Interleukine-8 is de meest opgereguleerd gen geheel genoom profilering van H. pylori blootgesteld maagepitheelcellen

Interleukine-8 is de meest up-gereguleerd gen in whole genome profilering van H. pylori
blootgesteld de maag epitheelcellen
Abstracte achtergrond
De associatie tussen Helicobacter pylori
infectie en bovenste gastro-intestinale aandoeningen is goed ingeburgerd. Echter, slechts een klein deel van de H. pylori
dragers ontwikkelen en vaatziekten, en er zijn grote geografische verschillen in de ziekte van penetratie. De verklaring voor dit raadsel ligt in de interactie tussen de bacterie en de gastheer. H. pylori
uitwendig membraan fosfolipase (OMPLA) is gesuggereerd dat een rol speelt in de virulentie van de bacterie. Het doel van deze studie was de belangrijkste cellulaire routes en biologische processen getroffen maagepitheelcellen gedurende 24 h H. pylori
positieprofiel en de ontstekingsreactie op OMPLA bestuderen + en OMPLA -. H. pylori
varianten
Resultaten
Interleukin-8 was de meest significant opgereguleerd gen en lijkt speelde een hoofdrol spelen bij de epitheliale cel respons op H. pylori
infectie en bij pathologische processen die tot maagaandoeningen. MAPK en NF-kappaB cellulaire routes werden krachtig geactiveerd, maar leek niet aan de indrukwekkende IL-8
reactie toe te lichten. Er stond in het teken up-regulatie van TP53BP2
, waarvan de corresponderende eiwit ASPP2 kunnen interageren met H. pylori
CagA en veroorzaken gemarkeerd p53 onderdrukking van apoptose. Andere regulatoren van apoptose toonde ook abberant regelgeving. Bovendien blijken up-regulatie van meerdere oncogenen en down-regulatie van tumorsuppressorgenen al tijdens de eerste 24 uur van infectie. H. pylori
OMPLA faseverandering leek niet de ontstekingsreactie epitheelcellen gen respons in dit experiment beïnvloeden.
Conclusie
In gehele genoom analyse van de epitheliale respons op H. pylori
blootstelling, IL 8
aangetoond dat de meest uitgesproken opregulatie, en is betrokken bij vele van de belangrijkste cellulaire respons processen de infectie. Er was ontregeling van apoptosis, tumorsuppressorgenen en oncogenen al in de eerste 24 uur van H. pylori
infectie, die vroege tekenen van maag tumorigenese kunnen vormen. OMPLA +/- had geen invloed op de acute inflammatoire respons op H. pylori
. Achtergrond
H. pylori
is goed ingeburgerd als de primaire oorzaak van maagzweer ziekte en de initiatiefnemer van de meerdere stappen cascade die leidt tot adenocarcinoom van de maag. Hoewel maagkanker is de vierde meest voorkomende vorm van kanker wereldwijd en de tweede alleen voor longkanker bij het veroorzaken van kanker gerelateerde sterfgevallen [1], zijn er opmerkelijke verschillen in de verdeling van deze ziekte tussen West- en Oost-Europese landen. De daling van maagkanker parallellen H. pylori
prevalentie in de westerse wereld, maar dit verschijnsel niet helemaal de grote geografische verschillen in de maag distributie van kanker uit te leggen. De reden waarom slechts 1-2% van H. pylori
geïnfecteerde individuen ontwikkelen maag maligniteiten blijft onverklaard, en omvat zowel verschillen in bacteriestammen, belangrijker cagA
status gastheer genetica en milieu-aspecten.
H . pylori
carcinogenese gaat om werkzaamheden onder contract van de bacterie door middel van een chronische ontsteking van het maag-corpus slijmvlies en ook directe actie van H. pylori
op epitheelcellen. Persistente ontsteking geassocieerd met verhoogde productie van verscheidene cytokines, zoals IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-7 en IL-8 [2] dat apoptose, hyperproliferatie en productie van reactieve zuurstof en stikstof vergroten species veroorzaakt DNA beschadiging en mutaties. Bovendien, directe actie van H. pylori
op epitheelcellen kan ook het bevorderen van carcinogenese. cagA
+
H. pylori stammen
injecteren bacteriële producten in epitheelcellen door een uitgekiende type IV injectieproces, die intracellulaire signaalroutes activeert, met name de door mitogeen geactiveerde proteïne kinasefamilie (MAPK) pathway [3] en nucleaire factor kappa B (NF-KB), en kunnen vergemakkelijken epitheliale-mesenchymale overgang [4], die alle kunnen bijdragen aan neoplastische transformatie. Verder wordt tumorontwikkeling geassocieerd met proliferatie en apoptose remming [5, 6], terwijl overmatige apoptose wordt gedacht maagzweer vorming bevorderen. Het effect van H. pylori
