L'interleuchina-8 è il singolo gene più up-regolati in tutto il genoma di profilazione di H. pylori esposto le cellule epiteliali gastriche

L'interleuchina-8 è il singolo cellule epiteliali gastriche più up-regolate geni in tutto il genoma di profilazione di H. pylori
esposti
Abstract
sfondo
L'associazione tra Helicobacter pylori
infezioni e malattie del tratto gastrointestinale superiore è ben consolidata. Tuttavia, solo una piccola frazione di H. pylori
portatori sviluppano la malattia, e ci sono grandi differenze geografiche nella malattia penetranza. La spiegazione di questo enigma sta nella interazione tra il batterio e l'host. H. pylori
membrana esterna fosfolipasi A (OMPLA) è stato suggerito di svolgere un ruolo nella virulenza di questo batterio. Lo scopo di questo studio era di profilo più significativi percorsi cellulari e processi biologici coinvolti nelle cellule epiteliali gastriche durante le 24 ore di H. pylori
l'esposizione, e per studiare la risposta infiammatoria a OMPLA + e OMPLA -. H. pylori
varianti
Risultati
interleuchina-8 è stato il più significativo up-regolati gene e sembra giocare un ruolo fondamentale nella risposta delle cellule epiteliali di H. pylori
infezione e in processi patologici che portano alla malattia gastrica. percorsi cellulari MAPK e NF-kB sono stati fortemente attivati, ma non sembrano spiegare l'imponente IL-8
risposta. Ci è stato caratterizzato up-regolazione di TP53BP2
, la cui proteina corrispondente ASPP2 può interagire con H. pylori CagA
e causare la soppressione p53 marcata di apoptosi. Altri regolatori di apoptosi anche mostrato regolamento abberant. Abbiamo anche individuato up-regolazione di diversi oncogeni e down-regolazione dei geni oncosoppressori come già durante le prime 24 ore di infezione. H. pylori
OMPLA variazione di fase non sembra influenzare la risposta infiammatoria gene delle cellule epiteliali in questo esperimento.
Conclusione
in tutta l'analisi del genoma della risposta epiteliale di H. pylori
esposizione, IL- 8
dimostrato il più marcato up-regulation, ed è stato coinvolto in molti dei più importanti processi di risposta cellulare allo l'infezione. C'era disregolazione dell'apoptosi, geni oncosoppressori e oncogeni come già nelle prime 24 ore di H. pylori
infezione, che può rappresentare i primi segni di tumorigenesi gastrica. OMPLA +/- non ha influenzato la risposta infiammatoria acuta a H. pylori
.
Sfondo
H. pylori
è ben definito come la causa principale di ulcera peptica e l'iniziatore della cascata più fasi che porta a adenocarcinoma gastrico. Anche se il cancro gastrico è il quarto cancro più comune in tutto il mondo e secondo solo al cancro ai polmoni nel causare decessi per cancro correlati [1], ci sono notevoli differenze nella distribuzione di questa malattia tra i paesi occidentali e orientali. La diminuzione del cancro gastrico parallelo H. pylori
prevalenza nel mondo occidentale, ma questo fenomeno non spiega del tutto le grandi differenze geografiche nella distribuzione cancro gastrico. Il motivo per cui solo l'1-2% di H. pylori
individui -infected sviluppare neoplasie gastriche rimane inspiegabile, e comprende sia le differenze di ceppi batterici, soprattutto cagA
stato, la genetica di accoglienza e gli aspetti ambientali.
