PLoS ONE: De Verminderd Expressie van pro-angiogene groeifactoren en hun receptoren in de maag Zweren van Cirrotische Patients

De abstracte

Doelstellingen

De pathogenese van het vaker voorkomen van maagzweren bij patiënten met cirrose is complex. Bloedplaatjes kunnen angiogenese stimuleren en te bevorderen maagzweer genezing. We vergeleken de uitingen van pro-angiogene groeifactoren en hun receptoren in de maagzweer marge tussen cirrotische patiënten met trombocytopenie en die van niet-cirrotische patiënten om mogelijke mechanismen op te helderen.

Methods

In aanmerking komende patiënten met cirrose ( n = 55) en niet-cirrotische patiënten (n = 55) die zo maagzweren ingeschreven. Slijmvlies van de maagzweer marge en niet-ulcus gebieden werden opgevangen en het mRNA uitdrukking van de pro-angiogene groeifactoren (vasculaire endotheliale groeifactor [VEGF], van bloedplaatjes afgeleide groeifactor [PDGF], basische fibroblast groeifactor [bFGF]) en hun receptoren (VEGFR1, VEGFR2, PDGFRA, PDGFRB, FGFR1, FGFR2) werden gemeten en vergeleken. Het aantal bloedplaatjes en de uitingen van deze groeifactoren en hun receptoren werden gecorreleerd met elkaar.

Resultaten

De twee groepen waren vergelijkbaar met betrekking tot geslacht, ulcus grootte en de besmettingsgraad van . helicobacter pylori
de cirrotische groep jonger in leeftijd, een lagere aantal bloedplaatjes dan in de niet-cirrotische groep (p < 0,05). De cirrotische patiënten hadden mRNA blijken van PDGFB, VEGFR2, FGFR1, FGFR2 en in maagzweer marge verminderd in vergelijking met die van de niet-cirrotische patiënten (p < 0,05). Verminderde uitingen van PDGFB en VEGFR2, FGFR1 en FGFR2 waren goed gecorreleerd met de mate van trombocytopenie bij deze patiënten met cirrose (ρ > 0,5, p < 0,001).

Conclusies

Onze bevindingen gesuggereerd dat verminderde activiteit van pro-angiogene factoren en hun receptoren kunnen bijdragen aan de pathogenese van maagzweren bij patiënten met cirrose

Citation:. Luo JC, Peng YL, Hou MC, Huang KW, Huang HC, Wang YW, et al. (2013) De Verminderde Expressie van pro-angiogene groeifactoren en hun receptoren in de maag Zweren van cirrotische patiënten. PLoS ONE 8 (4): e61426. doi: 10.1371 /journal.pone.0061426

Editor: Matias A. Avila, Universiteit van Navarra School of Medicine en het Centrum voor Toegepaste Medisch Onderzoek (CIMA), Spanje |

Ontvangen: 24 december 2012; Aanvaard: 9 maart 2013; Gepubliceerd: 19 april 2013

Copyright: © 2013 Luo et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. De huidige studie werd ondersteund door subsidies voor onderzoek van de Taipei Veterans General Hospital (V101-028 en V102C-006). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Eerdere studies hebben aangetoond dat cirrotische patiënten een hogere prevalentie van maagzweer (PUD) dan de algemene populatie [1], [2]. Recente grote basis van de bevolking cohort studies uit Taiwan hebben aangetoond dat bij patiënten met cirrose hebben een hoger risico op het ontwikkelen van een maagzweer bloeden (PUB) en ulcus recidiefbloedingen [3], [4]. De pathogenese van de hogere incidentie van PUD bij patiënten met cirrose is complex en multi-faculteit. Theoretisch, portale hypertensie betreft waarbij splanchnische congestie, verminderde herstelprocessen van gastro-duodenale mucosa en maag microvasculaire afwijkingen veroorzaken [5], [6], die leiden tot verhoogde gevoeligheid voor zuur en pepsine. Ook is aangetoond dat een cirrose voorwaarde leidt tot verminderde gastrische mucosale afweer /repareren mechanismen in ondermeer bicarbonaat en mucus secretie, verminderde endogene prostaglandinesynthese, maagslijmvlies bloedstroom en verminderde mucosale oxygenatie [7], [8], [9 ].