op de maag epitheliale apoptose is tegenstrijdig bewijsmateriaal toonde. Verschillende in vitro studies hebben aangetoond dat H. pylori
stimuleert apoptose [7, 8], terwijl sommige in vivo studies tonen remming van apoptose [9, 10]. CagA injectie in maagepitheelcellen omhoog-reguleert het anti-apoptotische eiwit MCL [11] en interfereert met apoptose stimulerend eiwit 2 van p53 (ASPP2) [12]. ASPP2 remming veroorzaakt verhoogde afbraak van p53, op dezelfde wijze als DNA tumorvirussen, waardoor apoptotische activiteit afneemt, waarbij het verhoogde risico van GC verbonden aan cagA
+
H. pylori infectie kunnen verklaren
.
Tannæs et al. hebben eerder gemeld dat de H. pylori pldA
gen, dat codeert voor bacteriële buitenste membraan fosfolipase A (OMPLA), toont fase variatie resulteert in 'ON' (OMPLA +) en 'OFF' (OMPLA - ) schakelen van OMPLA activiteit als gevolg van een spontane ontsporing in een homopolymeer (C) kanaal van het gen [13]. De OMPLA + variant werd geassocieerd met een verhoogde overleving van bacteriën in een zure omgeving, hechting, hemolyse en afgifte van urease en VacA vergelijking met de OMPLA - variant [14]. OMPLA is ook betrokken bij de virulentie van andere gastro-intestinale pathogenen [15] en een verbinding tussen OMPLA activiteit maagontsteking is in een eerdere studie [16] heeft.
Hoewel maagepitheel celrespons op H. pylori
belichting is onderworpen aan veel experimenten sinds de ontdekking van de bacterie in 1984 [17], maar enkele studies gebruikt cDNA microarray technologie [18-29]. Bijna al deze experimenten zijn uitgevoerd op de Aziatische H. pylori
stammen, en geen auteurs hebben de epitheliale cel respons op OMPLA + tegen OMPLA vergeleken - bacteriën. Het doel van de huidige studie was om de tijdelijke genexpressie respons van maagepitheelcellen blootgesteld aan een klinisch verkregen H. pylori stam
onderzoeken en de bijdrage van OMPLA op de ontstekingsreactie te onderzoeken. De nadruk is gelegd op de belangrijkste biologische reacties met behulp van Gene Ontology (GO) termen en de bijbehorende cellulaire signaalwegen zetten.
Resultaten
Om de cellulaire morfologie bestuderen na H. pylori
infectie op 3 en 6 uur, non -exposed en H. pylori
blootgestelde cellen werden gekleurd en onderzocht met immunofluorescentie microscopie (figuur 1). Zowel 3 en 6 uur was er geen significant verschil in de capaciteit tussen de OMPLA + en OMPLA - H. pylori
te houden aan AGS cellen, en er waren geen significante verschillen in de morfologische veranderingen de AGS cellen in reactie op blootstelling aan de twee varianten. We waren niet in staat om elke statistisch significante verschillen in de expressie van genen tussen de cellen blootgesteld aan OMPLA identificeren + en OMPLA - varianten op elk tijdstip tijdens de 24 uur van co-cultuur (p
< 0,05). We geconcludeerd dat de analyse van de resultaten kunnen worden uitgevoerd zonder verder onderzoek van verschillen in fase verschillen. Figuur 1 Immunofluorescentie afbeeldingen AGS cellen blootgesteld aan H. pylori. AGS-cellen waren niet belichte, of blootstelling aan OMPLA + en OMPLA- H. pylori
bij een MOI van 300: 1 en co-gekweekt gedurende 3 en 6 uur. De bacteriën werden gekleurd met konijn anti-Helicobacter
antilichaam. Beelden werden gevangen genomen door fluorescentie microscopie. Ondernemingen De cDNA profiel van H. pylori
blootgesteld AGS cellen werden vergeleken met niet-geïnfecteerde controle cellen op zes afzonderlijke tijdstippen binnen 24 uur. 7498 chip probes die overeenkomen met 6237 menselijke genen toonde differentiële expressie in de geïnfecteerde cellen in vergelijking met cellen te controleren op niet minder dan 1 tijdstip (p Restaurant < 0. 05) (Extra file 1: Tabel S1). Het aantal significant differentieel tot expressie gebrachte genen op elk tijdstip in vergelijking met niet-geïnfecteerde AGS-cellen, en hoe ze overlappen op verschillende tijdstippen zijn weergegeven in tabel 1 en figuur 1 2.Table Aantal van differentieel gereguleerde genen
Time

