico verso diffuso sporadici (DGC). Recentemente, una nuova regione normativo essenziale per CDH1
trascrizione è stata identificata in CDH1
introne 2. Metodi
Abbiamo genotipizzarono tutti i polimorfismi noti situati all'interno di sequenze conservate CDH1
introne 2 (rs10673765, rs9932686, rs1125557, rs9282650, rs9931853) in una popolazione italiana composto da 134 casi DGC e 100 controlli sani (55 parenti dei pazienti e 45 non imparentati, individui abbinati). L'influenza di singole varianti sul rischio DGC è stata valutata utilizzando χ 2-test e regressione logistica. Il contributo relativo degli alleli è stato stimato da analisi dell'aplotipo
Risultati
Abbiamo osservato un significativo. (P < 0,0004) associazione del CDH1
163 + 37235G > Una variante (rs1125557) con il rischio DGC. Odds ratio erano 4,55 (95% CI = 2,09-9,93) e 1,38 (95% CI = 0,75-2,55) per i vettori AA e GA, rispettivamente. Dopo l'aggiustamento per età, sesso, abitudine al fumo, assunzione di alcol e H. pylori
infezione, le stime di rischio sono rimasti in gran parte significativa per i vettori AA. Le analisi dell'aplotipo suggeriva i 163 contribuisce + 37235A-allele a rischio di malattia indipendentemente dalle altre varianti studiate
Conclusione
Il CDH1
163 + 37235G >. Un polimorfismo può rappresentare una nuova variante di suscettibilità per sporadici DGC se confermato in altre popolazioni. Considerando l'ampia espressione di E-caderina in epiteli, questo studio esplorativo incoraggia inoltre la valutazione del 163 + 37235A-allele come variante sensibilità in altri carcinomi.
Sfondo
cancro gastrico è una delle principali cause di morte per cancro ed è di solito classificati in due tipi istologici, il intestinale e la forma diffusa (classificazione Lauren [1]). I tassi di incidenza generale per il cancro dello stomaco sono in un costante declino, in gran parte a causa della diminuzione dei tassi di cancro di tipo intestinale. Questa frequenza di cadere si crede di essere il risultato di una migliore nutrizione e condizioni igienico-sanitarie. Al contrario, l'incidenza di cancro gastrico diffuso (DGC) da solo appare più stabile negli ultimi decenni [1, 2]. Tale tasso costante suggerisce un maggiore contributo di rischio genetico ereditato, piuttosto che fattori ambientali alla forma diffusa di cancro allo stomaco.
Grazie al suo sviluppo precoce di sotto della superficie della mucosa gastrica [3], DGC è di solito diagnosticata in una fase avanzata e conseguentemente associata con un esito peggiore [1]. Pertanto, genetici marcatori DGC possono all'identificazione degli individui a rischio e quindi contribuire al miglioramento nella diagnosi e nella terapia DGC.
A livello molecolare, DGC si distingue dal tipo intestinale sulla base della sua espressione anormale della cella molecola di adesione -cell E-caderina [4]. E-caderina è il componente chiave della giunzione adherens epiteliali e come tale è necessario per l'adesione intercellulare funzionale all'interno di fogli epiteliali [5]. A differenza di molti altri tipi di tumore epiteliale, E-caderina è downregulated molto presto durante lo sviluppo DGC, suggerendo un ruolo nell'insorgenza di questa malattia [3]. Mutazione e ipermetilazione del promotore del gene E-caderina (CDH1
) sono le alterazioni genetiche più consistenti osservati in sporadici DGC [6, 7]. Inoltre, CDH1
mutazioni germinali predispongono a ereditaria DGC [8] compatibile con una funzione di avvio di carenza di E-caderina in DGC. CDH1
mutazioni germinali di solito co-segregano con un motivo dominante della malattia tra le famiglie colpite, e, occasionalmente, può essere trovato in casi isolati DGC diagnosticati in giovane età (< 45 y) [9]. Tuttavia, essi rappresentano solo l'1% di tutti i casi DGC [9] e, quindi, non può spiegare l'eziologia genetica postulato di contribuire alla apparenti casi sporadici DGC. alterazioni genetiche diverse CDH1
mutazioni germinali sono quindi suscettibili di aumentare il rischio di sviluppare DGC, in assenza di una storia familiare trasparente o in giovane età al momento della diagnosi.
varianti alleliche comuni con un effetto funzionale mite può influenzare il rischio per la malattia sporadica. In effetti, un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) all'interno del CDH1
promotore (-160C > A) è stato associato ad un aumento significativo del rischio di sporadici DGC in alcune popolazioni ad alta incidenza [10-13]. Del studiato CDH1
SNP, l'allele -160A promotore è finora l'unica variante implicati nel rischio DGC, ma sembra agire in combinazione con altri CDH1
polimorfismi [10, 13].
