Up-regulatie van CLDN1 bij maagkanker is gecorreleerd met een verminderde survival

up-regulatie van CLDN1 bij maagkanker is gecorreleerd met een verminderde overleving
Abstracte achtergrond
De genetische veranderingen in adenocarcinoom zijn uiterst complex en betrouwbaar tumormarkers zijn nog niet geïdentificeerd. Er zijn ook opmerkelijk geografische verschillen in de verdeling van deze ziekte. Ons doel was om de meest differentieel gereguleerde genen in 20 maag adenocarcinomen identificeren van een Noorse selectie, in vergelijking met aangepaste normale slijmvlies, en we hebben onze bevindingen aan de prognose, survival en chronische Helicobacter pylori
infectiegerelateerde.
Methods
biopten van gastrische adenocarcinomen en aangrenzend normaal maagslijmvlies werden verkregen van 20 patiënten onmiddellijk na chirurgische resectie van de tumor. Gehele genoom, cDNA microarray-analyse werd uitgevoerd op RNA geïsoleerd uit het monster paren om de genexpressieprofielen te vergelijken tussen de tumor tegen gematched mucosa. De monsters werden microscopisch onderzocht om gastritis classificeren. De aanwezigheid van H. pylori
werd onderzocht met behulp van microscopie en immunohistochemie.
Resultaten
130 genen bleek differentiële regelgeving boven een vooraf gedefinieerde cut-off-niveau. Interleukine-8 (IL-8
) en Claudin-1 (CLDN1
) de meest consequent-gereguleerde genen in de tumoren. Zeer hoge CLDN1
expressie in de tumor werd geïdentificeerd als een onafhankelijke en significante voorspeller gen verminderde postoperatieve overleving. Er waren duidelijk verschillende expressie profielen tussen de tumor en de controlegroep slijmvlies-groep, en de histologische subgroepen van gemengd type, diffuse type en intestinale soort kanker aangetoond verdere sub-clustering. Up-gereguleerde genen in kaart gebracht tot cel-adhesie, collageen-gerelateerde processen en angiogenese, terwijl de normale intestinale functies, zoals de spijsvertering en uitscheiding werden geassocieerd met down-gereguleerde genen. We relateren de huidige bevindingen aan onze vorige studie over het gen respons van maag epitheelcellen om H. pylori
infectie.
Conclusies
CLDN1
was zeer up-gereguleerd in maagkanker en CLDN1
expressie werd onafhankelijk geassocieerd met een slechte prognose postoperatieve en kan belangrijke prognostische waarde hebben. IL-8 Kopen en CLDN1
kunnen de centrale banden tussen het gen respons gezien in acute H. pylori
infectie van de maag epitheelcellen, en uiteindelijk maagkanker te vertegenwoordigen.
Sleutelwoorden
Maagkanker Interleukine 8 Claudin-1 Helicobacter pylori
cDNA microarray Survival Prognose Achtergrond
Maagkanker (GC) is slechts tweede tot en longkanker in world-wide-kanker gerelateerde sterfgevallen, maar er zijn grote geografische verschillen in GC distributie. Gegevens uit 2010 tonen aan dat de GC incidentie in Noorwegen is zeer laag (mannen 6,9, vrouwen 3,0 per 100.000) [1] ten opzichte van de minder ontwikkelde gebieden, met name in Oost-Azië, waar de incidentie is ongeveer 6-voudig (mannen 42,4, vrouwen 18,3 per 100.000) [2].