0.5

1

3

6

12

24

Up-gereguleerde
0 2
91
123
1679
2997
stads gereguleerd
0 1
26
65
2034
2492
Totaal
0
3
117
188
3713
5489
Aantal significant verschillend gereguleerde genen (p
<0,05) op elk van de bemonsterings- tijdstippen na een periode van co-incubatie van H. pylori
in AGS cellen
Figuur 2 Venn diagrammen aanzienlijk gereguleerde genen. Venn diagrammen van differentieel tot expressie genen van H. pylori
geïnfecteerde AGS-cellen in vergelijking met cellen te controleren (p Restaurant < 0,05). De snijdende cirkels geven overlappende genen op de aangegeven tijdstippen. AGS = niet-geïnfecteerde controle cellen AGS.
Er werden geen significante expressie gebrachte genen in 0,5 uur een gematigde toename van het aantal genen van 1 tot 6 uur, en een 20-voudige toename 6 tot 24 uur. Vanuit één bemonsteringspunt naar de volgende, meest genen overlappen, maar een groot aantal unieke genen werden differentieel gereguleerd op elk tijdstip (figuur 2). Ongeveer 47% van het totale aantal sterk tot expressie gebrachte genen werden up-gereguleerd, en 53% vertoonden downregulatie vergelijking met de controle. Van de meer dan 6000 aanzienlijk geëxpresseerde genen, IL-8
was de meest differentieel tot expressie gebracht gen (Figuur 3). Figuur 3 Hiarchical clustering van de meest significant differentieel gereguleerde genen. Hiarchical clustering van significant verschillend gereguleerde genen (log2FC > 1.5, blz Restaurant < 0,05). Pijl wijst naar IL-8
. Ondernemingen De lijst van alle belangrijke genen werd geanalyseerd voor de bijbehorende Kyoto Encyclopedie van genen en genomen (KEGG) signaal routes door Pathway Express op elk tijdstip. Aanzienlijk beïnvloed paden en bijbehorende Impact Factor (IF) zijn weergegeven in tabel 2. De vroege respons signaal paden die aanzienlijk getroffen werden opgenomen de epitheliale cell signaling in H. pylori
infectie route, cytokine-cytokine receptor interactie, Toll-like receptor ( TLR) signaalroutes en vele kanker-gerelateerde routes en immunologische pathways. Op 1 uur, werd IL-8
betrokken bij de meeste betrokken signaalpaden. Op 3 en 6 uur, de meeste van de hoogst paden had verschillende genen gemeen, zoals NFKB1, NFKB2, NFKBIA, NFKBIE, BIRC2, BIRC3, JUND, CCND1 Kopen en Akt3
. Fosfatidylinositol signaleringssysteem wordt toegewezen een hoge IF 6 uur door de betekenis van een enkel gen, PIK3C2B
, die neerwaarts gereguleerd door een log 2FC van -0,58 en speelt een sleutelrol bij deze route. Bij 12 uur, het meest getroffen cellulaire routes daarna de migratie van leukocyten, celadhesiemoleculen, DNA replicatie route, p53 signaalweg alsmede diverse kankergerelateerde trajecten. Relatief vergelijkbare resultaten worden gezien bij 24 uur, maar sommige van de kanker-gerelateerde routes verder weergegeven in de lijst (gegevens niet getoond, maar boven 10 getoond in Tabel 2) .table 2 tijdsverloop: KEGG cellulaire responsen en gen ontologie
Tijd
KEGG cellulaire pathway naam
IF
GO up-gereguleerde genen