H . pylori
carcinogenesi comporta azione indiretta dei batteri attraverso l'infiammazione cronica della mucosa gastrica corpus, e anche l'azione diretta di H. pylori
sulle cellule epiteliali. infiammazione persistente è associata con una maggiore produzione di numerose citochine pro-infiammatorie come IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-7 e IL-8 [2] che aumentano l'apoptosi, iperproliferazione e produzione di ossigeno reattivo e azoto specie che causano danni al DNA e mutazioni. Inoltre, l'azione diretta di H. pylori
sulle cellule epiteliali può anche promuovere la cancerogenesi. cagA
+
H. pylori
ceppi batterici iniettare prodotti nelle cellule epiteliali attraverso un sofisticato processo di iniezione di tipo IV, che attiva vie di segnalazione intracellulare, in particolare la famiglia MAP-chinasi (MAPK) percorso [3] e fattore nucleare kappa B (NF-kB), e può facilitare epitelio-mesenchimale transizione [4], ognuno dei quali può contribuire alla trasformazione neoplastica. Inoltre, lo sviluppo del tumore è associata con la proliferazione e l'inibizione dell'apoptosi [5, 6], considerando che l'eccessiva apoptosi è pensato per promuovere la formazione di ulcera gastrica. L'effetto di H. pylori
sul gastrica apoptosi epiteliale ha mostrato prove contrastanti. Diversi studi in vitro hanno dimostrato che H. pylori
stimolare l'apoptosi [7, 8], mentre alcuni studi in vivo dimostrano l'inibizione dell'apoptosi [9, 10]. CagA iniezione nelle cellule epiteliali gastriche up-regola l'anti-apoptotica MCL proteine ​​[11] e interferisce con l'apoptosi-stimolante proteina 2 di p53 (ASPP2) [12]. cause di inibizione ASPP2 migliorata degradazione della p53, in modo simile a virus tumorali DNA, diminuendo in tal modo l'attività apoptotica, il che può spiegare l'aumento del rischio di GC associato a cagA
+
H. pylori
infezione .
Tannæs et al. hanno riportato in precedenza che H. pylori PLDA
gene, che codifica per batterica membrana esterna fosfolipasi A (OMPLA), mostra la variazione di fase con conseguente 'ON' (OMPLA +) e 'OFF' (OMPLA - ) commutazione di attività OMPLA causa di uno slittamento spontanea in un omopolimero (C) tratto del gene [13]. Il OMPLA + variante era associata ad un aumento della sopravvivenza dei batteri in un ambiente acido, aderenza, emolisi e il rilascio di ureasi e VacA rispetto al OMPLA - variante [14]. OMPLA è stato anche coinvolto nella virulenza di altri agenti patogeni gastrointestinali [15], e un collegamento tra l'attività OMPLA e l'infiammazione gastrica è stato suggerito in un precedente studio [16].
Anche se la risposta delle cellule epiteliali gastriche da H. pylori
l'esposizione è stata sottoposta a molti esperimenti dopo la scoperta del batterio nel 1984 [17], solo pochi studi hanno utilizzato la tecnologia del cDNA microarray [18-29]. Quasi tutti questi esperimenti sono stati eseguiti su Asian H. pylori
ceppi, e non gli autori hanno confrontato la risposta delle cellule epiteliali per OMPLA + contro OMPLA - batteri. Lo scopo di questo studio era indagare la risposta genica temporale delle cellule epiteliali gastriche esposti a H. pylori
ceppo clinicamente ottenuti, e per esaminare il contributo del OMPLA sulla risposta infiammatoria. L'accento è stato posto sulle più importanti risposte biologiche che utilizzano termini Gene Ontology (GO) e vie di segnalazione cellulari associati.
Risultati
Per studiare la morfologia cellulare seguente H. pylori
infezione a 3 e 6 ore, non
esposto le cellule -exposed e H. pylori sono state colorate ed esaminate al microscopio immunofluorescenza (Figura 1). Sia a 3 e 6 ore non vi era alcuna differenza significativa nella capacità tra il OMPLA + e OMPLA - H. pylori
di aderire alle cellule AGS, e non vi erano differenze significative nei cambiamenti morfologici a le cellule AGS in risposta a esposizione ai due varianti. Non siamo stati in grado di identificare eventuali differenze statisticamente significative nell'espressione genica tra le cellule esposte a OMPLA + e OMPLA - varianti in qualsiasi punto temporale sopra la 24 ore di co-coltura (p
< 0.05). Abbiamo quindi concluso che l'analisi dei risultati potrebbe essere eseguita senza tener conto delle differenze di variazione di fase. immagini Figura 1 immunofluorescenza di cellule AGS esposte a H. pylori. cellule AGS erano non-esposti, o esposti a OMPLA + e OMPLA- H. pylori
ad una MOI di 300: 1 e co-coltura per 3 e 6 ore. I batteri sono state colorate con coniglio anti-Helicobacter
anticorpi. Le immagini sono state catturate al microscopio a fluorescenza.