Maagdarmkanker is opmerkelijk heterogeen genetisch, cytologisch en architectonisch in vergelijking met andere gastro-intestinale carcinomen. De zoektocht naar een betrouwbare tumormarkers en consistente prognostische indicatoren is moeilijk gebleken. Verschillende auteurs hebben getracht GC ziekte en de prognose voorspellen op basis van één of meerdere genen [3-8], maar er zijn verschillen tussen de studies en geen gen handtekening of biomarkers routinematig klinisch gebruik. Inzicht in de mechanismen van maagkanker is één van de grootste uitdagingen bij kanker genomics. De Lauren classificatie verdeelt adenocarcinomen in drie verschillende histologische subtypes: darm- en diffuse types en een gemengde variant [9], die worden verondersteld om verschillende paden van carcinogenese te nemen. De intestinale type is toe te schrijven aan een meerstaps progressie van chronische gastritis door middel van maag-atrofie, metaplasie, dysplasie en uiteindelijk kwaadaardige ziekte [10]. Diffuse types kunnen voortvloeien uit chronische ontsteking zonder
een duidelijke uiting van tussenliggende premalignant stappen [11-13]. Het gemengd type toont niet-homogene mengsels van zowel darm- en diffuse soort architectuur, en kan een aparte categorie van kanker met exclusieve genmutaties en een meer agressieve natuurlijk [14, 15] vertegenwoordigen. Ondanks uitgebreid onderzoek naar de genetische veranderingen van GC, de mechanismen die ten grondslag liggen aan de ziekte zijn nog verre van begrepen, en de ziekte kan niet gemakkelijk worden verklaard door een adenoom-carcinoom model zoals bij colorectale kanker. Er zijn drie moleculaire mechanismen die de maag carcinogenese rijden: Chromosome instabiliteit, microsatelliet instabiliteit en epigenetische veranderingen [16]. Het netto resultaat is de activering van oncogenen, inactivatie van tumor suppressor genen en deregulering van signaaltransductiewegen [11, 12]. Afwijkende regulering van de celcyclus en veranderingen in de expressie van groeifactoren en cytokines reguleren differentiatie en overleving van tumorcellen. Mutaties cel-adhesie en angiogene genen een belangrijke rol spelen bij het invasieve en metastatische gedrag van GC cellen.
Het doel van dit onderzoek was het meest differentieel gereguleerde genen in chirurgisch weggesneden adenocarcinoom identificeren vs. Gematchte normale mucosa hand whole genome cDNA microarray profilering. We proberen ook om genen die GC prognose en overleving beïnvloeden identificeren. De resultaten worden vergeleken met de maag epitheelcel gen respons op H. pylori
infectie, die werd geanalyseerd in een eerder gepubliceerde document [17]. Dit onderzoek geeft steun aan de betekenis van IL-8 Kopen en CLDN1
in maagkanker, en toont belangrijke genetische veranderingen in GC en hun mogelijke relevantie voor H. pylori infectie
.
Methods
Tissue en patiëntkenmerken
werden verkregen van patiënten met non-cardia adenocarcinoom van de maag in de endoscopie polikliniek van Akershus University Hospital, Noorwegen. Thoraco-abdominale computed tomography imaging werd uitgevoerd aan patiënten met metastatische ziekte uit te sluiten. 20 patiënten met zowel intestinale als diffuse type GC opgenomen. Patiënten en klinisch-pathologische kenmerken zijn weergegeven in tabel 1. Bij de toelating voor een geplande operatie, geschreven, geïnformeerde toestemming voor deelname aan het onderzoek werd verkregen van de deelnemers. Binnen 5 minuten na het verwijderen van de OG chirurgische specimen werden monsters genomen van zowel de tumor grens en gezonde gastrische mucosa corpal binnen dezelfde maagstreek maar meer dan 5 cm van de tumor, en opgeslagen op RNAlater
