PLoS ONE: L'espressione diminuita di fattori di crescita pro-angiogenici e dei loro recettori in ulcere gastriche di pazienti cirrotici

Astratto

Obiettivi

La patogenesi della maggiore insorgenza di ulcera peptica in pazienti cirrotici è complessa. Le piastrine possono stimolare l'angiogenesi e promuovere la guarigione delle ulcere gastriche. Abbiamo confrontato le espressioni di fattori di crescita pro-angiogenici e dei loro recettori a margine ulcera gastrica tra i pazienti cirrotici con piastrinopenia e quelli dei pazienti non cirrotici per chiarire i possibili meccanismi.

Metodi

pazienti cirrotici ammissibili ( n = 55) e pazienti non cirrotici (n = 55) che hanno avuto ulcere gastriche sono stati arruolati. Mucosa dalle aree di margine dell'ulcera e non ulcera gastrica sono stati campionati e le espressioni mRNA dei fattori di crescita pro-angiogenici (fattore di crescita vascolare endoteliale [VEGF], piastrinica fattore di crescita derivato [PDGF], fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti [bFGF]) e dei loro recettori (VEGFR1, VEGFR2, PDGFRA, PDGFRB, FGFR1, FGFR2) sono stati misurati e confrontati. La conta piastrinica e le espressioni di questi fattori di crescita e dei loro recettori sono stati correlati con l'altro.

Risultati

I due gruppi erano paragonabili in termini di genere, dimensioni dell'ulcera e tasso di infezione di . Helicobacter pylori
Tuttavia, il gruppo cirrotico erano più giovani di età, aveva una conta piastrinica inferiore rispetto a quelli del gruppo non cirrotici (p < 0,05). I pazienti cirrotici diminuite mRNA espressioni di PDGFB, VEGFR2, FGFR1 e FGFR2 in margine dell'ulcera gastrica rispetto a quelli dei pazienti non cirrotici (p < 0,05). espressioni diminuita PDGFB e VEGFR2, FGFR1 e FGFR2 erano ben correlata con il grado di trombocitopenia in questi pazienti cirrotici (ρ > 0,5, p < 0,001).

Conclusioni

I nostri risultati implicava che diminuita attività di fattori pro-angiogenici e dei loro recettori possono contribuire alla patogenesi delle ulcere gastriche in pazienti cirrotici

Visto:. Luo JC, Peng YL, Hou MC, Huang KW, Huang HC, Wang YW, et al. (2013) L'espressione diminuita di fattori di crescita pro-angiogenici e dei loro recettori in ulcere gastriche di pazienti cirrotici. PLoS ONE 8 (4): e61426. doi: 10.1371 /journal.pone.0061426

Editor: Matias A. Avila, Università di Navarra Facoltà di Medicina e Centro per la Ricerca Medica Applicata (CIMA), Spagna

Ricevuto: December 24, 2012; Accettato: 9 marzo 2013; Pubblicato: 19 Aprile 2013

Copyright: © 2013 Luo et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. L'attuale studio è stato sostenuto da borse di ricerca dall'Ospedale Taipei Veterans General (V101-028 e V102C-006). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

precedenti studi hanno dimostrato che i pazienti cirrotici hanno una maggiore prevalenza di ulcera peptica (PUD) rispetto alla popolazione generale [1], [2]. Recenti grandi, basati sulla popolazione studi di coorte da Taiwan hanno dimostrato che i pazienti cirrotici hanno un rischio maggiore di sviluppare ulcera peptica sanguinante (PUB) e ulcera risanguinamento [3], [4]. La patogenesi della maggiore incidenza di PUD in pazienti cirrotici è complesso e multi-fattoriale. Teoricamente, ipertensione portale è coinvolto che provoca congestione splancnica, deteriorati processi riparativi della mucosa gastro-duodenale, e anomalie micro-vascolare gastrica [5], [6], i quali portano ad una maggiore suscettibilità ad acido e pepsina. È stato anche dimostrato che una condizione cirrosi porta ad alterazioni della mucosa gastrica difesa /riparazione meccanismi, tra bicarbonato alterata e secrezione di muco, diminuita sintesi endogena prostaglandine, gastrica flusso ematico della mucosa, e diminuita ossigenazione mucosa [7], [8], [9 ].
formazione

