Interleukin-8 ist der absolut hochreguliert Gen in whole genome Profilieren von H. pylori ausgesetzt Magenepithelzellen cells

Interleukin-8 ist das einzige und hochregulierte Gen in whole genome Profilieren von H. pylori
Magenepithelzellen ausgesetzt
Abstrakte
Hintergrund
Die Assoziation zwischen Helicobacter-pylori-Infektion
und oberen Magen-Darm-Erkrankung ist gut etabliert. Allerdings wird nur ein kleiner Bruchteil von H. pylori
Träger Krankheit zu entwickeln, und es gibt große geografische Unterschiede in der Krankheits Penetranz. Die Erklärung für dieses Rätsel liegt in der Wechselwirkung zwischen dem Bakterium und dem Host. H. pylori
Outer Membrane Phospholipase A (OMPLA) ist vorgeschlagen worden, eine Rolle bei der Virulenz des Bakteriums zu spielen. Das Ziel dieser Studie war es, die wichtigsten zellulären Wege und biologische Prozesse in Magenepithelzellen betroffen Profil während 24 h von H. pylori
Belichtung und zur Untersuchung der Entzündungsreaktion auf OMPLA + und OMPLA -. H. pylori
Varianten
Ergebnisse | Interleukin-8 war die signifikant hochreguliert Gen und scheint eine herausragende Rolle in der epithelialen Zellantwort auf H. pylori
Infektion zu spielen und in der pathologische Prozesse zu Magenerkrankung führt. MAPK und NF-kappaB zelluläre Wege wurden stark aktiviert, aber offenbar nicht die beeindruckende IL-8
Reaktion zu erklären. Es wurde eine Hochregulierung von TP53BP2
markiert, deren entsprechende Protein ASPP2 in Wechselwirkung treten können mit H. pylori
CagA und verursachen markierte p53 Unterdrückung der Apoptose. Andere Regulatoren der Apoptose zeigte auch abberant Regulierung. Wir haben auch die Hochregulierung von mehreren Onkogenen und Herunterregulierung von Tumorsuppressorgenen bereits während der ersten 24 h der Infektion identifiziert. H. pylori
OMPLA Phasenvariation schien nicht die entzündliche Epithelzelle Genantwort in diesem Experiment zu beeinflussen.
Fazit
ganze Genomanalyse der epithelialen Reaktion auf H. pylori
Exposition, IL- 8
demonstriert die up-Regulierung markiert und wurde in vielen der wichtigsten zellulären Antwort Prozesse auf die Infektion beteiligt. Es gab Dysregulation der Apoptose, Tumorsuppressorgenen und Onkogenen bereits in den ersten 24 h von H. pylori
Infektion, die frühen Anzeichen der Magen tumorigenesis darstellen. OMPLA +/- nicht die akute entzündliche Reaktion auf H. pylori
.
Hintergrund
H. nicht beeinträchtigte pylori
ist auch die Hauptursache für Magengeschwüre und Initiator der vielstufige Kaskade führt zu einem Adenokarzinom des Magens etabliert. Obwohl Magenkrebs die vierthäufigste Krebsart weltweit und an zweiter Stelle nur zum Lungenkrebs bei der Entstehung von Krebs in Verbindung stehende Todesfälle ist [1], gibt es bemerkenswerte Unterschiede in der Verteilung dieser Krankheit zwischen westlichen und östlichen Ländern. Der Rückgang der Magenkrebs Parallelen H. pylori
Prävalenz in der westlichen Welt, aber dieses Phänomen die großen geografischen Unterschiede bei Magenkrebs Verteilung nicht vollständig erklären. Der Grund, warum nur 1-2% der H. pylori
infizierten Individuen Magen-malignen Erkrankungen entwickeln bleibt unerklärt, und umfasst sowohl Unterschiede in Bakterienstämmen, vor allem CagA
Status, Host-Genetik und Umweltaspekte.
H . pylori
Karzinogenese beinhaltet indirekte Wirkung der Bakterien durch eine chronische Entzündung der Magen Corpusmukosa, und auch eine direkte Wirkung von H. pylori
auf Epithelzellen. Persistent Entzündung wird mit erhöhter Produktion von mehreren pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL-1β, TNF-α assoziiert, IL-6, IL-7 und IL-8 [2], die die Apoptose erhöhen, Hyperproliferation und der Produktion von reaktivem Sauerstoff und Stickstoff, Spezies verursacht DNA-Schäden und Mutationen. Darüber hinaus pylori direkte Wirkung von H.
auf den Epithelzellen können auch Karzinogenese fördern. CagA
+
H. pylori-Stämme
bakterielle Produkte in Epithelzellen durch ein ausgeklügeltes Typ-IV-Injektionsverfahren zu injizieren, die die intrazelluläre Signalwege aktiviert, insbesondere der Mitogen-aktivierten Protein-Kinase-Familie (MAPK) Weg [3] und nuclear factor kappa B (NF &kgr; B) und kann epithelial-mesenchymalen Übergang [4], welche alle dazu beitragen können neoplastische Transformation erleichtern. Darüber hinaus wird die Tumorentwicklung mit Proliferation und Apoptose assoziiert Hemmung [5, 6], während übermßige Apoptose gedacht Magengeschwürbildung zu fördern. Die Wirkung von H. pylori