Il profilo cDNA di H. pylori
esposto cellule AGS sono stati confrontati contro le cellule di controllo non infetti in sei punti di tempo separati entro 24 ore. 7498 sonde di chip corrispondenti a 6237 geni umani hanno mostrato espressione differenziale nelle cellule infette rispetto alle cellule di controllo a non meno di 1 punto nel tempo (p
< 0. 05) (sui file 1: Tabella S1). Il numero di geni espressi in modo differenziale in modo significativo ad ogni punto di tempo rispetto ai non-infetti AGS-cellule, e il modo in cui si sovrappongono in diversi momenti sono illustrati nella Tabella 1 e Figura 1 2.Table Numero di geni differenzialmente regolati
Time

0.5

1

3

6

12

24

Up-regolati
0 2
91
123
1679
2997
down-regolato
0
1 26
65
2034
2492
totale
0 3
117
188
3713
5489
numero di geni in modo significativo differenziale regolamentati (p
<0,05) in ciascuno dei punti di tempo di campionamento dopo un periodo di co-incubazione di H. pylori
in cellule AGS
Figura 2 diagrammi di Venn di geni significativamente regolati. diagrammi di Venn di geni differenzialmente espressi su pylori
-infected cellule AGS H. rispetto alle cellule di controllo (p
< 0,05). I cerchi si intersecano indicano i geni che si sovrappongono ai punti di tempo indicati. AGS = controllo non infetto cellule AGS.
Non ci sono stati espressi non in modo significativo i geni a 0,5 ore, un moderato aumento del numero di geni da 1 a 6 h, e un aumento di 20 volte da 6 a 24 ore. Da un punto di campionamento a quello successivo, la maggior parte dei geni sovrappongono, tuttavia un considerevole numero di geni unici sono stati anche differenzialmente regolati a ogni punto temporale (Figura 2). Circa il 47% del numero totale di geni significativamente espressi sono stati up-regolato, e il 53% ha mostrato down-regolazione rispetto al controllo. Tra i più di 6000 geni espressi in modo significativo, IL-8
era il singolo gene più differenzialmente espressi (Figura 3). Figura 3 Hiarchical il clustering dei geni più significativo differenziale regolamentati. raggruppamento Hiarchical dei geni in modo significativo differenziale regolamentati (log2FC > 1.5, p
< 0,05). La freccia indica a IL-8
.
La lista di tutti i geni significativi è stato analizzato per Associated Kyoto Enciclopedia di geni e vie di segnale genomi (KEGG) da Pathway espresso in ogni punto. Significativamente influenzato percorsi e corrispondente Impact Factor (IF) sono presentati nella tabella 2. percorsi di segnale di risposta precoce che sono state significativamente interessati inclusi la segnalazione delle cellule epiteliali in H. pylori
percorso infezione, recettore citochina-citochine, dei recettori Toll-like ( TLR) vie di segnalazione così come molti percorsi correlati al cancro e percorsi immunologici. A 1 h, IL-8
stato coinvolto nella maggior parte delle vie di segnale colpite. A 3 e 6 ore, la maggior parte dei percorsi più alti ordinati avuto parecchi geni in comune, come ad esempio NFKB1, NFKB2, NFKBIA, NFKBIE, BIRC2, BIRC3, JUND, CCND1
e Akt3
. Il sistema di segnalazione fosfatidilinositolo viene assegnato un elevato SE alle 6 ore a causa del significato di un singolo gene, PIK3C2B
, che è down-regolato da un registro 2FC di -0.58 e svolge un ruolo chiave in questo percorso. A 12 h, le vie cellulari più colpiti sono stati i leucociti migrazione transendoteliale, molecole di adesione cellulare, via la replicazione del DNA, p53 via di segnalazione così come diversi percorsi legati al cancro. risultati relativamente simili sono visti a 24 ore, tuttavia alcuni dei percorsi correlati al cancro sono rappresentati più in basso nella lista (dati non mostrati, solo top 10 mostrato nella tabella 2) Corso .table 2 Tempo: KEGG percorsi cellulari e Gene Ontology