ulcera è uno squilibrio dinamico tra fattori aggressivi delle mucose e /fattori di riparazione difensivi. Quando questi fattori difensivi e di guarigione sono di meno che i fattori aggressivi, lesioni della mucosa peggiorano e le ulcere si sviluppano [10]. L'angiogenesi è un processo fondamentale nella guarigione dell'ulcera gastrica [11]. Diversi fattori pro-angiogenici sono memorizzati nelle piastrine, tra cui il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), e il fattore di crescita delle piastrine derivato (PDGF) [12]. Questi fattori di crescita vengono rilasciati nella base dell'ulcera dalle piastrine e attivano e promuovono la formazione di nuovi vasi sanguigni durante la fase di emostasi di guarigione dell'ulcera [13]. Questo rischia di spiegare la capacità delle piastrine di stimolare l'angiogenesi e promuovere la guarigione dell'ulcera gastrica [12], [14]. La trombocitopenia di solito è visto nei pazienti cirrotici a causa della milza sequestro delle piastrine ed una riduzione del livello di attività e di trombopoietina [15].

In questo studio, abbiamo confrontato le espressioni di fattori di crescita pro-angiogenici (VEGF, PDGF, bFGF ) e dei loro recettori (VEGFR1, VEGFR2, PDGFRA, PDGFRB, FGFR1, FGFR2) oltre il margine di ulcera gastrica tra i pazienti cirrotici con piastrinopenia e quelli dei pazienti non cirrotici senza trombocitopenia. Inoltre, abbiamo studiato il ruolo dei fattori pro-angiogenici e dei loro recettori nella guarigione delle ulcere gastriche in pazienti cirrotici.

Materiali e metodi

I pazienti Iscrizione

cirrotici e non cirrotici pazienti con diagnosi di ulcere gastriche, accertato con il video esofagogastroduodenoscopia (EGDS) (Olympus GIF-XQ260 videoscope gastrointestinale, AIZO Olympus, Fukushima, Giappone) sono stati arruolati consecutivamente. La diagnosi di cirrosi epatica in questo studio si è basato sui risultati caratteristici, tra cui stigmate fisico di cirrosi, la tomografia computerizzata o reperti ecografici di una superficie di fegato nodulare, ecogenicità grossolano del parenchima epatico, un ingrossamento della milza, e la rilevazione di varici esofagee mediante endoscopia [ ,,,0],16]. I criteri di esclusione inclusi quelli trattati con aspirina, farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS), clopidogrel, ticlopidina, steroidi, inibitori della pompa protonica, l'istamina recettore 2 antagonisti, misoprostol o sorafenib, e quelli che hanno bevuto alcolici o fumato, trombocitopenia (piastrine < 30.000 /mm ^{3), carcinoma epatocellulare o altri tumori maligni tra cui le ulcere maligne, ulcere con sanguinamento attivo, una storia passata di chirurgia gastrica, tendenza al sanguinamento, uremia, attività della malattia instabile, o cattive condizioni generale [17]. Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale di Taipei Veterans General Hospital (TVGHIRB: 98-12-04) ed è stato condotto in conformità con le linee guida della Dichiarazione di Helsinki. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato prima di partecipare a questo studio in base al presupposto che avevano ulcere gastriche durante EGDS.}

Misure

storie mediche e personali dei pazienti sono stati rivisti, e dati di laboratorio tra cui piastrine contare, albumina sierica, emoglobina, e creatinina sono stati registrati. Durante la procedura EGD, la dimensione dell'ulcera gastrica è stata misurata usando pinze calibrate biopsia [18], e mucosa dal margine dell'ulcera è stato preso come procedura standard per esami istologici per escludere malignità e per rilevare Helicobacter pylori (H. pylori)
infezione (Giemsa) [17], [18]. tessuto mucoso (totalmente circa 15 mg, due pezzi di campioni) dal margine dell'ulcera e zone non ulcerosa (antro) è stata scattata rispettivamente tramite biopsia endoscopica e immediatamente congelati in azoto liquido, quindi conservati a -80 ° C fino ad ulteriore analisi. Ulcere sono stati definiti come le pause della mucosa ≥ 3 mm [17], [18]. Tutte le procedure sono state eseguite endoscopia e fotocopiate da due endoscopists alti (luo e HOU), e la diagnosi di ulcera gastrica è stata confermata da altri due endoscopisti che sono stati accecati per lo stato clinico dei soggetti.