GO down-gereguleerde genen
0.5 verhuur No significant genen verhuur No significant genen verhuur No significant genen 1
epitheliale cell signaling in Helicobacter pylori-infectie
16,6
Geen significante GO verhuur No significant genen
cytokine-cytokine receptor interactie
8.1
Blaaskanker
7.5
Toll-like receptor signaleringsroute
6.6
Base uitsnijding reparatie
6,0
Primaire immunodeficiëntie
5,9
Pathways in kanker
5.4
3
epitheliale cell signaling in Helicobacter pylori-infectie
17,8
anti-apoptose
Geen significante GO
Pathways in kanker
16,9
regulering van retrovirale genoom
kleincellige longkanker
14,2
replicatie
MAPK signaalroute
14,2
T -helper 1 celdifferentiatie
apoptose
12.5
negatieve regulatie van LPS-gemedieerde signaalweg
Adipocytokine signaleringsroute
12,3
negatieve regulatie van migratie van gladde spiercellen
Prostaatkanker
11.4
regulering van MAP kinase-activiteit chemotaxis
Toll-like receptor signaleringsroute
11.1
eiwit aminozuur defosforylatie
T-cel-receptor signaleringsroute
10.5
neutrofielen activering
B-cel receptor signaleringsroute
9,9
meevoeren van circadiane klok
6
Fosfatidylinositol signaleringssysteem
32,2
anti-apoptose verhuur No significant GO
Epitheliale cell signaling in Helicobacter pylori-infectie
15,5
regulering van retrovirale genoom
kleincellige longkanker
14,2
replicatie
Pathways in kanker
12.4
T-helper 1 celdifferentiatie
Apoptosis
11,6
neutrofielen activering
Adipocytokine signaleringsroute
10.1
negatieve regulatie van I-kappaB
Toll-like receptor signaleringsroute
8.9
kinase /NF -KB cascade
MAPK signaalroute
8,7
inductie van positieve chemotaxis
Blaaskanker
8.5
myeloïde dendritische celdifferentiatie
B-cel receptor signaleringsroute
8.3
12
de migratie van leukocyten
309,7
celcyclus
reactie op ongevouwen eiwit
celadhesiemoleculen (CAM)
75,4
aminozuur transport
S-adenosylmethionine biosynthetische proces
DNA-replicatie
25,0
positieve regulatie van transcriptie
Celcyclus
20,0
reactie op stress
Pathways in kanker
19.4
regulering van MAP-kinase activiteit
p53 signaleringsroute
17,0
Antigen verwerken en presenteren
15,7
MAPK signaalroute
13,2
kleincellige longkanker
12.2
circadiane ritme
11.9
24
de migratie van leukocyten
80,3
keratinocytdifferentiatie
cholesterol biosynthese proces
Celcyclus
24,4
aminozuur transport
reactie op ongevouwen eiwit
p53 signaleringsroute
20,9
keratinisatie
isoprenoide biosynthese proces
circadiane ritme
18,6
angiogenese
creatine biosynthese proces
DNA-replicatie
18,0
apoptose
reactie op oxidatieve stress
Adherens knooppunt
16.1
reactie op stress
Pathways in kanker
14.9
celcyclus
Nucleotide excisie reparatie
14.3