Ulcer formatie is een dynamische onbalans tussen agressief mucosale factoren en defensieve /repareren factoren. Wanneer deze defensieve en helende factoren zijn minder dan de agressieve factoren, mucosale letsels verergeren en zweren te ontwikkelen [10]. Angiogenese is een cruciaal proces in maagzweer genezing [11]. Verscheidene pro-angiogene factoren worden opgeslagen in bloedplaatjes, omvattende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) en van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) [12]. Deze groeifactoren vrijkomen in de zweer basis van bloedplaatjes en het activeren en het bevorderen van de vorming van nieuwe bloedvaten in de hemostase fase van de genezing van ulcera [13]. Dit is waarschijnlijk verantwoordelijk voor het vermogen van bloedplaatjes om angiogenese te stimuleren en maagzweren genezing [12], [14]. Trombocytopenie wordt meestal gezien bij patiënten met cirrose vanwege milt bloedplaatjes sequestratie en een verlaging van het niveau en de activiteit van trombopoietine [15].

In deze studie vergeleken we de uitingen van pro-angiogene groeifactoren (VEGF, PDGF, bFGF ) en hun receptoren (VEGFR1, VEGFR2, PDGFRA, PDGFRB, FGFR1, FGFR2) over de maagzweer marge tussen cirrotische patiënten met trombocytopenie en die van niet-cirrotische patiënten zonder trombocytopenie. Daarnaast onderzochten we de rol van pro-angiogene factoren en hun receptoren in maagzweer genezing bij patiënten met cirrose.

Materialen en methoden

Patiënten Inschrijven

Cirrotische en non-cirrotische patiënten gediagnosticeerd met maagzweren aangetoond door video gastroscopie (EGD) (Olympus GIF-XQ260 gastro-intestinale videoscope, Aizo Olympus, Fukushima, Japan) waren achtereenvolgens ingeschreven. De diagnose van levercirrose in deze studie was gebaseerd op kenmerkende bevindingen, zoals fysieke stigmata van cirrose, CT of ultrasound bevindingen van een nodulaire leveroppervlak, grover echogeniciteit van leverparenchym, een vergrote milt en de detectie van oesofageale varices door endoscopie [ ,,,0],16]. Uitsluitingscriteria opgenomen degenen die aspirine, niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's), clopidogrel, ticlopidine, steroïden, protonpompremmers, histamine receptor 2-antagonisten, misoprostol of sorafenib, en degenen die alcohol gedronken of gerookt, had trombocytopenie (trombocyten < 30.000 /mm ^{3), leverkanker of andere maligniteit, waaronder kwaadaardige zweren, actieve zweren met bloeden, een voorgeschiedenis van maag-chirurgie, neiging tot bloeden, uremie, onstabiele ziekte-activiteit, of een slechte algemene toestand [17]. Deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Committee van Taipei Veterans General Hospital (TVGHIRB: 98-12-04) en werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Verklaring van Helsinki. Alle patiënten gaven schriftelijk toestemming voor deelname aan dit onderzoek in de veronderstelling dat ze maagzweren tijdens EGD.}

Metingen

De patiënten 'medische en persoonlijke geschiedenissen beoordeeld werden, en laboratoriumgegevens waaronder bloedplaatjes tellen, serumalbumine, hemoglobine en creatinine werden geregistreerd. Tijdens de EGD procedure werd de grootte van de maagzweren gemeten met geijkte biopsietang [18] en mucosale weefsel van de ulcerrand werd als standaardprocedure voor histologische onderzoeken maligniteit sluiten en detecteren Helicobacter pylori (H. pylori)
infectie (Giemsa stain) [17], [18]. Slijmvlies (in totaal ongeveer 15 mg, twee stukken monsters) vanaf het ulcerrand en non-ulcus gebieden (antrum) is respectievelijk genomen via endoscopische biopsie en onmiddellijk bevroren in vloeibare stikstof en vervolgens bij -80 ° C tot verdere analyse opgeslagen. Zweren werden gedefinieerd als mucosale weg ≥3 mm [17], [18]. Alle procedures werden uitgevoerd endoscopie en gekopieerd door twee senior endoscopisten (Luo en Hou) en de diagnose van maagzweer werd bevestigd door twee andere endoscopists die blind waren de klinische toestand van de patiënten.