L'isolamento di mRNA e real-time PCR

l'RNA totale è stato estratto da mucosa gastrica con 500 microlitri TRIzol reagente (Invitrogen, Carlsbad, Stati Uniti d'America) secondo il protocollo del produttore. L'RNA è stato ulteriormente purificato usando 100 ml trattamento cloroformio e quindi precipitato con 250 microlitri isopropanolo prima della sintesi di DNA complementare. Il DNA genomico contaminato nel RNA estratto è stato distrutto con DNasiI (Invitrogen, USA) a temperatura ambiente per 15 min. La qualità del RNA isolato è stata verificata mediante elettroforesi su gel di agarosio-formaldeide 1,0%, e la sua quantità è stata determinata misurando la sua assorbanza a lunghezze d'onda di 260- e 280-nm. Il DNA complementare a singolo filamento è stato sintetizzato con GoScript ™ trascrittasi inversa (Promega, USA) e oligo dT fondo [19].

Per quantificare le espressioni geniche di VEGF, VEGFR1, VEGFR2, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, bFGF, FGFR1, FGFR2, reazioni a catena della polimerasi in tempo reale (PCR) quantitativa sono state eseguite utilizzando un LightCycler®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Le sequenze di avanti e indietro primer sono descritti nella tabella 1.

Real-time PCR quantitativa è stata effettuata sulla LightCycler®480 utilizzando GoTag® qPCR Master Mix (Promega, USA) secondo le istruzioni del produttore. La PCR quantitativa consisteva in una presa iniziale a 95 ° C per 10 min, quindi 45 cicli di 95 ° C per 15 s e 54 ° C per 1 min, con 40 ng di cDNA e 2 mM di primer utilizzati per ogni campione . I segnali provenienti da ogni campione sono stati normalizzati ai valori ottenuti per GAPDH gene housekeeping, che è stato eseguito contemporaneamente ai campioni sperimentali. Metodo (ΔΔCt) ciclo soglia comparativa (Ct) è stato utilizzato per calcolare le espressioni geniche relative (fold change) tra i campioni di prova e di riferimento [19]. Controlli senza il passaggio RT o senza il modello sono stati inclusi per ogni coppia di primer per verificare la presenza di eventuali contaminanti. Come un'altra misura di controllo della qualità, la fusione (dissociazione) curve di reazioni di PCR sono stati monitorati per assicurare che c'era solo un singolo prodotto di PCR e senza dimmer di primer [19]. Tutta la misura è stato duplicato in ogni campione.

Analisi statistica

I dati sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD) ed i risultati sono stati confrontati tra i gruppi che utilizzano il test del chi-quadrato, test esatto di Fisher , test t di Student, o non parametrico test di Mann-Whitney U, se del caso. Le correlazioni tra i due gruppi sono stati analizzati utilizzando il metodo di correlazione di Spearman. Non parametrico Wilcoxon test rango sono stati usati per confrontare i dati in continuo per lo stesso paziente tra le ulcere e le aree non ulcerosa. Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando SPSS per Windows versione 14.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Tutto p valori
erano a due code e un valore inferiore a 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

