PLoS ONE: Den Redusert uttrykk for Proangiogenic vekstfaktorer og deres reseptorer i magesår av cirrhosepasienter

Abstract

Mål

patogenesen av høyere forekomst av magesår hos pasienter med cirrhose er kompleks. Blodplater kan stimulere angiogenese og fremme magesår helbredelse. Vi sammenlignet uttrykk for proangiogenic vekstfaktorer og deres reseptorer i magesår margin mellom cirrhosepasienter med trombocytopeni og de ikke-cirrhosepasienter å belyse mulige mekanismer.

Metoder

Kvalifiserte cirrhosepasienter ( n = 55) og ikke-cirrhosepasienter (n = 55) som hadde magesår ble registrert. Mucosa fra de gastriske sår margin og ikke-ulcus områder ble tatt prøver av og mRNA uttrykk for proangiogenic vekstfaktorer (vaskulær endotelial vekstfaktor [VEGF], blodplate-avledet vekstfaktor [PDGF], basisk fibroblast vekstfaktor [bFGF]) og deres reseptorer (VEGFR1, VEGFR2, PDGFRA, PDGFRB, FGFR1, FGFR2) ble målt og sammenlignet. Antall blodplater og uttrykk for disse vekstfaktorer og deres reseptorer ble korrelert med hverandre.

Resultater

De to gruppene var sammenlignbare med hensyn til kjønn, sår størrelse og infeksjonsrate på . Helicobacter pylori
imidlertid cirrhose gruppe var yngre alder, hadde en lavere blodplateantall enn de i den ikke-cirrhose gruppe (p 0,05). De cirrhosepasienter hadde redusert mRNA uttrykk for PDGFB, VEGFR2, FGFR1, og FGFR2 i magesår margin sammenlignet med de av de ikke-cirrhosepasienter (p < 0,05). Redusert uttrykk for PDGFB og VEGFR2, FGFR1, og FGFR2 var godt korrelert med graden av trombocytopeni i disse cirrhosepasienter (ρ > 0,5, p < 0,001).

Konklusjoner

Våre funn underforstått at redusert aktivitet av proangiogenic faktorer og deres reseptorer kan bidra til patogenesen av magesår i cirrhosepasienter

Citation. Luo JC, Peng YL, Hou MC, Huang KW, Huang HC, Wang YW, et al. (2013) The Redusert uttrykk for Proangiogenic vekstfaktorer og deres reseptorer i magesår av cirrhosepasienter. PLoS ONE 8 (4): e61426. doi: 10,1371 /journal.pone.0061426

Redaktør: Matias A. Avila, Universitetet i Navarra School of Medicine og Senter for anvendt medisinsk forskning (CIMA), Spania

mottatt: 24. desember 2012; Godkjent: 09.03.2013; Publisert: 19 april 2013

Copyright: © 2013 Luo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Den nåværende studien ble støttet av forskningsmidler fra Taipei Veterans General Hospital (V101-028 og V102C-006). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Tidligere studier har vist at pasienter med cirrhose har en høyere forekomst av magesår (PUD) enn den generelle befolkningen [1], [2]. Nye store populasjonsbaserte kohortstudier fra Taiwan har vist at pasienter med cirrhose har en høyere risiko for å utvikle magesår blødning (PUB) og sår ny blødning [3], [4]. Patogenesen av den høyere forekomsten av PUD i cirrhosepasienter er kompleks og flere faktorer. Teoretisk er portal hypertensjon involvert som bevirker innvoller lunger, nedsatt reparerende prosesser av gastro-duodenal mucosa, og gastriske mikro-vaskulære abnormaliteter [5], [6], som alle fører til økt mottakelighet for syre og pepsin. Det er også blitt vist at en cirrhose betingelse fører til svekket gastrisk mucosal forsvar /reparasjonsmekanismer, inkludert svekket bikarbonat og slimsekresjon, redusert endogen prostaglandinsyntesen, gastrisk mucosal blodstrømning, og redusert slimhinneoksygene [7], [8], [9 ].

Sår formasjonen er en dynamisk ubalanse mellom aggressive slimhinne faktorer og defensive /reparere faktorer. Når disse defensive og helbredende faktorer er mindre enn de aggressive faktorer, slimhinneskader forverres og sår utvikle [10]. Angiogenese er en sentral prosess i magesår helbredelse [11]. Flere proangiogenic faktorer er lagret i blodplater, inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF), og blodplateavledet vekstfaktor (PDGF) [12]. Disse vekstfaktorer er gitt ut i sår utgangspunkt blodplater og aktivere og fremme dannelsen av nye blodkar under hemostase fase av sårtilheling [13]. Dette er sannsynligvis å ta hensyn til muligheten av blodplater for å stimulere angiogenese og å fremme helbredelse av magesår [12], [14]. Trombocytopeni er vanligvis sett i cirrhosepasienter grunn av miltblodplatebinding og en reduksjon i nivået og aktiviteten til trombopoietin [15].