Tempo
KEGG cellulare nome percorso
IF
GO geni up-regolati

GO geni down-regolati
0.5
Nessun geni significativi
Nessun geni significativi
Nessun geni significativi
1 segnalazione cellulare epiteliale a infezione da Helicobacter pylori
16,6
No Go significativo
Nessun geni significativi
citochine citochina recettore
8.1
Il carcinoma della vescica
7.5
recettore Toll-like via di segnalazione
escissione 6.6
Base riparazione
6.0
immunodeficienza primaria
5,9
Pathways nel cancro
5.4 3
epiteliale segnalazione cellulare in infezione da Helicobacter pylori
17,8
anti-apoptosi
Nessun significativo GO
Pathways nel cancro
16.9
regolazione del genoma retrovirale
cancro del polmone a piccole cellule
14,2
replica
MAPK percorso di segnalazione
14.2
T -helper 1 cella di differenziazione
apoptosi
12,5
regolazione negativa della via di segnalazione LPS-mediata
adipocitochinico via di segnalazione
12,3 regolazione
negativo della migrazione delle cellule muscolari lisce
cancro della prostata
11.4
regolazione della MAP chinasi chemiotassi attività
recettore Toll-like via di segnalazione
11.1
proteine ​​defosforilazione aminoacido
T cell receptor via di segnalazione
attivazione 10.5
neutrofili
recettore delle cellule B via di segnalazione
9,9
trascinamento di orologio circadiano
6
sistema di segnalazione Fosfatidilinositolo
32.2
anti-apoptosi
No significativo GO
segnalazione cellulare epiteliale in Helicobacter pylori infezione
15,5
regolazione del genoma retrovirale
cancro del polmone a piccole cellule
14,2
replica
Pathways nel cancro
12,4
T-helper 1 la differenziazione delle cellule
L'apoptosi
11,6
neutrofili attivazione
adipocitochinico via di segnalazione
10.1 regolamentazione
negativo di I-kB
recettore via di segnalazione Toll-like
8.9
chinasi /NF -kb cascata
MAPK pathway di segnalazione
8.7
induzione di chemiotassi positivi
vescica cancro
8.5
mieloide dendritiche recettore delle cellule differenziazione delle cellule B
via di segnalazione
8.3
12
leucociti transendoteliale migrazione
309.7
cellule ciclo arresto
risposta alle proteine ​​spiegato
molecole di adesione cellulare (CAM)
75,4
amino acido trasporto
S-adenosilmetionina processo di biosintesi
replicazione del DNA
25,0 regolazione
positivo della trascrizione
ciclo cellulare
20,0
risposta allo stress
Pathways nel cancro
19,4
regolazione della MAP chinasi attività
p53 via di segnalazione
17,0
elaborazione e presentazione dell'antigene
15,7
MAPK pathway di segnalazione
13,2
carcinoma polmonare a piccole cellule
12.2
ritmo circadiano
11,9
24
leucociti transendoteliale migrazione
80,3
cheratinociti differenziazione
colesterolo processo biosintetico
ciclo cellulare
24,4 trasporto degli acidi
amino
risposta alle proteine ​​spiegato
percorso di segnalazione di p53
20,9
cheratinizzazione
isoprenoidi processo biosintetico
ritmo circadiano
18,6
angiogenesi
creatina processo biosintetico
replicazione del DNA
18,0
apoptosi
risposta allo stress ossidativo
adherens giunzione
16.1
risposta allo stress
Pathways nel cancro
ciclo 14,9
cellulare arresto
riparazione Nucleotide excision
14.3
pirimidina nucleotidi metabolica
ubiquitina mediata proteolisi
14,2
processo
Fosfatidilinositolo sistema di segnalazione
13,7
induzione di chemiotassi positivi
significativamente influenzato percorsi cellulari KEGG e arricchito termini Gene Ontology ( solo i processi biologici) (p