(Applied Biosystems , VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA). Alle monsters werden opgeslagen bij + 4 ° C gedurende ongeveer 1-2 weken om volledige penetratie van RNAlater
kan vóór monsters werden gedroogd en permanent opgeslagen in -80 ° C. Alle monsterverzameling en behandeling werden uitgevoerd door dezelfde individual.Table 1 patiëntkenmerken en klinisch-pathologische kenmerken van de 20 maag tumoren die in de studie
Sex
Vrouwtjes n = 5, n = 15 mannetjes
etniciteit
Kaukasische n = 18, Azië n = 2
Leeftijd bij chirurgie
Totaal: 68,7 jaar (± 12,5)
Teven: 65,7 jaar (± 21,8)
Mannen: 69,7 jaar (± 8,6)
Postoperatieve overleving (overleden personen)
Totaal: 13,2 maanden (± 8,8)
vrouwen (n = 4): 16,6 maanden (± 6.4)
mannen (n = 10): 12,0 maanden (± 9.7 )
Postoperatieve overleving (levend personen aan onderzoek end)
Totaal: 45,8 maanden (± 7.9)
vrouwen (n = 1): 48,0 maanden
mannen (n = 5): 44,9 maanden (± 8.8)
tumorgrootte
49 mm (± 27)
Tumor stadium
T1 2
T2
10 | T3
5
T4
3
Nodal stadium
N0
10 | N1
5
N2
3
N3 2
histologische soort
Intestinale
5
Diffuse
12
Mixed
3
Patient kenmerken en klinisch-pathologische kenmerken van de 20 maag tumoren gebruikt in het onderzoek. Waarden zijn het gemiddelde plus /minus de standaarddeviatie.
Na resectie van de tumor, werd het belangrijkste monster tot histolopathological onderzoek onderworpen door twee pathologen senior bevestiging van de diagnose en classificeren van de tumor volgens de indeling Lauren [9]. Antrale en corpal maagslijmvlies onderzocht op gastritis, atrofie en metaplasie en de aanwezigheid of afwezigheid van H. pylori
microscopisch onderzocht en vervolgens geïdentificeerd door immunohistochemie. De bijgewerkte Sydney System werd gebruikt voor het classificeren en de rang van de mate van gastritis [18, 19]. Ondernemingen De studie werd goedgekeurd door de Noorse Regionaal Comité voor Medische en Health Research Ethics (REC Zuid-Oost). Alle monsters en patiëntgegevens werd gecodeerd en verblind vóór de analyse.
RNA-isolatie, kwaliteitscontrole en cDNA-synthese
Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van de RNeasy bloed en weefsel kit (Qiagen Gmbh, Duitsland) volgens de fabrikant standaard bereidingsprotocol . RNA-concentratie en kwaliteit werden bepaald met een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer (NanoDrop Technologies, USA) en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA). Het RNA integriteit aantal was voldoende voor cDNA-synthese. Ondernemingen De Illumina TotalPrep RNA-amplificatie kit (Ambion Inc., USA) werd gebruikt om RNA te amplificeren voor hybridisatie op Illumina BeadChips. Eerst streng cDNA te synthetiseren door middel van reverse transcriptie, gebruikten we totaal RNA uit elk van de hierboven verzamelde monster. Na de tweede streng cDNA synthese cDNA en zuiveringsstappen, de in vitro transcriptie
synthetiseren cRNA werd overnacht voorbereid 12 uur.
Oligonucleotide cDNA microarray analyse
genexpressieprofielen werden gemeten met Illumina Human HT-12 v3 Expression BeadChip (Illumina, USA), die genoom-wijde expressie analyse stelt (48.800 transcripten, overeenkomend met ongeveer 37.800 genen) van 12 monsters aan een enkele microarray. 35.967 van de probes werden ontworpen met behulp van de RefSeq (build 36.2, laat 22) bibliotheek en 12,837 probes werden afgeleid uit de UniGene (build 199)-database [20, 21].