I denne studien har vi sammenlignet uttrykk for proangiogenic vekstfaktorer (VEGF, PDGF, bFGF ) og deres reseptorer (VEGFR1, VEGFR2, PDGFRA, PDGFRB, FGFR1, FGFR2) over magesår margin mellom cirrhosepasienter med trombocytopeni og de ikke-cirrhosepasienter uten trombocytopeni. I tillegg undersøkte vi hvilken rolle proangiogenic faktorer og deres reseptorer i magesår helbredelse i cirrhosepasienter.

Materialer og Metoder

Pasienter Påmelding

cirrhose og ikke-cirrhosepasienter diagnostisert med magesår påvist av video esophagogastroduodenoscopy (EGD) (Olympus GIF-XQ260 gastrointestinal videoscope, Aizo Olympus, Fukushima, Japan) ble fortløpende inkludert. Diagnosen av skrumplever i denne studien var basert på karakteristiske funn, inkludert fysisk stigmata av skrumplever, computertomografi eller ultralyd funn av en knute lever overflate, coarsened ekkogenisitet av leveren parenchyma, en forstørret milt, og påvisning av esophageal varicer med endoskopi [ ,,,0],16]. Eksklusjonskriterier inkluderte de som tar aspirin, ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDs), klopidogrel, tiklopidin, steroider, protonpumpehemmere, histamin reseptor 2 antagonister, misoprostol eller sorafenib, og de som drakk alkohol eller røykt, hadde trombocytopeni (platetall < 30000 /mm ^{3), leverkreft eller annen kreft, inkludert maligne sår, aktive sår med blødning, en tidligere historie med gastrisk kirurgi, blødningstendens, uremi, ustabile sykdomsaktivitet eller dårlig allmenntilstand [17]. Denne studien ble godkjent av Institutional Review Committee of Taipei Veterans General Hospital (TVGHIRB: 98-12-04) og ble gjennomført i samsvar med retningslinjene i Helsinkideklarasjonen. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke før du deltar i denne studien under forutsetning av at de hadde magesår under EGD.}

Målinger

Pasientenes medisinske og personlige historier ble anmeldt, og laboratorie data, inkludert blodplater telle, serum albumin, hemoglobin, og kreatinin ble registrert. Under EGD prosedyren, ble størrelsen av magesår målt ved anvendelse av kalibrerte biopsitang [18], og mucosal vev fra sår margin ble tatt som standard prosedyre for histologiske undersøkelser for å utelukke ondartet sykdom, og for å detektere Helicobacter pylori (H. pylori)
infeksjon (Giemsa beis) [17], [18]. Mukosalt vev (totalt ca. 15 mg, to stykker av prøvene) fra sår margin og ikke-ulcus områder (antrum) ble tatt henholdsvis via endoskopisk biopsi og fryses umiddelbart i flytende nitrogen og deretter lagret ved -80 ° C inntil videre analyse. Sår ble definert som slimhinne pauser ≥3 mm [17], [18]. Alle endoskopi prosedyrer ble utført og kopieres av to senior endoscopists (Luo og Hou), og diagnosen magesår ble bekreftet av ytterligere to endoscopists som var blindet for den kliniske status av fagene.

Isolering av mRNA og real-time PCR

den totale RNA ble ekstrahert fra mageslimhinnen ved hjelp av 500 mL TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) i henhold til produsentens protokoll. RNA ble ytterligere renset ved anvendelse av 100 ul kloroform behandling, og deretter utfelt ved å bruke 250 pl isopropanol før det komplementære DNA-syntese. Det genomiske DNA forurenset i den ekstraherte RNA ble ødelagt ved bruk av DNaseI (Invitrogen, USA) ved romtemperatur i 15 min. Kvaliteten av den isolerte RNA ble bekreftet ved elektroforese på 1,0% agarose-formaldehyd-gel, og dens mengde ble bestemt ved å måle absorbansen ved bølgelengder på 260-og 280-nm. Den enkelttrådet komplementær DNA ble syntetisert ved hjelp GoScript ™ revers transkriptase (Promega, USA) og oligo dT primer [19].