< 0,05) in diversi momenti seguenti co-coltura di H. pylori
e le cellule AGS. I 10 percorsi /ontologie inclusi in cui numero supera 10. IF = impatto fattore
Poiché l'analisi GO associa semplicemente geni espressi in modo differenziale con le ontologie, non vi è alcun tentativo di classifica il vero significato biologico di singoli geni o ontologie. Pertanto, abbiamo incluso solo i geni con un registro 2FC > 1.5 nell'analisi GO, esclusi i minori geni significativamente espressi che erano probabilità di tradursi in classifica GO errata. Solo termini classificati con i processi biologici sono inclusi (Tabella 2), in quanto questi sono stati al centro dello studio. Nessun termine GO sono stati arricchiti a 0,5 o 1 punto h tempo. Tra i geni up-regolati a 3-6 h, i GO più frequentemente associati erano anti-apoptosi, e diversi processi infiammatori e anti-microbici come la regolazione della replicazione del genoma retrovirale, T-helper 1 cella di differenziazione, chemiotassi, l'attivazione dei neutrofili e attivazione immunitaria. A 12-24 h, i geni up-regolati arricchito ontologie come arresto del ciclo cellulare, apoptosi, la risposta allo stress, il trasporto degli aminoacidi, l'angiogenesi e cheratinizzazione, mentre alcuni processi di biosintesi sono tra i termini down-regolato.
Clustering gerarchico del 245 geni con un registro 2FC > 1.5 formata 5 gruppi distinti (A-E), ad una soglia di distanza di 0,54, (figura 3). Ogni cluster è stato esaminato per GO e associazioni pathway di segnale cellulare (Tabella 3). GO analisi ha fornito termini significativi per tutti i cluster (p
< 0,05). La tabella 3 mostra i primi 10 in modo significativo impatto vie di segnalazione cellulare all'interno di ciascun gruppo, classificati in base alle IF. Cluster A conteneva 9 geni, e ha dimostrato livelli costanti a 6-12 ore prima di mostrare un declino. Tre geni sono stati coinvolti nei processi anti-apoptotici e due geni sono stati coinvolti nella segnalazione MAPK. Solo 3 geni sono stati assegnati al Gruppo B, dove c'era un aumento rapido e potente nel espressione durante le prime 3 ore, seguito da un declino. Dei 3 geni del cluster, IL-8 e
CXCL2
sembravano dettare molti dei processi infiammatori acuti come la chemiotassi, la risposta immunitaria e neutrofili activation.Table 3 profili cluster: percorsi cellulari KEGG e Gene Ontology
profilo temporale su 24 h
cellulare Pathway
Impact Factor
GO numero

GO nome
MAPK pathway di segnalazione
7.3
GO: 0.006.916
anti-apoptosi
apoptosi
7.1
GO: 0.045.063
T- helper 1 differenziazione cellulare
GO: 0.031.665
regolazione negativa della via di segnalazione LPS-mediata
GO: 0.014.912
regolazione negativa della migrazione delle cellule muscolari lisce
GO: 0.043.405
regolazione della MAP chinasi attività
segnalazione cellulare epiteliale in H. pylori
infezione
12.4
GO: 0006935
chemiotassi
recettore citochine citochine
10.2
GO: 0.006.954
risposta infiammatoria
Il carcinoma della vescica
6.8
GO: 0.006.955
risposta immunitaria
recettore via di segnalazione Toll-like
5.9
GO: 0.045.091
regolazione della retrovirale replicazione del genoma
Pathways nel cancro
4.8
GO: 0.042.119
attivazione dei neutrofili
GO: 0.050.930
induzione di chemiotassi positivi
GO: 0030593
chemiotassi dei neutrofili
GO: 0.030.155
regolazione dell'adesione cellulare
GO: 0.019.722
calcio-mediata segnalazione
ritmo circadiano
20,0
GO: 0.006.915
apoptosi
MAPK segnalazione percorso
10,7
GO: 0.006.950
risposta allo stress
mTOR via di segnalazione
7.5
GO: 0.007.050
cellule ciclo arresto