Magenepithelzellen Apoptose hat widersprüchliche Ergebnisse zeigten. Mehrere in vitro-Studien haben gezeigt, dass H. pylori apoptosis
stimulieren [7, 8], während einige in vivo Studien zeigen die Hemmung der Apoptose [9, 10]. CagA Injektion in Magenepithelzellen up-reguliert das anti-apoptotische Protein MCL [11] und interferiert mit Apoptose-stimulierende Protein 2 von p53 (ASPP2) [12]. ASPP2 Hemmung Ursachen Abbau von p53 verbessert, in einer Weise ähnlich wie DNA-Tumorviren, wodurch apoptotische Aktivität abnimmt, der das erhöhte Risiko von GC mit cagA assoziiert erklären kann
+
H. pylori Infektion
.
Tannæs et al. dass die H. pylori PLDA
Gen bereits berichtet haben, Codierung für bakterielle äußere Membran-Phospholipase A (OMPLA) zeigt Phasenvariation was 'ON' (OMPLA +) und "OFF" (OMPLA - ) Schalten von OMPLA Aktivität aufgrund einer spontanen Schlupf in einem Homopolymer (C) Trakts des Gens [13]. Die OMPLA + Variante mit einer erhöhten bakteriellen Überleben in einer sauren Umgebung, die Einhaltung, Hämolyse und die Freisetzung von Urease und VacA im Vergleich zum OMPLA verbunden war - Variante [14]. OMPLA hat auch in der Virulenz von anderen Magen-Darm-Erreger [15], und eine Verbindung zwischen OMPLA Aktivität und Magenentzündung wurde in einer früheren Studie vorgeschlagen [16].
Obwohl der Magen-epithelialen Zell-Antwort auf H. pylori in Zusammenhang gebracht
Belichtungs hat seit der Entdeckung des Bakteriums 1984 [17] zu vielen Versuchen unterzogen wurde, nur wenige Studien cDNA-Mikroarray-Technologie [18-29] verwendet wurden. Fast alle diese Versuche wurden auf den asiatischen H. pylori
Stämme durchgeführt, und es werden keine Autoren haben die epithelialen Zellantwort auf OMPLA verglichen + gegen OMPLA - Bakterien. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die zeitliche Genexpression Reaktion von Magen-Epithelzellen in einem klinisch erhaltenen H. pylori-Stamm
ausgesetzt zu untersuchen, und den Beitrag der OMPLA an der Entzündungsreaktion zu untersuchen. Der Schwerpunkt wurde auf die wichtigsten biologischen Reaktionen gesetzt worden mit Gene Ontology (GO) Begriffe und die damit verbundenen zellulären Signalwegen.
Ergebnisse
der Zellmorphologie zu studieren folgenden H. pylori
Infektion bei 3 und 6 h, nicht -exposed und H. pylori
Zellen ausgesetzt wurden gefärbt und mit Immunfluoreszenzmikroskopie (Abbildung 1) untersucht. An beiden 3 und 6 h gab es keinen signifikanten Unterschied in der Fähigkeit zwischen dem OMPLA + und OMPLA - H. pylori
bis AGS-Zellen zu haften, und es gab keine signifikanten Unterschiede in den morphologischen Veränderungen in die AGS-Zellen in Reaktion auf die Exposition gegenüber den beiden Varianten. Wir konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Genexpression zu identifizieren, zwischen den zu OMPLA exponierten Zellen + und OMPLA - Varianten zu jedem Zeitpunkt über die 24 h von Co-Kultur (p
< 0,05). Wir schlossen daraus, daher, dass die Analyse der Ergebnisse ohne weitere Berücksichtigung der Unterschiede in der Phasenvariation durchgeführt werden konnte. Figur 1 Immunofluorescence Bilder von AGS-Zellen zu H. pylori ausgesetzt. AGS-Zellen wurden nicht belichtete oder ausgesetzt OMPLA + und OMPLA- H. pylori
bei einer MOI von 300: 1 und co-kultiviert, 3 und 6 h. Die Bakterien wurden gefärbt mit Kaninchen-Anti-Helicobacter
Antikörper. Bilder wurden durch Fluoreszenzmikroskopie erfasst.
Die cDNA-Profil von H. pylori
AGS-Zellen ausgesetzt wurden verglichen gegenüber nicht-infizierten Kontrollzellen zu sechs separaten Zeitpunkten innerhalb von 24 h. 7498 Chip-Sonden zu 6237 menschliche Gene zeigten unterschiedliche Expression in den infizierten Zellen verglichen entsprechenden Zellen weniger an nicht zu kontrollieren als 1 Zeitpunkt (p
< 0. 05) (Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Die Anzahl der signifikant differentiell exprimierte Gene zu jedem Zeitpunkt im Vergleich zu nicht-infizierten AGS-Zellen und wie sie zu verschiedenen Zeitpunkten überlappen, werden in Tabelle 1 und Abbildung 1 2.Table Anzahl von differentiell regulierten Genen dargestellt
Time