dati demografici

Dal febbraio 2010 a gennaio 2012, 55 cirrotico ammissibili e 55 pazienti non cirrotici idonei che avevano endoscopica provata ulcere gastriche sono stati arruolati consecutivamente. Su un totale di 110 iscritti, l'età media era di 60,3 ± 11,8 anni (range 27-86 anni). Sessantanove (62,7%) pazienti erano maschi e 41 (37,3%) erano di sesso femminile. I dati demografici di tutti i pazienti sono riportati nella tabella 2. I due gruppi erano paragonabili in termini di genere, dimensioni dell'ulcera, emoglobina, creatinina sierica e tasso di infezione di H. . Pylori
Tuttavia, il gruppo cirrotico erano più giovani di età e aveva bassa conta piastrinica e albumina sierica rispetto a quelli del gruppo non cirrotici (p < 0,05). (Tabella 2)

mRNA Espressioni di pro-angiogenici fattori di crescita e dei loro recettori

non ci sono state differenze significative nelle espressioni mRNA di fattori di crescita pro-angiogenici (VEGF, bFGF, PDGF) e dei loro recettori (VEGFR1, VEGFR2, FGFR1, FGFR2, PDGFRA, PDGFRB) sopra la non aree -ulcer di mucosa gastrica tra i gruppi cirrotici e non cirrotici (Tabella 3). Nel corso del margine ulcera della mucosa gastrica, il gruppo cirrotico e il gruppo non cirrotici erano comparabili nelle espressioni di VEGF, VEGFR1, bFGF, PDGFA, PDGFRA, e PDGFRB (Fig. 1). Tuttavia, il gruppo cirrotico ha avuto più bassi espressioni mRNA di PDGFB, VEGFR2, FGFR1 e FGFR2 rispetto al gruppo non-cirrotici (Fig. 1).

Ulteriori analisi utilizzando Wilcoxon test rango è stata eseguita per confrontare i dati per la stesso paziente tra non ulcerosa e le aree di margine dell'ulcera. Ci sono stati un aumento significativo nelle espressioni mRNA di bFGF e PDGFRB nelle aree margine dell'ulcera rispetto alle aree non ulcerosa sia nei pazienti non cirrotici e cirrotici (Tabella 4). Non ci sono stati un aumento significativo nelle espressioni mRNA di VEGF, VEGFR1, PDGFA, e PDGFRA nelle zone margine dell'ulcera rispetto alle aree non ulcerosa sia nei pazienti non cirrotici e cirrotici (Tabella 4). Ci sono stati un aumento significativo nelle espressioni mRNA di VEGFR2, PDGFB, FGFR1 e FGFR2 nelle zone margine dell'ulcera rispetto alle aree non ulcerosa (p < 0,05) nel gruppo non-cirrotici, ma non vi erano quote significative del mRNA espressioni di PDGFB, VEGFR2, FGFR1 e FGFR2 nelle zone margine dell'ulcera rispetto alle aree non ulcera nel gruppo cirrotico (Fig. 2 e Tabella 4).

la correlazione tra fattori di crescita /recettori proangiogenico e delle piastrine conte

le espressioni mRNA di PDGFB, VEGFR2, FGFR1 e FGFR2 nelle aree di margine ulcera dei pazienti cirrotici hanno avuto una buona correlazione con la conta piastrinica (ρ > 0.5, p. < 0,001, Figura 3).

Discussione

Abbiamo trovato che i pazienti cirrotici era diminuita espressione di mRNA di fattori pro-angiogenici crescita (PDGFB) ei loro recettori (VEGFR2, FGFR1 e FGFR2) a margine ulcera gastrica rispetto a quelli della non pazienti cirrotici. Queste espressioni diminuita di PDGFB, VEGFR2, FGFR1 e FGFR2 erano ben correlata con il grado di trombocitopenia nei pazienti cirrotici. Questi risultati implicano alterata guarigione dell'ulcera gastrica in pazienti cirrotici e forniscono una possibile spiegazione per la maggiore presenza di ulcera peptica in pazienti cirrotici.