Recentemente, una nuova CDH1
regione regolatoria è stato descritto [14]. Questa regione è contenuta all'interno CDH1
introne 2, il più grande non codificante CDH1
segmento (66% della sequenza totale) e ha dimostrato di essere richiesti sia per l'avvio e il mantenimento di trascrizionale CDH1
attività in epiteli differenziata. È importante sottolineare che, introne 2 sequenze sono anche necessari per la normale CDH1
trascrizione durante la vita adulta, fornendo la possibilità che le varianti all'interno di questa regione possono influenzare diffusa carcinogenesi gastrica.
In questo studio, abbiamo genotipizzati tutte le varianti conosciute situate all'interno delle sequenze conservate di CDH1
introni 2 e determinato le loro frequenze alleliche in gruppi di sporadici casi DGC italiani e individui sani di svelare possibili associazioni con la malattia.
Metodi
pazienti
campioni di DNA sono stati ottenuti da 134 pazienti che erano DGC nativi del Comune di Pesaro-Urbino, Regione Marche, Italia centrale. Dopo l'intervento chirurgico, la diagnosi DGC è stata confermata in modo indipendente da due patologi. I pazienti sono stati valutati clinicamente presso la UO Oncologia Medica locale (Ospedale d'Urbino), dove hanno anche completato un foglio demografica, compresi la loro storia personale e familiare di cancro. I dati sono stati verificati durante le interviste con i loro medici di oncologia e la loro storia di famiglia è stata fatta risalire per ≥ 3 generazioni e lateralmente a 2 parenti ° e 3 ° grado. Sulla base di questa valutazione, nessuno dei pazienti ha incontrato i criteri clinici per note sindromi tumorali familiari. I criteri di inclusione per i pazienti eleggibili sono stati: etnia caucasica, originario della zona geografica studiato e la mancanza di storia familiare di cancro. Gli stessi criteri più la mancanza di storia personale di cancro sono stati adottati per i controlli. campioni di DNA di controllo sono stati ottenuti da 55 parenti sani, che erano o genitori non affetti (n = 15), i fratelli (22) o bambini (18) dei pazienti studiati DGC. Come i parenti sani non erano disponibili per ogni paziente DGC, campioni di DNA da un gruppo di individui sani non imparentati (n = 45) identificati attraverso il pool di ex e attuali donatori di sangue dall'Ospedale d'Urbino sono stati inclusi ottenendo un totale di 100 controlli. non imparentati controlli sono stati selezionati in modo casuale con le frequenze corrispondenti ai casi per età e sesso. L'età media dei pazienti DGC senza parenti era 54,6 ± y 11.41SD, mentre quella dei loro controlli appaiati era 52,2 ± y 10.21SD. Tutti i soggetti sono stati intervistati circa le loro abitudini di fumare e bere. H. pylori
stato è stato determinato con l'esame patologico dei campioni gastrici per i casi, e da analisi del sangue o respiro per i controlli. I requisiti etici sono stati verificati e approvati dal Comitato Etico interno (Ospedale d'Urbino), e tutti i partecipanti allo studio hanno dato il loro consenso informato scritto.