Immunohistochemie
De aanwezigheid van H. pylori
in de chirurgische monsters werd geanalyseerd met behulp van een polyklonaal anti-Helicobacter
-antibody (Dako, Denemarken, code B0471, verdunning 1: 200). 4 pm secties van met formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel van niet-tumor mucosa werden aangebracht op gecoate objectglaasjes. Deparaffinisatie, rehydratatie en epitoop werden uitgevoerd in een Dako PT Link (Dako, Denemarken) bij 97 ° C gedurende 20 min. De immunokleuring procedure werd uitgevoerd in een Dako Autostainer Plus het toepassen van de Envision ™ Flex, hoge pH-systeem (Dako, Denemarken) uitgevoerd.
Bio-informatica en statistiek
R /Bioconductor [22, 23] met het pakket BeadArray [24] werden gebruikt voor de voorbewerking van microarray tekstgegevens van BeadStudio. Ruimtelijke artefacten werden verwijderd met behulp van BASH [25] voor de uitdrukking gegevens waren log 2-getransformeerd en kwantiel genormaliseerd. De log 2 voudige verandering (FC) van elke probe aan de matrix binnen elk weefsel paren (tumor versus aangepast normale mucosa) werd vervolgens berekend en de gegevens werden in de J-express softwarepakket [26] geladen. Rank test product [27] werd vervolgens uitgevoerd om te testen of de differentiële expressie tussen tumorweefsel en gekoppeld normale mucosa was significant. De differentiële expressie werd significant verklaard indien de aangepaste p-waarde, dat wil zeggen de FDR Q-waarde, was minder dan 0,05. Hiërarchische clustering werd uitgevoerd met behulp van de gemiddelde linkage en Euclidische afstandsmaat. De analyses werden uitgevoerd met behulp van de J-express softwarepakket [26] Belgique Om een ​​redelijk grote lijst van de meest differentieel tot expressie van genen, in mindere uitgedrukt genen werden gefilterd bij een cutoff niveau van FC >te produceren.; 1.5, het produceren van een lijst van de 130 meest differentieel tot expressie van genen. Deze dataset werd geïmporteerd in Onto-Express en Pathway Express [28, 29], een deel van de Onto-Tools software suite, voor functionele analyse, en gegroepeerd in Gene Ontology (GO) termen en KEGG (Kyoto Encyclopedie van Genen en Genomen) cellulaire signaalwegen [30]. Express route berekent een Impact Factor (IF) die wordt gebruikt om de betreffende signaalwegen rangschikken, gebaseerd op de veelvoudverandering, het aantal van de betrokken genen in de route, en de hoeveelheid verstoring van stroomafwaartse genen [31].
de dataset werd in PASW Statistics (SPSS versie 18.0.2) aangegaan om bivariate correlatie analyse uit te voeren van genen die geassocieerd met klinische en pathologische parameters te selecteren. Zowel Pearson en Spearman correlatie coëfficiënten werden gebruikt om te correleren genen te identificeren. Onder de genen die gecorreleerd zijn, waren we vooral geïnteresseerd in degenen die een soortgelijke uitdrukking in onze eerder gepubliceerde studie van de H. pylori
-exposed de maag epitheelcellen [17] liet zien. De geselecteerde genen werden vervolgens onderworpen aan een Cox multivariate regressie-analyse om te onderzoeken of een van de genen waren onafhankelijke voorspellers van postoperatieve overleving in de GC patiënten, onafhankelijk van weefseltype, tumorstadium en grootte, nodale ziekte en leeftijd bij chirurgie. In het ene predictor gen dat werd geïdentificeerd, werden verschillende cut-off levels toegepast op hoge en lage expressie niveaugroepen te bouwen, voordat statistische significantie tussen de groepen werd beoordeeld met behulp van een log-rank (Mantel-Cox) te testen. Een Kaplan-Meier survival plot is gemaakt om het verschil in overleving tussen de hoge en lage expressie groepen aan te tonen. Ondernemingen De microarray gegevens zijn beschikbaar onder de toetreding nummer E-MTAB-1440 in de ArrayExpress databank [32].