For å kvantifisere genekspresjon av VEGF, VEGFR1, VEGFR2, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, bFGF, FGFR1, FGFR2, ble kvantitative real-time polymerase kjedereaksjoner (PCR) utført ved hjelp av en LightCycler®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Sekvensene av forover og bakover primere er beskrevet i Tabell 1.

Real-time kvantitativ PCR ble utført på LightCycler®480 hjelp GoTag® qPCR Master Mix (Promega, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Den kvantitative PCR bestod av en innledende grep ved 95 ° C i 10 min, deretter 45 sykluser med 95 ° C i 15 s og 54 ° C i 1 min, med 40 ng templat cDNA og 2 uM av primer som blir anvendt for hver prøve . Signalene fra hver prøve ble normalisert til verdier som ble oppnådd for husholdningsgenet GAPDH, som ble kjørt samtidig med de eksperimentelle prøver. En sammenlignende terskelsyklus (Ct) -metoden (ΔΔCt) ble anvendt for å beregne de relative genekspresjon (endring) mellom test- og referanseprøver [19]. Kontroller uten RT-trinnet eller uten malen ble inkludert for hvert primerpar for å sjekke for eventuelle forurensninger. Som en annen kvalitetskontroll tiltak, ble smelte (dissosiasjon) kurver av PCR-reaksjonene overvåket for å sikre at det var bare en enkelt PCR-produkt og ingen primer dimmere [19]. All målingen var duplikat i hver prøve.

Statistical Analysis

Data ble uttrykt som betyr ± standardavvik (SD) og resultatene ble sammenlignet mellom grupper ved hjelp av khikvadrattest, Fishers eksakte test Student t test eller ikke-parametrisk Mann-Whitney U test, når det passer. Korrelasjoner mellom de to gruppene ble analysert ved hjelp av Spearmans korrelasjonsmetode. Ikke-parametrisk Wilcoxon signert rang tester ble brukt for å sammenligne kontinuerlige data for samme pasient mellom sår og ikke-sår områder. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS for Windows versjon 14.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Alle p
verdier ble tosidige og en verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.

Resultater

Demografiske data

Fra februar 2010 til januar 2012, 55 kvalifisert cirrhose og 55 kvalifiserte ikke-cirrhosepasienter som endoskopisk hadde påvist magesår ble registrert fortløpende. Av de totale 110 enrollees, gjennomsnittsalderen var 60,3 ± 11,8 år (range, 27-86 år). Seksti-ni (62,7%) av pasientene var menn og 41 (37,3%) var kvinner. De demografiske data av alle pasienter er vist i tabell 2. De to gruppene var sammenlignbare med hensyn til kjønn, sår størrelse, hemoglobin, serumkreatinin og infeksjonsrate på H. . Pylori
Men cirrhose gruppen var yngre i alder og hadde lavere blodplatetall og serum albumin enn de av den ikke-cirrhose (p < 0,05). (Tabell 2)

mRNA uttrykk av Proangiogenic vekstfaktorer og deres reseptorer

det var ingen signifikante forskjeller i mRNA uttrykk for proangiogenic vekstfaktorer (VEGF, bFGF, PDGF) og deres reseptorer (VEGFR1, VEGFR2, FGFR1, FGFR2, PDGFRA, PDGFRB) over den ikke -ulcer områder av mageslimhinnen mellom cirrhose og ikke-cirrhose grupper (Tabell 3). Over sår margin på mageslimhinnen, den cirrhose gruppe og ikke-cirrhose gruppe var sammenlignbar for de uttrykk for VEGF, VEGFR1, bFGF, PDGFA, PDGFRA, og PDGFRB (fig. 1). Men cirrhose gruppen hadde lavere mRNA uttrykk for PDGFB, VEGFR2, FGFR1, og FGFR2 enn den ikke-cirrhose gruppe (Fig. 1).

Videre analyser ved hjelp av Wilcoxon signert rang tester ble utført for å sammenligne data for samme pasient mellom ikke-sår og sår margin områder. Det var signifikante økninger i mRNA uttrykk for bFGF og PDGFRB i sår margin områder sammenlignet med ikke-sår områder i både ikke-cirrhose og cirrhosepasienter (tabell 4). Det var ingen signifikante økninger i mRNA uttrykk for VEGF, VEGFR1, PDGFA, og PDGFRA i sår margin områder sammenlignet med ikke-sår områder i både ikke-cirrhose og cirrhosepasienter (tabell 4). Det var signifikante økninger i mRNA uttrykk for VEGFR2, PDGFB, FGFR1, og FGFR2 i sår margin områder sammenlignet med ikke-sår områder (p < 0,05) i den ikke-cirrhose gruppe, men det var ingen signifikante økninger av mRNA uttrykk for PDGFB, VEGFR2, FGFR1, og FGFR2 i sår margin områder sammenlignet med ikke-sår områder i cirrhose gruppe (fig. 2 og tabell 4).