CDH1 introni 2 conservato regioni e polimorfismi
Conservati regioni del CDH1
introne 2 (GenBank NC_000016) sono stati identificati recuperando corrispondenti sequenze umane, scimpanzé, topo e topo dal database NCBI (NCBI, Entrez nucleotide), seguita da allineamento utilizzando il server NCBI (NCBI, base locale Alignment Search Tool) e Invitrogen Vector NTI Advance ™ 9.0 software (Accelrys software Inc, San Diego, Stati Uniti d'America). regioni conservate sono stati definiti come aventi variazioni di sequenza inferiore al 5% tra le diverse specie. Le regioni conservate sono stati PCR-amplificate in sovrapposizione frammenti di circa 200 bp dimensioni. I primer corrispondenti (vedi Tabella 1 per le sequenze e le condizioni) sono stati progettati utilizzando lo strumento online GeneFisher [15] e prodotto da Sigma-Proligo (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Stati Uniti d'America). sono stati utilizzati FastStart Taq DNA polimerasi (Roche, Basilea, Svizzera) e PTC-200 PCR macchine (MJ Research, Waltham, USA). I seguenti polimorfismi si trovano (Ensemble GenomeBrowser [16]) all'interno delle regioni amplificate: 163 + 14184ΔAGGG (rs10673765, situato in PCR frammento C2F1), 163 + 14384C > T (rs9932686, C2F2), 163 + 37235G > A (rs1125557, C3F2 ), 163 + 37276T > A (rs9282650, C3F2), e 163 + 49526C > G (rs9931853, C4F1). Lo strumento online TESS [17] è stato utilizzato per la ricerca di trascrizione putativi siti di legame fattore che potrebbero essere limitati da quanto sopra variants.Table 1 primer e condizioni di PCR

Forward Primer
Reverse Primer
Ta *
Mg ++ †
DMSO ‡
C1F1
ccgccttaaagaaactcttg
accggtggcaaatactag
65 ° C
1.5 -
C1F2
tagaagggttgaacctgttc
tcttagtccacgagaagaag
65 ° C
1.5
-
C1F3
taggagagcttgtaacaagc
cactcggttctaccgaag
65 ° C
1.5 -
C2F1
tgtattagccacagagaag
ctaaaactagaccacgaag
65 ° C
1.5
-
C2F2
gtcacaaaacagcttg
ccttccttgagcaaggc
65 ° C
1.5 -
C3F1
ttgcctaaggccccctttttgttc
gaatctgcgaagtctacatc
65 ° C
1.5
-
C3F2
acactagccacacatgggactcaag
tgctggtgtggattcaaatgtg
65 ° C
1.5 -
C4F1
acctccgcctcctgggttcaagc
ttcctcccgcttagtg
60 ° C
1.5 -
C4F2
tggccaggcctgtcttaaactc
ttcttaggtccgtgggtttttacg
65 ° C
1.5 -
C4F3
aaagtgctgggattacaggtgtgag
tcgataatcccgagaactc
55 ° C
1.0
+
C4F4
gaaccataggactttgactgatgg
actgatggttatccgggttcccttg
65 ° C
1.5 -
C4F5
agctgttgagctgtcatcacaatcc
gaatttcctacccgtctatggtagg
65 ° C
1.5 -
C5F1
tagtggggagtggggtcttagcttc
tcgttcaccctcctttcttcttacc
58 ° C
1.5 -
C5F2
gggcatgttgaaatatacccagtc
tctgagtaatagaggggtacgttgg
65 ° C
1.5 -
C5F3
cttgccagcgtgacagtg
cgaaaccccgtggagtag
65 ° C
1.5 -
C5F4
caggttggggctcctcgtcatactg
cttccgacgtgacttaaggaaagag
65 ° C
1.5 -
C5F5
gcttgtctcaactttcactgtc
gaatttcctacccgtctatggtagg
65 ° C
1.5 -
C6F1
tggtattcaggaggatgcag
acctacgatcgtaaaaagt
65 ° C
1.5 -
C6F2
cccatcaatgcttatttgttctt
gcctgggagacggagact
65 ° C
1.5 -
C6F3
tgggctgtttgagttttgttc
cggtgtaaaaggttcgtgac
65 ° C
1.5 -
* temperatura di ricottura Ta; † Mg ++ - la concentrazione è dato in mm; ‡ DMSO è stato aggiunto al 5% fc
polimorfismo conformazione singolo filamento
singolo filamento conformazione polimorfismo (SSCP) è stato utilizzato per eseguire la scansione del conservata regione introne 2 in 19 pazienti DGC italiani per la presenza di ulteriore comune, ma population- polimorfismi specifici. SSCP è stata eseguita come descritto [18], con l'eccezione che ULS ™ 495 fluoroforo (Kreatech Biotechnology, Amsterdam, Paesi Bassi) è stato usato al posto di radioattività per etichettare i frammenti. In breve, 1 ml prodotto di PCR è stata incubata con 0,2 ml di colorante in una reazione di 20 microlitri. . I gel sono stati digitalizzati utilizzando un imager molecolare FX (BioRad, Hercules, Stati Uniti d'America) a 488 nm
genotipizzazione
I seguenti enzimi di restrizione sono stati utilizzati per la genotipizzazione del DNA varianti: 0,06 U /ml BsaXI per 163 + 14184ΔAGGG, 1 U /ml banii Compra di 163 + 14384C > T, 0,2 U /ml MaeIII Compra di 163 + 37276T > a, e 0,4 U /ml HpaII Compra di 163 + 49526C > G. Tutti gli enzimi sono stati da New England Biolabs (Ipswich, USA) con l'eccezione di MaeIII
da Roche (Basilea, Svizzera). Le reazioni sono state incubate durante la notte e frammenti sono stati separati su 4% (w /v) gel di agarosio
polimorfismi 163 + 37235G >. A e 163 + 37276T > A sono stati genotipizzati su un ABI Prism 7900 (Applied Biosystems, Foster City, Stati Uniti d'America) utilizzando la PCR in tempo reale basata su test di discriminazione allelica da Applied Biosystems secondo le istruzioni fornite.