giunzione a tenuta
7.0
GO: 0030216
cheratinociti differenziazione
Jak-STAT percorso di segnalazione
6,7
GO: 0.006.865
amino acido trasporto
citochine citochina recettore interazione
6,5
GO: 0031424
cheratinizzazione
regolamento di autofagia
6.4
GO: 0.008.652
amino processo di biosintesi dell'acido
segnalazione p53 percorso
5.6
GO: 0.006.220
pirimidina nucleotidi metabolica processo
regolamento di actina citoscheletro
5.2
TGF-beta via di segnalazione cellulare
5.2
natural killer citotossicità
4.7
melanogenesi
8.3
GO: 0030146
diuresi
GnRH via di segnalazione
7.6
GO: 0.030.147
natriuresis
ErbB via di segnalazione
6,7
GO: 0.048.661
regolazione positiva del liscio proliferazione delle cellule muscolari
Pathways nel cancro
6.4
GO: 0.002.268
follicolare differenziazione delle cellule dendritiche
segnalazione cellulare epiteliale in H. pylori
infezione
5.7
GO: 0.031.583
attivazione di attività di fosfolipasi D per accoppiati a proteine ​​G proteina recettore di segnalazione
GO: 0014826
vena contrazione della muscolatura liscia
GO: 0002467
germinale formazione centro
GO: 0.030.578
organizzazione corpo PML
GO: 0.030.195
regolazione negativa della coagulazione del sangue
GO: 0.043.507
regolazione positiva di attività chinasi giugno
elaborazione e presentazione dell'antigene
13,7
GO : 0006695 processo di biosintesi del colesterolo

MAPK percorso di segnalazione
9,7
GO: 0.006.986
risposta alle proteine ​​spiegato
Il carcinoma della vescica
6.2
GO: 0.006.916
anti -apoptosis
Percorsi nel cancro
6.1
GO: 0.006.139
nucleobase, -side, -tide e metabolismo degli acidi nucleici
regolamento di actina citoscheletro
6.1
GO: 0.008.299
isoprenoidi processo biosintetico
GO: 0.006.601 processo biosintetico
creatina
GO: 0.009.416
risposta alla luce stimoli
GO: 0.043.154
regolazione negativa dell'attività di caspasi
GO: 0007566
impianto dell'embrione profili temporali su 5 cluster principali individuati dal raggruppamento hiarchical delle 245 più geni espressi in modo differenziale (p
< 0.05) e collegate ontologie di geni (solo processi biologici) e vie di segnalazione cellulare KEGG in ogni cluster in H. pylori
esposti cellule AGS. I punti dati sono a 0,5, 1, 3, 6, 12 e 24 h di co-incubazione. Le barre di errore rappresentano ± deviazione standard di espressione all'interno del cluster. Top 10 ontologie elencati in cui numero è superiore a 10
Cluster C compreso il gruppo più grande, e conteneva 150 geni che non presentavano alcun cambiamento se non dopo 6-12 ore. I geni di risposta GO termini di apoptosi, arresto del ciclo cellulare e lo stress sono stati notevolmente arricchiti, e molti di questi geni, come JUN, Gadd45a, DDIT3, MKNK2, DUSP1, RPS6KA5, FLNC
, e RASGRP
sono stati anche coinvolti in MAPK segnalazione. Inoltre, CSF2RA
, IL24
, IL20R
e l'oncogene PIM1
sono stati coinvolti in Jak-STAT segnalazione e segnalazione di citochine-citochina
. Cluster D ha mostrato un moderato aumento con un picco a 12 ore, seguito da una diminuzione verso 24 h. 13 geni sono stati assegnati a questo gruppo, tra cui EDN1
, una delle isoforme della potente vasocostrittore endotelina, che ha arricchito quasi tutte le GO elencati. NFKB2
, una delle due subunità di NF-kB, HBEGF
e ETS1
sono state incluse anche in questo cluster.
Cluster E ha dimostrato di 71 geni che hanno dimostrato la down-regulation dopo 6-12 ore e comprendeva FGFR3
e diversi geni di proteine ​​da shock termico che sono stati coinvolti nel percorso di segnalazione MAPK e l'inibizione dell'apoptosi. Inoltre, molti GO processi di biosintesi sono state arricchite.