Resultaten
genexpressie
hele genoom expressie profilering van 20 geëvenaard maagtumor monsters werd uitgevoerd met behulp van cDNA microarrays. Rank product statistische testen [27] van de log 2 voudige verandering (FC) expressie waarden van ongeveer 38.000 genen op de microarray chip onthuld 2297 genen die waren significant up-gereguleerd en 2259 genen die aanzienlijk waren down-gereguleerd in de tumor weefsel in vergelijking met aangepaste normale slijmvlies (p < 0,01). De 130 gefilterde genen die differentieel werd geregeld door een gemiddelde FC > 1,5 zijn weergegeven in Tabel 2, en de dataset die nadere analyse uitgevoerd vormt. Van de meest differentieel gereguleerde genen, 30 genen aangetoond up-regulering en 100 genen werden down-gereguleerd. IL-8
was de meest opgereguleerd gen opwaarts gereguleerd in 18 of 20 weefsel paren met een gemiddelde FC van 2,6 (figuur 1), gevolgd door COL1A1 Kopen en CLDN1
(Figuur 2 ). De meest down-gereguleerd gen was PGA4
, die opmerkelijk down-gereguleerd in 18 van de 20 weefsel paren, gevolgd door GIF Kopen en ATP4A
. Hiërarchische clustering van de dataset (Figuur 3) toonden dat de tumor en controle weefsel gevormd duidelijk verschillende genexpressie clusters. In de tumor cluster, de verschillende histologische categorieën diffunderen, intestinale en gemengde kanker vormden bijna uitsluitend afzonderlijke clusters, waaruit nauwe genetische gelijkenis binnen elk van de histologische subgroepen. Onder de controle weefsels, en onder de H. pylori
positieve personen, geen specifieke clustering was seen.Table 2 De meest differentieel gereguleerde genen in de maag tumor tov controle slijmvlies
Up-gereguleerde genen (n = 30)

stads gereguleerde genen (n = 100)
Gene symbool
Gemiddeld FC
Gene symbool
Gemiddeld FC

Gene symbool
Gemiddeld FC
Gene symbool
Gemiddeld FC
IL-8
2,58
PGA4
-5.58
MAL
-2.22
AKR7A3
-1.79
COL1A1
2.18
GIF
-5.48
SCNN1B
-2.22
KIAA1324
-1,79
CLDN1
2.14
ATP4A
-5.28
SOX21
-2.22
CCDC121
-1.78
SPP1
2.09
PGA3
-4.72
CAPN9
-2.21
FBP2
-1.76
CLDN2
2.09
ATP4B
-4.71
AGXT2L1
-2.20
FCGBP
-1.75
CEACAM6
2.09
PGA5
-4.34
HDC
-2.18
ORM2
-1.75
SERPINB5
2.06
LIPF
-3.91
GSTA1
-2.18
FAM3B
-1.73
KRT17
2,00
CPA2
-3.78
KLK11
-2.12
TRIM50
-1.73
H19
1.94
GHRL
-3.75
APLP1
-2.12
DUOX1
-1.72
CLDN7
1,93
GKN2
-3.26
MT1H
-2.09
RAP1GAP
-1.70
TFF3
1.92
KCNE2
-3.19
ADH1C
-2.09
EEF1A2
-1.70
OLFM4
1.91
SST
-3.12
DPCR1
-2.06
ANGPTL3
-1.70
THBS2
1.91
CHGA
-3.02
AKR1B10
-2.03
B3GAT1
-1.69
PI3
1.90
PSCA
-3.00
MT1G
-2.03
C6ORF105
-1.68
SULF1
1.89
CHIA
-2.88
CKB
-2.01
FGG
-1.68
BGN
1.82
GKN1
-2.88
SH3GL2
-1.99
ADA
-1,65
KRT6B
1.80
KCNJ16
-2.82
REP15
-1.97
C6ORF58
-1.63
THY1
1.72
GC
-2.66
CKM