Isolatie van mRNA en real-time PCR

het totale RNA werd uit maagslijmvlies geëxtraheerd middels 500 pl TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) volgens het protocol van de fabrikant. Het RNA werd verder gezuiverd met 100 pl chloroform behandeld en vervolgens geprecipiteerd middels 250 pl isopropanol voordat de complementaire DNA-synthese. De genomische DNA verontreinigd het geëxtraheerde RNA werd vernietigd met behulp DNaseI (Invitrogen, USA) bij kamertemperatuur gedurende 15 min. De kwaliteit van het geïsoleerde RNA werd gecontroleerd door elektroforese op 1,0% agarose-formaldehyde gel en de hoeveelheid is bepaald door de absorptie bij golflengten van 260- en 280-nm. De enkelstrengs complementair DNA werd gesynthetiseerd onder toepassing GoScript ™ Reverse Transcriptase (Promega, USA) en oligo dT primer [19].

De genexpressies van VEGF, VEGFR1, VEGFR2, PDGFA, PDGFB, PDGFRA kwantificeren PDGFRB, bFGF, FGFR1, FGFR2, kwantitatieve real-time polymerase kettingreacties (PCR) werden uitgevoerd met een LightCycler®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). De sequenties van de voorwaartse en reverse primers worden beschreven in tabel 1.

Real-time kwantitatieve PCR werd uitgevoerd op de LightCycler®480 behulp GoTag® qPCR Master Mix (Promega, USA) volgens de instructies van de fabrikant. De kwantitatieve PCR bestond uit een initiële houden bij 95 ° C gedurende 10 min, vervolgens 45 cycli van 95 ° C gedurende 15 s en 54 ° C gedurende 1 min, met 40 ng template cDNA en 2 uM primer wordt gebruikt voor elk monster . De signalen van elk monster werden genormaliseerd naar waarden voor huishoud-gen GAPDH, die gelijktijdig werd uitgevoerd met de experimentele monsters. Werkwijze vergelijkend drempelcyclus (Ct) (ΔΔCt) werd gebruikt om de relatieve genexpressies (fold change) tussen test- en referentiemonsters [19] te berekenen. Controles zonder de RT stap of zonder template werden voor elk primerpaar om te controleren of verontreinigingen. Als een andere manier van kwaliteitscontrole, werden het smelten (dissociatie) curves PCR reacties erop worden toegezien dat er slechts één PCR product en geen primer dimmers [19]. Alle metingen was tweevoud in elk monster.

Statistische analyse

De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelden ± standaardafwijking (SD) en de resultaten werden vergeleken tussen groepen met de chikwadraattoets, Fisher's exact test , Student's t-test, of niet-parametrische Mann-Whitney U test waar nodig. Correlaties tussen de twee groepen werden geanalyseerd met Spearman correlatie methode. Niet-parametrische Wilcoxon signed rank test werd gebruikt voor continue gegevens vergelijken dezelfde patiënt tussen pepticum en non-ulcus gebieden. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS voor Windows versie 14.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Alle p
waarden werden tweezijdige en een waarde van minder dan 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