Sammenheng mellom Proangiogenic vekstfaktorer /reseptorer og blodplater Count

mRNA uttrykk for PDGFB, VEGFR2, FGFR1, og FGFR2 i sår margin områder av cirrhosepasienter hadde god korrelasjon med platetall (ρ > 0,5, p. < 0,001, figur 3).

Diskusjoner

Vi fant at cirrhosepasienter hadde redusert mRNA uttrykk for proangiogenic vekstfaktorer (PDGFB) og deres reseptorer (VEGFR2, FGFR1, og FGFR2) i magesår marginer sammenlignet med de av ikke- cirrhosepasienter. Disse redusert uttrykk for PDGFB, VEGFR2, FGFR1, og FGFR2 var godt korrelert med graden av trombocytopeni i cirrhosepasienter. Disse funnene antyder svekket magesår helbredelse i cirrhosepasienter og gi en mulig forklaring på den høyere forekomsten av magesår hos pasienter med cirrhose.

Faktorer som kan påvirke magesår healing inkluderer alder, drikking, røyking, bruk av NSAIDs, aspirin, steroider, klopidogrel, tiklopidin, protonpumpehemmere, histamin reseptor 2 antagonister, misoprostol, status for H. pylori
infeksjon, og ernæringstilstand [20]. Vi ekskluderte pasienter som drakk alkohol, røykte, tok de nevnte medisiner, og de med ustabil sykdomsaktivitet, dårlig allmenntilstand, eller underliggende malignitet ved registrering for å unngå disse konfunderende faktorer. De cirrhosepasienter var yngre i alder, og hadde lavere serum albumin i forhold til de ikke-cirrhosepasienter. Men de var sammenlignbare i serum kreatinin, magesår størrelse, og frekvensen av H. pylori
infeksjon.

PDGF, et glykoprotein, er lagret i blodplater, og frigjøres ved stimulering. PDGF står for omtrent 50% av blodplate-avledet mitogen aktivitet [21], å stimulere proliferasjon av arterielle glatte celler og fibroblaster. PDGF, sammen med bFGF, spiller en viktig rolle i gjenoppbyggingen av bindevev inkludert angiogenese og akselererer sårtilheling [21], [22]. Den god korrelasjon mellom antall blodplater og PDGFB uttrykk antyder at trombocytopeni hos pasienter med cirrhose kan ha en innvirkning på PDGFB sekresjon dermed påvirke magesår helbredelse.

bFGF, ved å aktivere FGFR-ERK signaltransduksjonsbane har blitt vist til en betydelig akselerere sårtilheling via øke tettheten av mikrokar i sårdannelse vevet og fremme epitelcelleproliferasjon [19], [22], [23]. Våre funn viste at mRNA uttrykk av bFGF ble betydelig økt i magesår margin på både cirrhose og ikke-cirrhosepasienter (tabell 4). Men mRNA uttrykk for FGFR1 og FGFR2 ble betydelig redusert i de magesår marginene for cirrhosepasienter forhold til de av de ikke-cirrhosepasienter, og at mRNA uttrykk for FGFR var godt korrelert med platetall hos pasienter med cirrhose. På grunn av den begrensede mengden av mageprøver, kunne vi ikke avklare forholdet mellom bFGF-FGFR-ERK signaltransduksjonsbane, angiogenese og epitelcelleproliferasjon i cirrhosepasienter. Videre studier ved hjelp av en cirrhose rottemodell for å avklare hvilken rolle trombocytopeni i bFGF-FGFR-ERK signalering, angiogenese, og sårtilheling.