-1.95
ZNF533
-1.60
MMP11
1.70
CLIC6
-2.65
FGA
-1.95
RPESP
-1.59
KLK6
1.67
SOSTDC1
-2.53
SLC9A4
-1.92
MT1F
-1.58
SERPINA3
1.65
ESRRG
-2.52
MFSD4
-1.92
PNPLA7
-1.57
FNDC1
1.64
CCKBR
-2.51
ALDOB
-1.89
FUT9
-1.57
COL1A2
1.63
TMED6
-2.44
SCNN1G
-1.87
RPRM
-1.56
CST1
1.63
MT1M
-2.44
IRX2
-1.87
GUCA2B
-1.56
FAP
1.60
Gper
-2,43
SLC26A9
-1.87
TCN1
-1.55
COL6A3
1.60
CKMT2
-2.36
CLCNKA
-1.87
PKIB
-1.55
SFRP4
1.56
VSIG2
-2.36
CAPN13
-1.86
SLC9A2
-1,55
TMEM158
1,53
FLJ42875
-2,33
TTR
-1,86
Homer2
-1,53
MMP7
1,50
CXCL17
-2.32
GSTA2
-1.85
AKR1C4
-1.50
MMP10
1.50
CA9
-2.32
NKX6-2
-1.83
REG3A
-1.50
AKR1C2
-2,27
CA2
-1,83
PI16
-1,50
ALDH3A1
-2,24
FOLR1
-1,82
MAP7D2
- 1.50
SCGB2A1
-2,23
RDH12
-1,81
AQP4
-2,24
IRX3
-1,80
differentieel gereguleerde genen met gemiddeld log2FC van > 1,5 (n = 130). geëxtraheerd uit gehele genoom expressie. Gemiddelde log2FC mate dat ze elk gen zijn opgenomen. Negen genen. vetgedrukt weergegeven. tonen een overeenkomstige regeling in zowel de huidige studie en een eerdere studie waarin maagepitheelcellen werden blootgesteld aan H. pylori
[17].
Figuur 1 Interleukin-8 genexpressie in maagtumoren versus gematchte controle mucosa. De doorgetrokken lijn geeft de relatieve verhouding van IL-8
expressie in tumorweefsel vergeleken met gematchte controlegroep maagslijmvlies, zoals de log2 voudige verandering (log2 tumor /controle expressie niveaus). Een positieve score duidt op een hogere expressie in de tumor vergeleken met de normale maagslijmvlies. IL-8
was het meest consistent opwaarts gereguleerd gen in de studie. De grijze achtergrond geeft de expressie van ongeveer 37 800 andere genen.
Figuur 2 Claudin 1 genexpressie in maagtumoren versus gematchte controle mucosa. De vaste lijn vertegenwoordigt relatieve verhouding van CLDN1
uitdrukking in het tumorweefsel vergeleken met gematchte controlegroep maagslijmvlies, zoals de log2 voudige verandering (log2 tumor /controle expressie niveaus). Een positieve score duidt op een hogere expressie in de tumor vergeleken met de normale maagslijmvlies. De grijze achtergrond geeft de expressie van ongeveer 37 800 andere genen.
Figuur 3 hiërarchische clustering van de genexpressie van 20 maagtumoren en controle mucosa. Hele genoom expressie van 20 tumor /control tissue paren werden gefilterd om een ​​dataset met daarin de 130 meest differentieel gereguleerde genen te produceren. De meeste tumormonsters geclusterd los van de controlemonsters. De diffuse soort tumor samples zijn gemarkeerd in licht grijs, de intestinale type medium grijs en het gemengde type donkergrijs tot de subclustering van de drie verschillende histologische types kanker te illustreren.