Demografische gegevens

Van februari 2010 tot januari 2012, 55 in aanmerking cirrose en 55 in aanmerking komende non-cirrotische patiënten die endoscopisch had bewezen maagzweren werden achtereenvolgens ingeschreven. Van de in totaal 110 ingeschreven, de gemiddelde leeftijd was 60,3 ± 11,8 jaar (range, 27-86 jaar). Negenenzestig (62,7%) van de patiënten waren mannen en 41 (37,3%) waren vrouwen. De demografische gegevens van patiënten worden weergegeven in Tabel 2. De twee groepen vergelijkbaar naar geslacht, omvang van de zweer, hemoglobine, serum creatinine en infectiepercentage van H waren. . Pylori
De cirrotische groep werden jongere leeftijd en hadden lagere aantal bloedplaatjes en serum albumine dan die van de niet-cirrotische groep (p < 0,05). (Tabel 2)

mRNA blijken van pro-angiogene groeifactoren en hun receptoren

Er waren geen significante verschillen in de mRNA-uitdrukking van pro-angiogene groeifactoren (VEGF, bFGF, PDGF) en hun receptoren (VEGFR1, VEGFR2, FGFR1, FGFR2, PDGFRA, PDGFRB) via non -ulcer gebieden maagslijmvlies tussen cirrose en non-cirrotische groepen (Tabel 3). Over de zweer marge van het maagslijmvlies, de cirrose groep en niet-cirrose groep waren vergelijkbaar in de uitingen van VEGF, VEGFR1, bFGF, PDGFA, PDGFRA en PDGFRB (afb. 1). De cirrotische lager lag mRNA blijken van PDGFB, VEGFR2, FGFR1, FGFR2 en dan de niet-cirrotische groep (fig. 1).

Verdere analyse met behulp Wilcoxon signed rank test werd uitgevoerd om gegevens voor het vergelijken dezelfde patiënt tussen niet-ulcus en ulcus marge gebieden. Er waren significante verhogingen in de mRNA uitingen van bFGF en PDGFRB in de zweer margegebieden vergeleken met de niet-zweer gebieden in zowel het niet-cirrotische en cirrotische patiënten (tabel 4). Er waren geen significante verhogingen in de mRNA blijken van VEGF, VEGFR1, PDGFA en PDGFRA in de zweer margegebieden vergeleken met de niet-zweer gebieden in zowel het niet-cirrotische en cirrotische patiënten (tabel 4). Er waren significante verhogingen in de mRNA uitingen van VEGFR2, PDGFB, FGFR1 en FGFR2 in de zweer margegebieden vergeleken met de niet-zweer gebieden (p < 0,05) in de niet-cirrotische groep, maar er waren geen significante verhogingen van de mRNA uitingen van PDGFB, VEGFR2, FGFR1, FGFR2 en in de zweer margegebieden vergeleken met de niet-zweer gebieden in de cirrotische groep (fig. 2 en tabel 4).

Correlatie tussen pro-angiogene groeifactoren /receptoren en bloedplaatjes Count

het mRNA uitingen van PDGFB, VEGFR2, FGFR1 en FGFR2 in de zweer marge gebieden van de patiënten met cirrose had een goede correlatie met het aantal bloedplaatjes (ρ > 0,5, p. < 0,001, figuur 3).

Discussie

Wij vonden dat cirrotische patiënten mRNA uitdrukking van pro-angiogene groeifactoren (PDGFB) en hun receptoren (VEGFR2, FGFR1, FGFR2 en) in gastrische ulcus vergeleken met die van de niet afgevallen cirrotische patiënten. Deze verminderde uitingen van PDGFB, VEGFR2, FGFR1 en FGFR2 waren goed gecorreleerd met de mate van trombocytopenie bij de patiënten met cirrose. Deze bevindingen impliceren gestoorde maagzweer genezing bij patiënten met cirrose en een mogelijke verklaring voor de hogere voorkomen van maagzweren bij patiënten met cirrose.