Tilstedeværelsen av VEGF mRNA og protein i megakaryocytes gir sterke bevis for at VEGF syntese under trombopoiese er opphavet til blodplate VEGF [24]. VEGF, som er lagret i blodplate-a-granuler, utskilles fra blodplate-aggregering indusert av trombin, kollagen eller adenosindifosfat [25]. VEGF og dens reseptor, VEGFR, akselererer betydelig magesår helbredelse ved å styrke angiogenese inkludert endotelceller spredning, migrasjon, og rør formasjoner på sår stedet [22], [26]. En dyrestudie viste at blodplater akselerert magesår helbredelse gjennom presentasjon av VEGF [27]. Men vår studie viste bare at mRNA uttrykk for VEGFR2 økt betydelig de sår marginer på de ikke-cirrhosepasienter men ikke i cirrhosepasienter som hadde betydelig lavere trombocytter. Verken VEGF eller PDGFA ble forhøyet i magesår margin av cirrhotiske pasienter og ikke-cirrhotiske pasienter i vår studie, som ikke var i samsvar med tidligere studier som viser økt VEGF og PDGF uttrykk under magesår helbredelse både hos mennesker og hos forsøksdyr [11], [ ,,,0],12], [22], [26]. Den mulige forklaringen er at vi bare tok overfladisk (ikke dyp) biopsi med små tang for å få mucosavev av sår margin både i cirrhotiske pasienter og ikke-cirrhotiske pasienter for å unngå post-biopsi blødning i cirrhotiske pasienter i henhold til etisk vurdering.

dette er den første kliniske studien som viser forminsket mRNA uttrykk for proangiogenic vekstfaktorer (PDGFB) og deres reseptorer (VEGFR2, FGFR1, og FGFR2) i magesår marginer cirrhosepasienter, og at disse redusert uttrykk ble godt korrelert med lavere antall blodplater i disse pasientene. Blodplater er viktig ved sårtilheling [12]. Trombocytopeni rotter har vist seg å utvise forsinket magesår helbredelse sammenlignet med friske rotter [28]. Dette forsinket sårtilheling kan bli reversert ved blodplatetransfusjoner fra friske rotter, og økning av antall sirkulerende blodplater i rottene forbedret magesår helbredelse gjennom administrering av thrombopoeitin [27], [28].

Uventet, redusert ekspresjon av VEGF og PDGFA-proangiogenic vekstfaktorer ikke ble funnet, mens redusert uttrykk for VEGFR2, FGFR1 og FGFR2 -proangiogenic vekstfaktorer reseptorer ble notert. Alle cirrhotiske pasienter vi som deltok i denne studien hadde historie esophageal variceal blødning og hadde fått variceal ligation og regelmessig oppfølging, noe som innebærer at de har mer alvorlig portal hypertensjon. Det er sannsynlig at pasienter med et lavere antall blodplater hadde mer alvorlig portal hypertensjon og at de vaskulære derangements sekundært til portal hypertensjon fører til redusert uttrykk av reseptorer for proangiogenic faktorer som FGFR1, FGFR2, og VEGFR2. Derfor er videre studier ved hjelp av forsøksdyr for å avklare saken.

Det er flere begrensninger i denne studien. Først, selv om den gjennomsnittlige sår størrelsen var sammenlignbare i begge gruppene, prøvetaking skjevhet (biopsier fra magesår marginer) kunne ikke unngås. For det andre var det et begrenset antall av mageprøver fra hvert fag for å avklare forholdet mellom uttrykk for proangiogenic vekstfaktorer, deres reseptorer, signaloverføringsveier for angiogenese og celleproliferasjon ved hjelp av Western blotting eller andre metoder. For det tredje, sårtilheling og ekspresjon av vekstfaktorer er dynamiske. Det er derfor umulig og uetisk å imitere dyrestudier [28] og vurdere endringer i proangiogenic vekstfaktorer, deres reseptorer og mekanismer for helbredelsesprosessen etter transfusjon av blodplater i cirrhosepasienter eller etter uttømming av blodplater i ikke-cirrhosepasienter.

Konklusjon

patogenesen av PUD i cirrhosepasienter er kompleks, og mekanismer som involverer forsinket sårtilheling kan være en viktig grunn. Vi fant ut at forminskede mRNA uttrykk for proangiogenic vekstfaktorer (PDGFB) og deres reseptorer (VEGFR2, FGFR1, og FGFR2) i magesår marginene var godt korrelert med graden av trombocytopeni i cirrhosepasienter. Disse funnene antydet at redusert aktivitet av proangiogenic faktorer og deres reseptorer kan bidra til patogenesen av magesår hos pasienter med cirrhose.

Takk

Forfatterne uttrykke sin takknemlighet til fru Pui-Ching Lee ( Institutt for indremedisin, Taipei Veterans General Hospital) for hennes hjelp i den statistiske konsultasjon og figur redigering.

• PLoS ONE: Impact of PSCA Variasjon på magesår Susceptibility
• PLoS ONE: Metabolomics kombinert med multivariat data og Pathway Analysis på Potensielle Biomarkører i magesår og intervensjonseffekter av Corydalis yanhusuo Alkaloid