I fattori che possono influenzare la guarigione delle ulcere gastriche includono l'età, bere, fumare, l'uso di FANS, aspirina, steroidi, clopidogrel, ticlopidina, inibitori della pompa protonica, dei recettori dell'istamina 2 antagonisti, misoprostol, lo stato di H. pylori
infezioni, e la condizione nutrizionale [20]. Sono stati esclusi i pazienti che avevano bevuto alcol, affumicato, preso i farmaci di cui sopra, e quelli con l'attività instabile malattia, cattive condizioni generali, o neoplasie sottostanti durante la registrazione per evitare questi fattori confondenti. I pazienti cirrotici erano più giovani di età, e aveva più bassa albumina sierica rispetto ai pazienti non cirrotici. Tuttavia, essi erano comparabili della creatinina sierica, dimensioni ulcera gastrica, e il tasso di H. pylori
infezione.

PDGF, una glicoproteina, è memorizzato nelle piastrine e viene rilasciato dopo stimolazione. rappresenta PDGF circa il 50% dell'attività mitogenica derivato dalle piastrine [21], stimolando la proliferazione delle cellule e fibroblasti liscia arteriosa. PDGF, insieme con bFGF, svolge un ruolo importante nella ricostruzione del tessuto connettivo tra cui l'angiogenesi e accelera la guarigione dell'ulcera [21], [22]. La buona correlazione tra la conta piastrinica ed espressione PDGFB suggerisce che la trombocitopenia nei pazienti cirrotici possono avere un impatto sulla PDGFB secrezione gastrica influenzando così la guarigione dell'ulcera.

bFGF, attivando il segnale FGFR-ERK via di trasduzione, è stato dimostrato che in modo significativo accelerare la guarigione dell'ulcera attraverso l'aumento della densità dei microvasi nel tessuto ulcerata e promuovere la proliferazione delle cellule epiteliali [19], [22], [23]. I nostri risultati hanno dimostrato che le espressioni mRNA di bFGF erano significativamente aumentati nel margine dell'ulcera gastrica di entrambi i pazienti cirrotici e non cirrotici (Tabella 4). Tuttavia, mRNA espressioni di FGFR1 e FGFR2 erano significativamente diminuita a margine ulcera gastrica dei pazienti cirrotici rispetto a quelli dei pazienti non cirrotici, e che l'espressione di mRNA di FGFR era ben correlata con la conta piastrinica in pazienti cirrotici. A causa della limitata quantità di campioni gastrici, non siamo riusciti a chiarire il rapporto tra il bFGF-FGFR-ERK trasduzione del segnale, l'angiogenesi e la proliferazione delle cellule epiteliali nei pazienti cirrotici. Sono necessari ulteriori studi che utilizzano un modello di ratto cirrotico per chiarire il ruolo della trombocitopenia nella segnalazione bFGF-FGFR-ERK, l'angiogenesi e la guarigione dell'ulcera
.

La presenza di VEGF mRNA e di proteine ​​nei megacariociti fornisce una forte evidenza che la sintesi del VEGF durante trombopoiesi è l'origine di VEGF piastrine [24]. VEGF, che è memorizzato in piastrine alfa-granuli, è secreta da aggregazione piastrinica indotta da trombina, collagene o adenosina difosfato [25]. VEGF e il suo recettore, VEGFR, accelera significativamente la guarigione delle ulcere gastriche, migliorando l'angiogenesi compresa la proliferazione delle cellule endoteliali, la migrazione, e le formazioni tubo nel sito dell'ulcera [22], [26]. Uno studio sugli animali ha dimostrato che le piastrine hanno accelerato cicatrizzazione dell'ulcera gastrica attraverso la presentazione di VEGF [27]. Tuttavia, il nostro studio ha mostrato solo che l'espressione di mRNA di VEGFR2 è aumentato in modo significativo a margine ulcera dei pazienti non cirrotici ma non nei pazienti cirrotici che hanno avuto conta piastrinica significativamente più bassi. Né VEGF né PDGFA è stato elevato a margine dell'ulcera gastrica dei cirrotici e non cirrotici nel nostro studio, che non era in linea con studi precedenti che mostrano un aumento di VEGF e di espressione PDGF durante cicatrizzazione dell'ulcera gastrica sia nell'uomo che negli animali da esperimento [11], [ ,,,0],12], [22], [26]. La spiegazione possibile è che abbiamo appena preso superficiale biopsia (non profondo) con piccole pinze per ottenere tessuti della mucosa del margine dell'ulcera sia nei pazienti cirrotici e non cirrotici per evitare il sanguinamento post-biopsia in pazienti cirrotici in esame etico.