0.5

1

3

6

12

24

Hochreguliert
0 2
91
123
1679
2997
herunterreguliert
0 seite 1 von 26
65
2034
2492
insgesamt
0
3
117
188
3713
5489
Anzahl der signifikant unterschiedlich regulierte Gene (p <
; 0,05)
Figur, die die Abtastzeitpunkte an jedem nach einer Zeit der Co-Inkubation von H. pylori
in AGS-Zellen 2 Venn-Diagramme von regulierten Genen signifikant. Venn-Diagramme von differentiell exprimierten Genen von H. pylori
-infizierten AGS-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen (p
< 0,05). Die sich schneidende Kreise zeigen überlappende Gene zu den angegebenen Zeitpunkten. AGS = nicht infizierte Kontrollzellen AGS.
Es wurden keine signifikant Gene bei 0,5 h ausgedrückt wird, eine moderate Erhöhung der Zahl von Genen, die 1 bis 6 h, und eine 20-fache Erhöhung 6-24 h. Von einem Abtastpunkt zum nächsten meisten Gene überlappen, jedoch eine beträchtliche Anzahl von einzigartigen Gene wurden ebenfalls geregelt differentiell zu jedem Zeitpunkt (Abbildung 2). Etwa 47% der Gesamtzahl von deutlich exprimierte Gene wurden hochreguliert, und 53% zeigten eine Herunterregulierung im Vergleich zur Kontrolle. Unter den mehr als 6000 signifikant exprimierten Gene, war IL-8
die einzelne differentiell exprimierte Gen (Abbildung 3). Abbildung 3 Hiarchical clustering der signifikant differentiell regulierter Gene. Hiarchical Clustering von signifikant unterschiedlich reguliert Gene (log2FC > 1,5, p
< 0,05). Der Pfeil zeigt auf IL-8
.
Die Liste aller signifikanten Gene wurde für assoziierte Kyoto Encyclopedia of Genen und Genomen (KEGG) Signalwege durch Pathway Express zu jedem Zeitpunkt analysiert. Deutlich beeinflusst Wege und sind in Tabelle 2 Frühzeitige Reaktion Signalwege vorgestellt Impact Factor (IF) entsprechen, die in der H. pylori
Infektionsweg, Zytokin-Zytokin-Rezeptor-Wechselwirkung, Toll-like Rezeptor signifikant beeinflusst wurden Signalisierung der Epithelzelle enthalten ( TLR) signal~~POS=TRUNC sowie viele krebsbezogenen Wege und immunologische Wege. Bei 1 h, IL-8
wurde in den meisten der betroffenen Signalwege beteiligt. Bei 3 und 6 h, die meisten der am höchsten bewerteten Bahnen hatten mehrere Gene gemeinsam, wie NFKB1, NFKB2, NFKBIA, NFKBIE, BIRC2, BIRC3, JUND, CCND1
und AKT3
. Die Phosphatidylinositol Signalisierungssystem wird eine hohe IF bei 6 h aufgrund der Bedeutung eines einzelnen Gens, PIK3C2B
zugewiesen, die durch ein Protokoll 2FC von -0,58 nach unten reguliert wird, und spielt eine Schlüsselrolle in diesem Weg. Nach 12 h waren die am stärksten betroffenen zellulären Wege der Leukozyten transendotheliale Migration, Zelladhäsionsmoleküle, DNA-Replikation Stoffwechselweg, p53-Signalweg sowie mehrere krebsbezogenen Wege. Relativ ähnliche Ergebnisse werden mit 24 h gesehen, jedoch sind einige der durch Krebs verursachten Wege dargestellt weiter unten in der Liste (Daten nicht nur gezeigt, 10 in 2 Tabelle oben) .Tabelle 2 Zeitlicher Verlauf: KEGG zelluläre Wege und Gen-Ontologie
Zeit
KEGG zellulären Weg Name
IF
up-regulierte Gene
GO