Factoren die maagzweer genezing kunnen beïnvloeden zijn: leeftijd, drinken, roken, gebruik van NSAID's, aspirine, steroïden, clopidogrel, ticlopidine, protonpompremmers, histamine receptor 2-antagonisten, misoprostol, de status van de H. pylori
infectie en voedingstoestand [20]. We uitgesloten patiënten die alcohol gedronken, gerookt, nam de eerder genoemde medicijnen, en mensen met een onstabiele ziekte-activiteit, slechte algemene conditie, of de onderliggende maligniteiten tijdens de inschrijving voor deze verstorende factoren te vermijden. De cirrotische patiënten jonger in leeftijd en hadden lagere serumalbumine vergeleken met de niet-cirrotische patiënten. Echter, ze waren vergelijkbaar in serumcreatinine, maagzweer omvang en het tempo van de H.
pylori infectie.

PDGF, een glycoproteïne, wordt opgeslagen in bloedplaatjes en wordt vrijgegeven na stimulatie. PDGF vertegenwoordigt ongeveer 50% van bloedplaatjes afgeleide mitogene activiteit [21], het stimuleren van de proliferatie van arteriële gladde cellen en fibroblasten. PDGF, samen met bFGF, speelt een belangrijke rol bij het herstel van bindweefsel zoals angiogenese en versnelt de genezing van ulcera [21], [22]. De goede correlatie tussen bloedplaatjes en PDGFB expressie suggereert dat trombocytopenie bij patiënten met cirrose gevolgen voor PDGFB secretie hebben daardoor maagzweer genezing beïnvloeden.

bFGF, door het activeren van FGFR-ERK signaaltransductieweg, is aangetoond dat een aanzienlijke versnellen de genezing van maagzweren via het verhogen van de dichtheid van bloedvaten in het weefsel en zwerende bevorderen epitheelcelproliferatie [19], [22], [23]. Onze resultaten toonden dat mRNA blijken van bFGF aanzienlijk maagzweer marge van zowel cirrose en non-cirrotische patiënten (tabel 4) werden verhoogd. Echter, mRNA blijken van FGFR1 en FGFR2 waren significant verminderd bij maagzweer marge van de cirrotische patiënten vergeleken met die van de niet-cirrotische patiënten, en dat de mRNA expressie van FGFR was goed gecorreleerd met het aantal bloedplaatjes bij patiënten met cirrose. Vanwege de beperkte hoeveelheid maag monsters konden we de relatie tussen de bFGF-FGFR-ERK signaaltransductieweg, angiogenese en epitheliale celproliferatie in cirrotische patiënten verduidelijken. Verdere studies met een cirrose ratmodel nodig om de rol van trombocytopenie in bFGF-FGFR-ERK signalerende, angiogenese en genezing van de zweer te verduidelijken.

De aanwezigheid van VEGF mRNA en eiwit in megakaryocyten sterk bewijs dat VEGF synthese tijdens thrombopoiesis is de oorsprong van bloedplaatjes VEGF [24]. VEGF, die wordt opgeslagen in bloedplaatjes α-granules wordt uitgescheiden door bloedplaatjesaggregatie geïnduceerd door trombine, collageen of adenosine difosfaat [25]. VEGF en zijn receptor, VEGFR, versnelt aanzienlijk maagzweer genezing door verbetering angiogenese waaronder endotheliale celproliferatie, migratie en buis formaties op de ulcer [22], [26]. Een dier studie toonde aan dat bloedplaatjes versnelde maagzweer genezing door de presentatie van VEGF [27]. Echter, ons onderzoek toonde slechts de mRNA expressie van VEGFR2 in cirrotische patiënten significant lager bloedplaatjes significant in de ulcus van de niet-cirrotische patiënten, maar niet worden verhoogd. Noch VEGF noch PDGFA werd verhoogd in maagzweer marge van de levercirrose en niet- levercirrose in onze studie, die niet in overeenstemming met eerdere studies met een toename van VEGF en PDGF expressie tijdens maagzweer genezing zowel bij mensen als bij proefdieren [11] was [ ,,,0],12], [22], [26]. De mogelijke verklaring is dat we net hebben oppervlakkig (niet diep) biopsie met kleine tang om slijmvlies weefsel van ulcus marge zowel in patiënten met cirrose en niet-patiënten met cirrose post-biopsie bloeden in levercirrose onder ethische overweging te voorkomen krijgen.