pyrimidinenucleotide metabole
ubiquitine gemedieerde proteolyse
14,2
proces
Fosfatidylinositol signaleringssysteem
13,7
inductie van positieve chemotaxis Beduidend
beïnvloed KEGG cellulaire routes en verrijkt Gene Ontology termen ( alleen biologische processen) (p
< 0,05) op verschillende tijdstippen na co-cultuur van H. pylori Kopen en AGS-cellen. Top 10 trajecten /ontologieën opgenomen, waar het aantal hoger is dan 10. IF = impact factor
Omdat GO analyse gewoon associeert differentieel tot expressie van genen met de ontologieën, er is geen poging om de rangschikking van de echte biologische betekenis van individuele genen of ontologieën. Daarom opgenomen we alleen genen met een log 2FC > 1.5 in de GO-analyse, met uitzondering van minder significant uitgedrukt genen die waarschijnlijk zal leiden tot foutieve GO ranking waren. Slechts termen gecategoriseerd onder biologische processen zijn opgenomen (tabel 2), omdat deze waren de focus van de studie. Geen GO termen werden verrijkt met 0,5 of 1 uur tijdstippen. Onder de genen opgereguleerd na 3-6 uur, het meest geassocieerde GO waren anti-apoptose en diverse inflammatoire en anti-microbiële processen zoals regulering van retrovirale genoom replicatie, T-helper 1 celdifferentiatie, chemotaxis, neutrofiel activatie en activering van het immuunsysteem. Bij 12-24 h, de up-gereguleerde genen verrijkte ontologie zoals celcyclus, apoptose, stressrespons, aminozuurtransport, angiogenese en keratinisatie, terwijl bepaalde biosynthetische processen behoren de downgereguleerde termen.
Hiërarchische clustering van de 245 genen met een log 2FC > 1,5 gevormd 5 verschillende clusters (A-E), op een afstand drempel van 0,54 (figuur 3). Elk cluster werd onderzocht voor de GO en cellulaire signaalroute verenigingen (tabel 3). GO analyse een significante voorwaarden voor alle clusters (p Restaurant < 0,05). Tabel 3 toont de top 10 in belangrijke mate beïnvloed cellulaire signaalwegen binnen elk cluster, gerangschikt op basis van IF. Cluster A bevatte 9 genen, en toonde stabiele niveaus van 6-12 uur voor het tonen van een daling. Drie genen die deze anti-apoptotische processen en twee genen betrokken bij MAPK signalering. Slechts 3 genen werden toegewezen cluster B, waar een snelle en sterke toename van expressie gedurende de eerste 3 uur, gevolgd door een daling. Van de 3 genen in de cluster, IL-8 Kopen en CXCL2
leek te dicteren veel van de acute ontstekingen zoals chemotaxis, immuunrespons en neutrofielen activation.Table 3 Cluster profilering: KEGG cellulaire paden en Gene Ontology
Temporal profiel over 24 uur
Cellular Pathway
Impact Factor
GO aantal