GO herunterreguliert Gene
0,5
keine signifikanten Gene keine signifikanten Gene
Keine signifikanten Gene

1 Epithelial Zellsignalgebung in Helicobacter-pylori-Infektion
16,6
Keine signifikante GO
Keine signifikanten Gene
Zytokin-Zytokin-Rezeptor-Wechselwirkung
8,1
Blasenkrebs
7.5
Toll-like-Rezeptor-Signalweg
6.6
Basis Exzision Reparatur
6.0
Primary Immunodeficiency
5.9
Pathways in der Krebs
5.4
3
Epithelial Zellsignalgebung in Helicobacter-pylori-Infektion
17,8
Anti-Apoptose
Keine signifikante GO
Pathways in der Krebs
16,9
Regulation von retroviralen Genoms kleinzelligem Lungenkrebs
14.2
Replikation
MAPK-Signalweg
14.2
T -helper 1 Zelldifferenzierung
Apoptosis
12,5
negative Regulation der LPS-vermittelten Signalweg
Adipozytokin Signalweg
12,3
negative Regulation der Migration glatter Muskelzellen Prostatakrebs
11.4
Regulierung der MAP-Kinase-Aktivität Chemotaxis
Toll-like-Rezeptor-Signalweg
11.1
Protein Aminosäure Dephosphorylierung
T-Zell-Rezeptor-Signalweg
10,5
Aktivierung von Neutrophilen
B-Zell-Rezeptor-Signalweg
9,9
Mitreißen von zirkadianen Uhr
6 Phosphatidylinositol Signalisierungssystem
32,2
Anti-Apoptose
Keine signifikante GO
Epithelial Zellsignalgebung in Helicobacter-pylori-Infektion
15.5
Regulation von retroviralen Genoms kleinzelligem Lungenkrebs
14.2
Replikation
Pathways in der Krebs
12,4
T-Helfer-1-Zelldifferenzierung