Genen van de huidige dataset werden cross-vergeleken met de meest differentieel gereguleerde genen geïdentificeerd in onze eerdere studie, waarbij maagepitheelcellen werden blootgesteld aan H. pylori
gedurende 24 uur in vitro
[17]. Beide H. pylori
-exposed de maag epitheelcellen en de tumor biopten vertoonden een significante up-regulatie van vijf gemeenschappelijke genen (IL-8, CLDN1, KRT17, CLDN7 Kopen en MMP7
) en down-regulatie van vier gemeenschappelijke genen (gper, KIAA1324, ADA Kopen en SLC9A2
).
Gene ontologie
Vervolgens wordt de dataset van de 130 meest differentieel gereguleerde genen werd geanalyseerd op functionele annotatie met behulp van GO termen (tabel 3). Onder de 30 genen opgereguleerd, celadhesie processen, in het bijzonder calcium-onafhankelijke adhesie van cellen, waren de meest verrijkte termen. Verder synthetische processen zoals huid morfogenese en bloedvatontwikkeling, evenals zowel katabole en synthetische collageen processen behoren tot de belangrijke voorwaarden geïdentificeerd. Slechts een kleiner deel van de naar beneden gereguleerde genen werden toegewezen aan specifieke ontologieën in vergelijking met de up-gereguleerde genen, waar de spijsvertering en uitscheiding waren de meest verrijkt voorwaarden. Verschillende metabole processen, pH-regulering en cobalamine en ionentransport werden ook aanzienlijk verrijkt GO termen tussen de-down gereguleerde genen (tabel 4) .table 3 Gene ontologie verenigingen in up-gereguleerde genen
P-waarde
geen van genen die betrokken zijn
% van de genen die betrokken zijn
Gene ontologie
GO: aantal
0.00066
3
10,0
Calcium -onafhankelijke cel-cel adhesie
GO: 0016338
0,0007 2
6,67
Skin morfogenese
GO: 0.043.589
0.023
5
16.67
celadhesie
GO: 0007155
0.023 2
6,67
Collageen katabool proces
GO: 0.030.574
0.023 2
6,67
Collageen fibril organisatie
GO: 0030199
0.027 2
6,67
Bloedvat development
GO:0001568
0.042
1
3.33
Copulation
GO:0007620
0.042
1
3.33
Regulation retrovirale genoom replicatie
GO: 0045870
0,042 1
3,33
Responsen op corticosteroïden stimulus
GO: 0.031.960
0,042 1
3,33
tand mineralisatie
GO: 0034505
Aanzienlijk verrijkt Gene Ontology termen in de up-gereguleerde genen uit de dataset
Tabel 4 Gene ontologie verenigingen in down-gereguleerde genen
P-waarde
Geen van genen die betrokken zijn
% van de genen die betrokken zijn
Gene ontology

GO:number

0.0
8
7.41
Digestion
GO:0007586
0.00011
5
4.63
Excretion
GO:0007588
0.0005
3
2.78
Creatine stofwisselingsproces
GO: 0006600
0,0019
3
2,78
Cellular aldehyde stofwisselingsproces
GO: 0.006.081
0,0043
3
2,78
Verordening van pH
GO: 0006885
0.013 2
1.85
Cobalamin vervoer
GO: 0.015.889
0,015
9
8.33
Ion transport
GO:0006811
0.015
2
1.85
Secretion
GO:0046903
0.015
2
1.85
Cobalt ion transport
GO: 0006824
0,02013 2
1.85
Morphogenesis van een epitheel
GO: 0.002.009
Aanzienlijk verrijkt Gene Ontology termen in de naar beneden gereguleerde genen uit de dataset .