Questo è il primo studio clinico a mostrare espressioni mRNA diminuita di fattori pro-angiogenici crescita (PDGFB) ei loro recettori (VEGFR2, FGFR1 e FGFR2) dei margini ulcera gastrica di pazienti cirrotici, e che queste espressioni diminuiti erano ben correlati con piastrinica inferiore a contare questi pazienti. Le piastrine sono importanti nella guarigione dell'ulcera [12]. ratti trombocitopenica hanno dimostrato di esibire ritardata guarigione delle ulcere gastriche rispetto ai ratti sani [28]. Questa guarigione dell'ulcera ritardato potrebbe essere invertita da trasfusioni di piastrine da ratti sani, e l'aumento del numero delle piastrine circolanti nei ratti ha migliorato la guarigione dell'ulcera gastrica attraverso la somministrazione di thrombopoeitin [27], [28].

Inaspettatamente, espressione diminuita di VEGF e fattori di crescita PDGFA-pro-angiogenici non è stato trovato, mentre l'espressione diminuita VEGFR2, FGFR1 e FGFR2 crescita -proangiogenic fattori di recettori è stato notato. Tutti i pazienti cirrotici stati arruolati in questo studio avevano storia di sanguinamento delle varici esofagee e avevano ricevuto varici legatura e regolare follow-up, il che implica che hanno più grave ipertensione portale. E 'probabile che i pazienti con una conta piastrinica inferiore avevano più grave ipertensione portale e che le alterazioni vascolari secondarie a portale piombo ipertensione alla ridotta espressione dei recettori per i fattori pro-angiogenici come FGFR1, FGFR2, e VEGFR2. Pertanto, sono necessari ulteriori studi su animali sperimentali per chiarire la questione
.

Ci sono diverse limitazioni per il presente studio. In primo luogo, anche se la dimensione media ulcera era paragonabile in entrambi i gruppi, il campionamento di polarizzazione (biopsie da margini di ulcera gastrica) non poteva essere evitato. In secondo luogo, ci sono stati un numero limitato di campioni gastrici provenienti da ogni soggetto a chiarire le relazioni tra le espressioni di fattori di crescita, proangiogenico loro recettori, trasduzione del segnale per l'angiogenesi e la proliferazione cellulare tramite Western blotting o altri metodi. Terzo, la guarigione dell'ulcera e l'espressione dei fattori di crescita sono dinamici. E 'quindi impossibile e immorale da imitare studi su animali [28] e valutare cambiamenti di fattori di crescita pro-angiogenici, loro recettori, e dei meccanismi del processo di guarigione dopo la trasfusione di piastrine in pazienti cirrotici o dopo l'esaurimento delle piastrine nei pazienti non cirrotici.

Conclusione

La patogenesi della PUD nei pazienti cirrotici è complessa, e meccanismi che coinvolgono ritardata guarigione delle ulcere può essere un motivo importante. Abbiamo scoperto che diminuita espressione di mRNA di fattori pro-angiogenici crescita (PDGFB) ei loro recettori (VEGFR2, FGFR1 e FGFR2) a margine ulcera gastrica erano ben correlata con il grado di trombocitopenia nei pazienti cirrotici. Questi risultati hanno suggerito che l'attività diminuita di fattori pro-angiogenici e dei loro recettori possono contribuire alla patogenesi delle ulcere gastriche in pazienti cirrotici.

Riconoscimenti

Gli autori esprimono la loro gratitudine alla signora Pui-Ching Lee ( Dipartimento di Medicina, Taipei Veterans General Hospital) per il suo aiuto nella consultazione statistica e la modifica figura.

• PLoS ONE: Impatto della PSCA Variazione su ulcera gastrica Susceptibility
• PLoS ONE: Metabolomica accoppiato con multivariata dei dati e analisi Pathway sui potenziali biomarcatori nella ulcera gastrica ed effetti di intervento di Corydalis yanhusuo Alkaloid