Apoptosis
11,6
Neutrophilenaktivierung
Adipozytokin Signalweg
10.1
negative Regulation von I-kappaB
Toll-like-Rezeptor-Signalweg
8,9
Kinase /NF -kB Kaskade
MAPK-Signalweg
8.7
Induktion positiver Chemotaxis
Blasenkrebs
8,5
myeloischen dendritischen Zelldifferenzierung
B-Zell-Rezeptor-Signalweg
8.3
12
Leukocyte transendothelialer Migration
309,7
Zellzyklusarrest
Reaktion auf ungefalteten Protein
Zelladhäsionsmoleküle (CAMs)
75,4
Aminosäure Transport
S-Adenosylmethionin Biosyntheseprozess
DNA-Replikation
25,0
positive Regulation der Transkription
Zellzyklus
20,0
Reaktion auf Stress
Pathways in der Krebs
19,4
Regulierung der MAP-Kinase Aktivität
p53-Signalweg
17,0
Antigen Verarbeitung und Präsentation
15,7
MAPK-Signalweg
13.2
kleinzelligem Lungenkrebs
12.2
Circadian Rhythmus
11,9
24
Leukocyte transendothelialer Migration
80,3
Differenzierung der Keratinozyten
Cholesterin-Biosynthese process
Zellzyklus
24,4
Aminosäure Transport
Reaktion auf ungefalteten Protein
p53-Signalweg
20,9
Verhornung
Isoprenoid Biosyntheseprozess
Circadian Rhythmus
18,6
Angiogenese
Creatin Biosyntheseprozess
DNA-Replikation
18,0
Apoptose
Reaktion auf oxidativen Stress
Adherens Kreuzung
16.1
Reaktion auf Stress
Pathways in der Krebs
14,9
Zellzyklusarrest
Nukleotidexzisionsreparatur
14,3
Pyrimidinnukleotids metabolischen
Ubiquitin vermittelten Proteolyse
14.2
Prozess
Phosphatidylinositol Signalisierungssystem
13,7
Induktion positiver Chemotaxis erheblich beeinträchtigt
zelluläre Wege KEGG und angereichert Gene Ontology Bedingungen ( biologische Prozesse nur) (p
< 0,05) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Co-Kultur von H. pylori
und AGS-Zellen. Top 10 Bahnen /Ontologien enthalten, wo Nummer 10 übersteigt IF = Impact-Faktor
Weil Analyse GO einfach differentiell exprimierte Gene mit den Ontologien verknüpft, da bei Ranking die wahre biologische Bedeutung einzelner Gene oder Ontologien nicht versucht wird. Aus diesem Grund wurden wir nur Gene mit einem log 2FC > 1.5 in der GO-Analyse, unter Ausschluss weniger Gene deutlich zum Ausdruck gebracht, die in fehlerhafte GO Ranking wahrscheinlich führen würde. Nur Begriffe unter biologischen Prozessen kategorisiert sind enthalten (2 Tabelle), da diese im Mittelpunkt der Studie waren. Keine GO Bedingungen wurden bei 0,5 oder 1 h Zeitpunkten angereichert. Unter den hochregulierten Gene bei 3-6 h, die am häufigsten assoziierten GOs waren anti-Apoptose und mehrere entzündliche und anti-mikrobielle Prozesse wie Regulierung von retroviralen Genomreplikation, T-Helfer-1-Zell-Differenzierung, Chemotaxis, Aktivierung von Neutrophilen und Immunaktivierung. Bei 12-24 h, die hochregulierte Gene angereichert Ontologien wie Zellzyklusarrest, Apoptose, Stressreaktion, Aminosäure Transport, Angiogenese und Verhornung, während bestimmte Biosyntheseprozesse gehören zu den nach unten reguliert Bedingungen.
Hierarchical Clustering von der 245 Gene mit einem log 2FC > 1,5 5 ausgebildet unterschiedliche Cluster (A-E), in einem Abstand von 0,54 Schwelle (Abbildung 3). Jeder Cluster wurde für GO und zellulären Signalweg Verbände (Tabelle 3) untersucht. GO-Analyse lieferten einen wichtigen Begriffe für alle Cluster (p
< 0,05). Tabelle 3 zeigt die Top-10 erheblich beeinträchtigt zelluläre Signalwege innerhalb der einzelnen Cluster, gereiht nach IF. Cluster A 9 enthaltenen Gene und demonstrierte stetigen Niveaus bei 6-12 h vor einem Rückgang zeigt. Drei Gene wurden in anti-apoptotischen Prozessen beteiligt und zwei Gene wurden in der MAPK Aktivität beteiligt. Nur drei Gene wurden Cluster B zugewiesen, wo es eine schnelle und starke Anstieg der Expression während der ersten 3 h, durch einen Rückgang gefolgt. Von den drei Gene im Cluster, IL-8
und CXCL2
schien viele der akuten entzündlichen Prozessen wie Chemotaxis, Immunantwort und Neutrophilen activation.Table 3 Cluster Profilierung zu diktieren: KEGG zelluläre Wege und Gene Ontology
Temporal Profil über 24 h
Cellular Pathway
Impact Factor
<
GO Zahl
br> GO Name
MAPK-Signalweg
7.3
GO: 0006916
anti-Apoptose
Apoptosis
7.1
GO: 0045063
T- Helfer-1-Zelldifferenzierung
GO: 0031665
negative Regulation von LPS-vermittelten Signalweg
GO: 0014912
negative Regulation der reibungslose Migration Muskelzelle
GO: 0043405
Regulierung der MAP-Kinase Aktivität bei
12.4 Epithelial Zellsignalgebung in H. pylori-Infektion