Per confermare i risultati di microarray, abbiamo scelto di verificare la IL-8
, perché questo era il singolo gene più differenziale regolamentato nello studio. mRNA e la proteina sono stati campionati stessi tempi e studiati mediante RT-PCR ed ELISA (figure 4 e 5). C'è stato un aumento di IL-8
mRNA evidente dopo 1 ora e un picco a circa 3 ore. L'IL-8
risposta mRNA per poi scendere verso il 6 e 12 ore. A 24 h c'era un secondo aumento, ma con varianza notevole tra i due esperimenti. A 0,5 e 1 ora di co-coltura, IL-8 livelli di proteine ​​erano bassi e non hanno mostrato alcun cambiamento. Tra 3 e 6 ore di co-coltura, c'è stato un significativo aumento di IL-8 che ha mostrato alcun ulteriore aumento dopo 6 h. Figura 4 Time-corso di IL-8 espressione di mRNA in cellule AGS co-coltura con H. pylori. L'analisi quantitativa PCR di IL-8
espressione in H. pylori
-infected cellule AGS in sei diversi punti di campionamento oltre 24 ore. I punti dati sono i valori di tre colture cellulari replicati da due esperimenti indipendenti, A e B. linee rappresentano la media calcolata all'interno di ciascuno degli esperimenti.
Figura 5 Time-corso di IL-8 espressione della proteina nelle cellule AGS co-coltura da H. pylori. analisi ELISA di IL-8 espressione della proteina in pylori
-infected cellule AGS H. in sei diversi punti di campionamento oltre 24 ore. I punti dati sono i valori di tre colture cellulari replicati da due esperimenti indipendenti, A e B. linee rappresentano la media calcolata all'interno di ciascuno degli esperimenti.
Infine, abbiamo voluto accertare che il MOI scelto è stato stabile per quanto riguarda AGS gene espressione. Abbiamo usato IL-8
risposta come indicatore di espressione genica e le cellule AGS sono stati co-incubate con H. pylori
per 3 ore a diverse MOI in due esperimenti separati (Figura 6). C'era un modesto IL-8
risposta a MOI di 15: 1 e 150: 1, con un notevole incremento a MOI di 300: 1. C'erano poi variazioni trascurabili IL-8
espressione sopra di 300: 1, il che suggerisce che l'inoculo iniziale di 300: 1 è sufficiente per provocare una risposta biologica senza sovraccaricare il sistema di coltura cellulare. Figura 6 dose-risposta di IL-8 espressione di mRNA in cellule AGS co-coltura con H. pylori. Quantitativa PCR di IL-8
espressione in H. pylori
cellule AGS -infected, co-incubate per 3 ore. I punti dati sono i valori di tre colture cellulari replicati da due esperimenti indipendenti, A e B. linee rappresentano la media calcolata all'interno di ciascuno degli esperimenti.
Discussione
In questo studio abbiamo dimostrato una significativa, risposta immediata da cellule AGS all'esposizione ad un H. pylori
ceppo ottenuto da un ambiente clinico. Più di 6000 geni umani hanno dimostrato statisticamente significativa regolazione differenziale durante le prime 24 ore di co-incubazione.