GO naam
MAPK signaalroute
7.3
GO: 0.006.916
anti-apoptose
apoptose
7.1
GO: 0.045.063
T- helper 1 celdifferentiatie
GO: 0.031.665
negatieve regulatie van LPS-gemedieerde signaalweg
GO: 0.014.912
negatieve regulatie van migratie van gladde spiercellen
GO: 0.043.405
regulering van MAP-kinase activiteit
epitheliale cell signaling in H. pylori-infectie

12.4
GO: 0.006.935
chemotaxis
cytokine-cytokine receptor interactie
10.2
GO: 0006954
ontstekingsreactie
Blaaskanker
6.8
GO: 0.006.955
immuunrespons
Toll-like receptor signaleringsroute
5.9
GO: 0.045.091
regulering van retrovirale genoom replicatie
Pathways in kanker
4.8
GO: 0.042.119
neutrofielen activering
GO: 0.050.930
inductie van positieve chemotaxis
GO: 0.030.593
neutrofielchemotaxis
GO: 0030155
regulatie van celadhesie
GO: 0019722
-calcium-gemedieerde signalering
circadiane ritme
20,0
GO: 0.006.915
apoptose
MAPK signalering pathway
10.7
GO: 0.006.950
reactie op
mTOR benadrukken signaleringsroute
7.5
GO: 0.007.050
celcyclus
tight junction
7,0
GO: 0030216
keratinocytdifferentiatie
Jak-STAT signaalweg
6.7
GO: 0.006.865
aminozuur transport
cytokine-cytokine receptor interactie
6.5
GO: 0031424
keratinisatie
verordening van autofagie
6,4
GO: 0.008.652
aminozuur biosynthese proces
p53 signaleringsroute
5.6
GO: 0.006.220
pyrimidinenucleotide metabole proces
Regulering van actine cytoskelet
5.2
TGF-beta signaleringsroute
5.2 Natural killer cel gemedieerde cytotoxiciteit
4.7
melanogenese
8.3
GO: 0030146
diurese
GnRH signaalweg
7.6
GO: 0.030.147
natriurese
ErbB signaleringsroute
6.7
GO: 0.048.661
positieve regulatie van gladde spiercel proliferatie
Pathways bij kanker
6.4
GO: 0.002.268
folliculaire dendritische celdifferentiatie
epitheliale cell signaling in H. pylori-infectie

5.7
GO: 0031583
activatie van fosfolipase D-activiteit van G-eiwit gekoppelde receptoren eiwit signalisatie
GO: 0014826
ader gladde spiercontractie
GO: 0002467
germinal center vorming
GO: 0030578
PML lichaam organisatie
GO: 0030195
negatieve regulatie van de bloedstolling
GO: 0043507
positieve regulering van juni kinase-activiteit
Antigen verwerken en presenteren
13,7
GO : 0006695
cholesterol biosynthese proces
MAPK signaalroute
9.7
GO: 0.006.986
reactie op ongevouwen eiwit
Blaaskanker
6.2
GO: 0.006.916
anti -apoptosis
Pathways in kanker
6.1
GO: 0.006.139
nucleobase, side, -tide en nucleïnezuur stofwisseling
Regulering van actine cytoskelet
6.1
GO: 0008299
isoprenoide biosynthetische proces
GO: 0006601
creatine biosynthese proces
GO: 0009416
reactie op licht stimulus
GO: 0043154
negatieve regulatie van caspase activiteit
GO: 0007566
innesteling van het embryo
Temporal profielen van 5 belangrijkste clusters geïdentificeerd door hiarchical clustering van de 245 meest differentieel tot expressie van genen (p
< 0.05) en bijbehorende gen ontologieën (alleen biologische processen) en KEGG cellulaire signaalwegen in elke cluster in H. pylori
blootgesteld AGS cellen. Gegevenspunten zijn dan 0,5, 1, 3, 6, 12 en 24 uur co-incubatie. Foutbalken ± standaardafwijking van expressie in het cluster. Top 10 ontologieën vermeld, waar nummer is meer dan 10

• De impact van de toelating diagnose op maaglediging bij ernstig zieke patients
• Invloed van neoadjuvant chemotherapie met PELF-protocoll versus chirurgie alleen in de behandeling van gevorderde maag carcinoma