GO: 0006935
Chemotaxis
Zytokin-Zytokin-Rezeptor-Interaktion
10.2
GO: 0006954
Entzündungsreaktion
Blasenkrebs
6,8
GO: 0006955
Immunantwort
Toll-like-Rezeptor-Signalweg
5.9
GO: 0045091
Regulierung von retroviralen Genomreplikation
Pathways in Krebs 4.8
GO: 0042119
Neutrophilenaktivierung
GO: 0050930
Induktion positiver Chemotaxis
GO: 0030593
Neutrophilenchemotaxis
GO: 0030155
Regulierung der Zelladhäsion
GO: 0019722
Calcium-vermittelte Signalisierung
Circadian Rhythmus
20,0
GO: 0006915
Apoptose
MAPK Signal Weg
10,7
GO: 0006950
Antwort
mTOR Stress-Signalweg
7.5
GO: 0007050
Zellzyklusarrest
Tight Junctions
7.0
GO: 0030216
Differenzierung der Keratinozyten
Jak-STAT-Signalweg
6.7
GO: 0006865
Transport Aminosäure
Zytokin-Zytokin-Rezeptor-Interaktion
6.5
GO: 0031424
Verhornung
Verordnung von Autophagie
6.4
GO: 0008652
Aminosäure Biosyntheseprozess
p53-Signalweg
5.6
GO: 0006220
Pyrimidinnukleotids metabolischen Verfahren
Verordnung von
Aktinzytoskelett 5.2
TGF-beta-Signalweg
5.2
Natürliche Killerzellen-Zytotoxizität
4.7
Melanogenese
8.3
vermittelt GO: 0030146
Harnausscheidung
GnRH-Signalweg
7.6
GO: 0030147
natriuresis
ErbB-Signalweg
6.7
GO: 0048661
positive Regulierung der glatten Muskelzellproliferation
Pathways in der Krebs
6.4
GO: 0002268
follikulären dendritischen Zelldifferenzierung
Epithelial Zellsignalgebung in H. pylori-Infektion

5.7
GO: 0031583
Aktivierung der Phospholipase D-Aktivität von G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein Signalisierung
GO: 0014826
Vene Kontraktion der glatten Muskulatur
GO: 0002467
Keimzentren
GO: 0030578
PML Körper Organisation
GO: 0030195
negative Regulation der Blutgerinnung
GO: 0043507
positive Regulation der Aktivität Juni Kinase