H. pylori
infezione è stata associata sia la stimolazione e inibizione dell'apoptosi. Alcuni esperimenti di coltura cellulare dimostrano up-regolazione di geni associati con l'apoptosi [7, 8], mentre alcuni studi in vivo dimostrano proliferazione e apoptosi inibizione [9, 10]. VacA tossina ha dimostrato di provocare l'apoptosi in diversi studi [30-33], mentre il ruolo di CagA è in conflitto. CagA è stata associata sia la stimolazione e inibizione dell'apoptosi [11, 12, 34]. le cellule biliari esposte a cagA
+
H. pylori
a bassissimo inoculo (MOI 1: 1) ha dimostrato un aumento della crescita delle cellule, mentre a MOI di 200: 1, l'apoptosi è stata stimolata [35 ]. CagA può anche antagonizzare direttamente l'effetto pro-apoptotico di VacA, come si è visto nelle cellule AGS [31]. L'apoptosi si verifica dopo un certo numero di eventi cellulari, con conseguente attivazione della caspasi-3, che è pensato per costituire l'effettore base dell'apoptosi. Nel presente studio, entrambi i geni inibitori e stimolatori hanno mostrato significativa espressione differenziale, a dimostrazione della complessità della influenza di H. pylori
su apoptosi: gli inibitori della caspasi HSPA5
e DHCR24
ha mostrato simile ritardo down-regulation sotto forma di calore geni urto HSPA1B, HSPB1
, che sono anche associati con la stimolazione apoptosi (gruppo E, tabella 3). D'altra parte, TNFAIP3, BIRC2, BIRC3
e SERPINB2
, anche associato con l'inibizione dell'apoptosi, ha dimostrato precoce e persistente up-regulation raggruppati in cluster di A. Tuttavia, regolatori positivi di apoptosi PTPRH, tnfrsf12a, IL24, Gadd45a, TRIB3, DDIT4, PHLDA4, PP1R15A
e SQSTM1
erano tutti up-regolati nel modello simile dopo 6-12 h (gruppo C). MCL1
, un gene anti-apoptotico espressa in risposta ad iniezione CagA [11], dimostrarono aumentando up-regulation nel corso dello studio. Non ci sono stati cambiamenti significativi nella BCL-2
e molto poco aumento di BAX
espressione nel nostro studio, due geni importanti che determinano la sensibilità delle cellule ad altri stimoli apoptotici [36-39]. Degno di nota, ci è stato caratterizzato up-regolazione di TP53BP2
, un importante gene soppressore del tumore (STG) nei tumori umani, in primo luogo stimolando la promozione p53 dei geni apoptosi. D'altra parte, TP53BP2
si codifica ASPP2 proteina, che è stato anche dimostrato di stimolare l'apoptosi indipendentemente p53 [40-42]. Tuttavia, Buti et al. recentemente dimostrato che CagA iniettato nelle cellule epiteliali gastriche mirati proteina ASPP2 di inibire l'apoptosi p53-mediata [12]. L'aumento TP53BP2
espressione visto nel nostro studio, potrebbe quindi potenziare questo effetto aumentando l'interazione CagA-ASPP2 a causare un aumento inibizione dell'apoptosi p53-mediata. In realtà, questo studio ha dimostrato che i geni bersaglio p53 coinvolti nella apoptosi [43], come FAS
, DR4
, TNFRSF10B
(noto anche come DR5 /KILLER
), DCR1
, DCR2
, p53AIP1
, CASP6
, APAF1
e BNIP3L
non ha mostrato alcun aumento significativo, e BNIP3L
, CASP6
e APAF1
, BID
e BAX
ha mostrato solo un piccolo aumento. geni bersaglio p53 che regolano processi cellulari non-apoptotici tra MDM2
, Gadd45a
, CDKN1A
(anche conosciuto come P21 WAF1 /CIP1
), EGFR
, CCND1
, CCNG2
e TGFA
dimostrato da moderato a marcato up-regulation. Questa espressione genica differenziale identificato tra i geni bersaglio di p53 in questo studio, può indicare l'inibizione selettiva di apoptosi p53-mediata a causa di una maggiore interazione CagA-ASPP2, in linea con le scoperte di Buti.
Tuttavia, questo studio non è stato progettato per valutare se il importo complessivo di segnali inibitori e stimolatori facilitato l'apoptosi o proliferazione di cellule epiteliali. I risultati attuali illustrano la complessità della regolazione dell'apoptosi nelle cellule epiteliali in risposta ad H. pylori
l'esposizione, e l'analisi di cluster suggerisce che ci sia un certo coordinamento biologica dell'espressione genica che regolano l'apoptosi. Questo potrebbe spiegare alcuni dei complesso meccanismo cancerogeno di H. pylori
in adenocarcinoma gastrico. Vi è una forte associazione tra H. pylori
infecton, in particolare la cagA
+ genotipo [44], e adenocarcinoma gastrico [45, 46], e anche altri tipi di cancro sono state suggerite al porto un ruolo per H. pylori
[47, 48]. 0.05.

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