sequencing
varianti rilevate sono state verificate dal sequenziamento diretto utilizzando il kit thermosequencing USB (USB, Cleveland, USA) e un LiCor 4000L sequenziatore di DNA (LiCor, Lincoln, Nebraska stati Uniti d'America). l'analisi statistica

Differenziale distribuzioni tra casi e controlli è stata effettuata dal χ 2-test (con df = 2 per genotipi e df = 1 per alleli) . Rischio è stato stimato mediante analisi univariata e regressione logistica multipla (software STATA, StataCorp LP, College Station, Stati Uniti d'America). Il χ 2-test (df = 2) è stato utilizzato anche per esaminare le deviazioni dalla Hardy-Weinberg. differenze di età tra i pazienti che trasportano diversi genotipi sono stati calcolati utilizzando un t-test 2-code.
frequenze Haplotype sono state ricostruite da genotipi unphased e linkage disequilibrium (LD) tra SNPs è stato stimato utilizzando la piattaforma software SHEsis [19, 20]. Solo aplotipi con una frequenza relativa > 0,03 in entrambi i casi o controlli sono stati inclusi nell'analisi. un'associazione globale di aplotipi affetti da malattia è stato calcolato un χ 2-test (df = 7). Il 163 + 14184ΔAGGG e 163 + 14384C > le varianti T non sono stati inclusi nell'analisi finale in quanto non erano ben informato. L'associazione dei singoli aplotipi con malattia era basato su 2 × 2 tabelle di contingenza rispetto al aplotipo A-A-C. LD è stato espresso come r 2, con r 2 = 1 indica LD completo, r 2 = 0 assenza di LD, e r 2 < 0,33 suggerendo LD minimo
. Risultati
sei regioni conservate con una dimensione totale di 3,2 kbp sono stati individuati all'interno CDH1
introne 2. Oltre ai cinque polimorfismi noti (CDH1
163 + 14184ΔAGGG (rs10673765), 163 + 14384C > T (rs9932686), 163 + 37235G > a (rs1125557), 163 + 37276T > a (rs9282650), e 163 + 49526C > G (rs9931853)), non polimorfismi comuni aggiuntivi specifici per la popolazione italiana sotto studio sono stati scoperto da SSCP nelle sei regioni.
Utilizzando rflp e saggi di discriminazione allelica, le frequenze relative dei genotipi derivanti dai cinque varianti sono state determinate nei casi DGC ed i controlli. Sequenziamento di campioni casuali confermato le rispettive genotipi. Tutti i polimorfismi erano in Hardy-Weinberg per entrambi i casi ed i controlli (p > 0,19). La tabella 2 riassume le distribuzioni genotipiche e le loro differenze tra casi e controls.Table 2 CDH1
distribuzioni introne 2 genotipiche tra i casi ei controlli DGC
+ 14184ΔAGGG casi (n = 134)
+ 14184ΔAGGG controlli (n = 100)
χ2 test
OR (95% CI) *, †
OR (IC 95%) *, †
+ /+
+ /Δ
Δ /Δ
+ /+
+ /Δ
Δ /Δ p

Δ /Δ vs + /+
+ /Δ vs + /+
128 Pagina 4 2
96
3
1 0,947
1,50 (0,13-16,78)
1,00 (0,21-4,57)
95,5%
3%
1,5%
97%
1,5%
1,5%
14,2%
2,5%
+ 14384C > casi T (n = 134)
+ 14384C > controlli T (n = 100)
χ 2 -test
OR (95% CI)
OR (95% CI)
CC
CT
TT
CC
CT
TT
p
TT vs CC
CT vs CC
130 Pagina 2 2
98
1 1
0,895
1.51 (0,13-16,87)
1.51 (0,13-16,87)
97,0%
1,5%
1,5%
98,0%
1,0%
1,0%
12,3% 12,3%

+ 37235G > A casi (n = 134)
+ 37235G > A controlli (n = 100)
χ 2-test
OR (95% CI)
OR (95% CI)
GG
GA
AA
GG
GA
AA
p
AA vs GG
GA vs GG
30
56
48
37
50

• Il rapporto di crescita endoteliale vascolare polimorfismi del gene fattore e l'outcome clinico nei pazienti con cancro gastrico avanzato trattati con FOLFOX: polimorfismo VEGF nel carcinoma gastrico
• chemioradioterapia preoperatoria per localmente avanzato cancer