Antigen Verarbeitung und Präsentation
13,7
GO : 0006695
Cholesterin-Biosynthese Prozess
MAPK-Weg
GO
9.7 Signalisierung: 0.006.986
Reaktion auf ungefalteten Protein
Blasenkrebs
6.2
GO: 0006916
anti -apoptosis
Pathways in der Krebs
6.1
GO: 0006139
Nukleobasen, -side, -tide und Nukleinsäurestoffwechselprozess
Regulation der Aktin-Zytoskelett
6.1
GO: 0008299
Isoprenoid Biosyntheseprozess
GO: 0006601
Kreatin Biosyntheseprozess
GO: 0009416
Reaktion auf Lichtreiz
GO: 0043154
negative Regulation von Caspase-Aktivität
GO: 0007566
Embryoeinpflanzung
Temporal Profile von 5 wichtigsten Cluster von hiarchical Clustering der 245 am meisten differentiell exprimierte Gene (p <
identifiziert; 0,05) und assoziierten Gens Ontologien (biologische Prozesse nur) und KEGG zelluläre Signalwege in jedem Cluster in der H. pylori
AGS-Zellen ausgesetzt. Datenpunkte bei 0,5, 1, 3, 6, 12 und 24 h Co-Inkubation. Fehlerbalken stellen ± Standardabweichung des Ausdrucks innerhalb des Clusters. Top 10 Ontologien aufgelistet, wo Nummer von mehr als 10
Cluster C umfasste die größte Cluster und enthielt 150 Gene, die keine Änderung erst nach 6-12 h zeigte. Die GO Begriffe Apoptose, Zellzyklusarrest und Stressantwort-Gene wurden deutlich angereichert, und viele dieser Gene wie Juni, GADD45A, DDIT3, MKNK2, DUSP1, RPS6KA5, FLNC
und RASGRP
auch in MAPK beteiligt waren Signalisierung. Darüber hinaus CSF2RA
, IL24
, IL20R
und das Onkogen PIM1
Jak-STAT-Signal und Zytokin-Cytokine Signaling beteiligt waren.
Cluster D einen moderaten Anstieg Spitzenwert von 12 h zeigte, durch eine Abnahme gegenüber 24 h gefolgt. 13 Gene wurden zu diesem Cluster zugeordnet sind, einschließlich EDN1
, einer der Isoformen des potenter Vasokonstriktor Endothelin, die praktisch alle aufgeführten GOS angereichert. NFKB2
, eine von zwei NF-kappaB-Untereinheiten, HBEGF
und ETS1
auch in diesem Cluster enthalten waren.
Cluster E demonstriert 71 Gene, die zeigten, Down-Regulation nach 6-12 h und enthalten FGFR3
und mehrere Hitzeschock-Protein-Gene, die in der MAPK-Signalweg und der Apoptose-Hemmung beteiligt waren. Auch mehrere GO wurden Biosyntheseprozesse angereichert.
Die Microarray-Ergebnisse zu bestätigen, haben wir uns für IL-8
, um zu überprüfen, da dies das einzige und differentiell-Gen in der Studie war. mRNA und Protein in den gleichen Zeitpunkten abgetastet wurden, und durch RT-PCR und ELISA untersucht (4 und 5). Es gab eine Zunahme der IL-8
mRNA spürbar nach 1 h und bei etwa 3 h kulminierend. Die IL-8
mRNA Antwort fiel dann in Richtung 6 und 12 h. Nach 24 h war ein zweiter Anstieg jedoch mit bemerkenswerten Abweichungen zwischen den beiden Experimenten. Bei 0,5 bis 1 h der Kokultur, IL-8-Protein-Spiegel waren gering und zeigten keine Veränderung. Zwischen 3 und 6 h der Kokultur, gab es eine signifikante Zunahme IL-8, die keinen weiteren Anstieg nach 6 h zeigte. Abbildung 4 Zeitverlauf der IL-8-mRNA-Expression in AGS-Zellen co-kultiviert mit H. pylori. Quantitative PCR-Analyse der IL-8
Expression in H. pylori
-infizierten AGS Zellen bei sechs verschiedenen Probenahmestellen über 24 h. Die Datenpunkte sind die Werte von drei Zellkultur vermehrt aus zwei unabhängigen Experimenten, A und B. Linien stellen den Mittelwert berechnet in jedem der Experimente.
Abbildung 5 Zeitverlauf der IL-8-Protein-Expression in AGS-Zellen co-kultiviert mit H. pylori. ELISA-Analyse der IL-8-Protein-Expression in H. pylori
-infizierten AGS Zellen bei sechs verschiedenen Probenahmestellen über 24 h. Die Datenpunkte sind die Werte von drei Zellkultur vermehrt aus zwei unabhängigen Experimenten, A und B. Linien stellen den Mittelwert berechnet in jedem der Experimente.
Schließlich wollten wir feststellen, dass die gewählte MOI war stabil im Hinblick auf AGS-Gen Ausdruck. Wir verwendeten IL-8
Antwort als Indikator für die Genexpression und AGS-Zellen wurden mit H. pylori
3 h bei verschiedenen MOI in zwei separaten Experimenten (Figur 6) co-inkubiert. Es gab eine geringe IL-8
Antwort bei MOI 15: 1 und 150: 1, mit einem bemerkenswerten Anstieg bei einer MOI von 300: 1. Es wurden dann vernachlässigbare Änderungen in IL-8-Expression
über 300: 1, die vorgeschlagen, dass das ursprüngliche Inokulum von 300: 1 ausreichend war, eine biologische Antwort hervorzurufen, ohne das Zellkultursystem zu überlasten. Figur 6 Dosis-Antwort von IL-8-mRNA-Expression in AGS-Zellen co-kultiviert mit H. pylori. Quantitative PCR-Analyse der IL-8
Expression in H. pylori
-infizierten AGS-Zellen, co-inkubiert für 3 h. Die Datenpunkte sind die Werte von drei Zellkultur vermehrt aus zwei unabhängigen Experimenten, A und B. Linien bedeuten die berechnete repräsentieren in jedem der Experimente.
Diskussion