dit is de eerste klinische studie verminderde mRNA uitdrukking van pro-angiogene groeifactoren (PDGFB) en hun receptoren (VEGFR2, FGFR1 en FGFR2) in maagzweer marge van cirrotische patiënten toont, en dat deze verminderde uitdrukkingen waren goed gecorreleerd met een lagere aantal bloedplaatjes in deze patiënten. Bloedplaatjes zijn belangrijk bij de genezing van ulcera [12]. Trombocytopenische ratten is aangetoond dat vertraagde genezing maagzweer vertonen in vergelijking met gezonde ratten [28]. Deze vertraagde genezing van maagzweren kan worden omgekeerd door bloedplaatjes transfusies van gezonde ratten, en het aantal circulerende bloedplaatjes in ratten verbeterde maagzweer helen door toediening van thrombopoeitin [27], [28].

Onverwacht, verminderde expressie van VEGF en PDGFA-pro-angiogene groeifactoren werd niet gevonden, terwijl verminderde expressie van VEGFR2, FGFR1 en FGFR2 -proangiogenic groeifactoren receptoren werd opgemerkt. Alle patiënten met cirrose we deelnamen aan deze studie had geschiedenis van oesofageale variceal bloeden en had variceal ligatie en regelmatige follow-up, wat betekent dat ze meer ernstige portal hypertensie ontvangen. Het is waarschijnlijk dat patiënten met een lager aantal bloedplaatjes hadden ernstiger portale hypertensie en dat het vasculaire verstoringen secundaire hypertensie leiden portaal de verminderde expressie van de receptoren voor pro-angiogene factoren zoals FGFR1, FGFR2 en VEGFR2. Daarom is verder onderzoek met behulp van proefdieren nodig zijn om het probleem te verduidelijken.

Er zijn een aantal beperkingen aan de huidige studie. Ten eerste, hoewel de gemiddelde omvang van de zweer was vergelijkbaar in beide groepen, steekproefvertekening (biopten van maagzweer margins) kon niet worden vermeden. Ten tweede zijn er een beperkt aantal monsters van elke maag onder de verhoudingen tussen de uitingen van pro-angiogene groeifactoren, hun receptoren, signaaltransductiewegen voor angiogenese en celproliferatie met behulp van Western blotting of andere methoden verduidelijken. Ten derde, genezing van ulcera en de expressie van groeifactoren zijn dynamisch. Het is dus onmogelijk en onethisch dierstudies [28] imiteren en wijzigingen in pro-angiogene groeifactoren, hun receptoren, en mechanismen van het genezingsproces na transfusie van bloedplaatjes in cirrotische patiënten of na uitputting van bloedplaatjes in non-cirrotische patiënten evalueren.

Conclusie

De pathogenese van PUD bij patiënten met cirrose is complex, en mechanismen met betrekking tot vertraagde genezing van ulcera kan een belangrijke reden zijn. We vonden dat verminderde mRNA uitingen van pro-angiogene groeifactoren (PDGFB) en hun receptoren (VEGFR2, FGFR1 en FGFR2) in maagzweer marges waren goed gecorreleerd met de mate van trombocytopenie bij de patiënten met cirrose. Deze bevindingen gesuggereerd dat verminderde activiteit van pro-angiogene factoren en hun receptoren kan bijdragen aan het ontstaan ​​van maagzweren bij patiënten met cirrose.

Dankwoord

De auteurs uiten hun dankbaarheid aan mevrouw Pui-Ching Lee ( Department of Medicine, Taipei Veterans General Hospital) voor haar hulp bij de statistische consultatie en figuur bewerken.

• PLoS ONE: Invloed van PSCA Variatie op maagzweer Susceptibility
• PLoS ONE: Metabolomics In combinatie met multivariate data en Pathway analyse over de Potentiële Biomarkers in maagzweer en Interventie Effecten van Corydalis yanhusuo Alkaloid