In dieser Studie haben wir eine signifikante sofortige Antwort von AGS-Zellen demonstrieren auf die Exposition gegenüber einem
H. pylori aus einer klinischen Umgebung erhaltene Stamm. Mehr als 6000 menschliche Gene zeigte eine statistisch signifikante differentielle Regulation während der ersten 24 Stunden der Co-Inkubation.
H. pylori
Infektion wurde sowohl mit Stimulation und Hemmung der Apoptose assoziiert. Einige Zellkulturexperimente zeigen, Hochregulierung von Genen, die mit Apoptose assoziiert [7, 8], während einige in vivo-Studien zeigen, Proliferation und Apoptose Hemmung [9, 10]. VacA-Toxin wurde Apoptose in mehreren Studien gezeigt, um zu bewirken [30-33], während die Rolle von CagA widersprüchliche ist. CagA wurde sowohl mit Stimulation und Hemmung der Apoptose [11, 12, 34] verbunden. Biliäre Zellen zu CagA ausgesetzt
+
H. pylori
auf einem sehr niedrigen Inokulum (MOI 1: 1) erhöhte Zellwachstum nachgewiesen, während bei einer MOI von 200: 1, Apoptose angeregt wurde [35 ]. CagA kann die pro-apoptotische Wirkung von VacA direkt verärgern sogar, wie in AGS-Zellen beobachtet [31]. Apoptose tritt nach einer Anzahl von zellulären Ereignissen, die zu der Aktivierung von Caspase-3, die vermutlich die Grund Effektor der Apoptose darstellen. In der vorliegenden Studie wurden die beiden hemmenden und stimulierenden Gene zeigten eine signifikante differentielle Expression, die Komplexität des Einflusses von H. pylori
auf die Apoptose zeigen: Caspase-Inhibitoren HSPA5
und DHCR24
ähnlich zeigte spät Herunterregulierung als Wärme Schockgene HSPA1B, HSPB1
, die auch mit Apoptose Stimulation (cluster E, Tabelle 3) zugeordnet sind. Auf der anderen Seite, TNFAIP3, BIRC2, BIRC3
und SERPINB2
, auch mit Apoptose-Hemmung verbunden sind, zeigten frühe und anhaltende Hochregulation zusammen in Cluster A. gruppiert jedoch positive Regulatoren der Apoptose PTPRH, TNFRSF12A, IL24, GADD45A, TRIB3, DDIT4, PHLDA4, PP1R15A
und SQSTM1 alle länder in ähnlichen Muster hochreguliert waren nach 6-12 h (Cluster C). MCL1
, ein anti-apoptotischen Gens in Reaktion auf CagA Injektions exprimiert [11] demonstrierten zunehmende Hochregulierung über den Verlauf der Studie. Es gab keine signifikanten Veränderungen in der BCL-2
und sehr geringe Erhöhung der BAX
Ausdruck in unserer Studie, zwei wichtige Gene, die die Empfindlichkeit der Zellen auf andere apoptotische Stimuli [36-39] bestimmen. Bemerkenswert war es Hochregulierung von TP53BP2
markiert, einem wichtigen Tumorsuppressor-Gen (TSG) in menschlichen Krebs, hauptsächlich p53 Förderung von Apoptose Gene stimulieren. Auf der anderen Seite wird Codierungs TP53BP2
ASPP2 Protein, das die Apoptose unabhängig von p53 [40-42] zu stimulieren auch gezeigt worden ist. Jedoch Buti et al. kürzlich gezeigt, dass CagA in Magenepithelzellen injiziert gezielte ASPP2 Protein p53-vermittelte Apoptose [12] zu hemmen. Die erhöhte TP53BP2
Ausdruck in unserer Studie gesehen, könnte daher diesen Effekt potenziert durch die CagA-ASPP2 Interaktion zunehmende p53-vermittelte Apoptose zu verursachen erhöhte Hemmung. In der Tat zeigte die aktuelle Studie, dass p53-Zielgene in der Apoptose beteiligt [43] wie FAS
, DR4
, TNFRSF10B
(auch bezeichnet als DR5 /KILLER
), DCR1
, DCR2
, P53AIP1
, CASP6
, APAF1
und BNIP3L
zeigten keine signifikanten Anstieg und BNIP3L
, CASP6
und APAF1
, BID
und BAX
nur wenig zunahmen. p53-Zielgene regulieren nicht apoptotischen zelluläre Prozesse einschließlich MDM2
, GADD45A
, CDKN1A
(auch bekannt als P21 WAF1 /CIP1
), EGFR
, CCND1
, CCNG2
und TGFA
moderate nachgewiesen hoch~~POS=TRUNC gekennzeichnet. Diese differentielle Genexpression zwischen den p53-Zielgene in dieser Studie identifiziert, kann darauf hindeuten, selektive Hemmung der p53-vermittelten Apoptose aufgrund der erhöhten CagA-ASPP2 Wechselwirkung, im Einklang mit Buti Feststellungen.
Trotzdem wurde diese Studie nicht beurteilen, ob die entworfen Gesamtsumme von inhibitorischen und stimulatorische Signale erleichtert Apoptose oder die Proliferation von Epithelzellen. Die aktuellen Ergebnisse veranschaulichen die Komplexität der Regulation der Apoptose in Epithelzellen in Reaktion auf H. pylori
Belichtung und der Cluster-Analyse legt nahe, dass es eine biologische Koordination der Genexpression reguliert Apoptose. Dies kann ein Teil des komplexen karzinogen Mechanismus von H. erklären in einem Adenokarzinom des Magens pylori
. Es gibt starke Assoziation zwischen H. pylori
infecton, insbesondere der CagA
+ Genotyp [44], und Adenokarzinom des Magens [45, 46], und auch andere Krebsarten vorgeschlagen wurden, für eine Rolle zu beherbergen H. pylori
[47, 48]. [29]. 0,05.

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