KEGG cellulaire signaalwegen Ondernemingen De dataset werd vervolgens geanalyseerd op KEGG cellulaire signaleringsroute verenigingen. 11 van de 30 opgereguleerd genen werden afgebeeld op 8 significante KEGG trajecten (p < 0,05). Met name de celadhesiemoleculen (CAM) route en migratie van leukocyten pathway werden een hoge impact factor toegewezen, door de sterke opwaartse regulatie van CLDN1, CLDN7
en Thy1
genen en de hoge relatieve invloed van deze genen op de cAM route. IL-8, COL1A1, COL1A2, THBS2, SPP1, COL6A3 Kopen en sFRP4
werden toegewezen aan een aantal zeer beïnvloed trajecten: de migratie van leukocyten, extracellulaire matrix receptor interactie, tight junction, epitheliale cell signaling in H. pylori
infectie, TGFp signaleringsroute, toll-like receptor signalering en Wnt-signalering (tabel 5). Geen van de 100 down-gereguleerde genen in kaart gebracht aan significante KEGG pathways.Table 5 KEGG cellulaire signaalwegen
Rank
Pathway naam
IF
P-waarde
1
celadhesiemoleculen (CAM)
734,0
0,000129 2
de migratie van leukocyten
672,1
0,000879
3
ECM receptor interactie
10,9
0,00215 verhuur 4
tight junction
10,6
0,000296
5
epitheliale cell signaling in Helicobacter
7.2
0,006
6
TGF-beta signaleringsroute
6.3
0,013
7
Focal hechting
6.2
0,014
8
Calcium signaleringsroute
5.1
0.035
Aanzienlijk verrijkt KEGG cellulaire signaalwegen in de dataset (p < 0,05). Impact Factor (IF) wordt gebruikt om de betreffende signaalwegen rangschikken, gebaseerd op de veelvoudverandering, het aantal van de betrokken genen in de route, en de hoeveelheid verstoring van stroomafwaartse genen.
Klinisch-pathologische correlatie
Onder de totale set van de 130 meest differentieel gereguleerde genen, de FC expressie van 20 genen toonde significante correlatie met de postoperatieve overleving, 8 genen gecorreleerd met histologische type, de 5 genen gecorreleerd met de grootte van de tumor, en 1-gen gecorreleerd met lymfeklier fase (Extra-bestand 1 ). Sommige genen toonde correlatie met meerdere parameters. Door de gematigde monstergrootte (n = 20), een significantieniveau van p < 0,01 werd gekozen.
Cox multivariate analyse van de genen in verband met postoperatieve overleving aangetoond dat een hoge CLDN1
expressie niveau was de enige onafhankelijke voorspeller gen van postoperatieve overleving. CLDN1
expressie en covariaten tumorgrootte positieve lymfklier fractie, weefseltype, geslacht en leeftijd bij chirurgie werden in een lineaire regressiemodel opgenomen (Tabel 6), blijkt dat alleen CLDN1 Kopen en positieve lymfklier fractie waren significant voorspellers van postoperatieve overleving. Wanneer alle niet-significant determinanten wanneer verwijderd, was er een sterkere negatieve correlatie tussen CLDN1
expressie en postoperatieve overleving (R = -0,7, p < 0,001). Er waren geen significante associatie tussen CLDN1
expressie en Lauren indeling, H. pylori
infectie, etniciteit, grootte van de tumor of gemetastaseerde lymfeklieren status.Table 6 Factoren die de overleving na een operatie voor maagkanker
Co-variate

Correlatiecoëfficiënt R
P-waarde
CLDN1
expressie (log2 fold change)
-0,53
0.008
Lymfeklier fractie
-0,46
0,016
tumorgrootte
-0,27
0,186
Leeftijd bij chirurgie
-0,13
0,491
histologische type (intestinale type)
-0,03
0,888
mannelijk geslacht
-0,05
0,792
lineaire regressie-analyse van meerdere factoren die van invloed postoperatieve overleving bij patiënten die een chirurgische ingreep voor maagkanker. Belgique Om verschillen in post-operatieve detecteren overleving tussen individuen met hoge en lage CLDN1
tot expressie brengen tumoren werden verschillende cut-off niveaus gebruikt voor hoge expressie en lage expressie groepen maken. Met behulp van de CLDN1
FC gemiddelde (FC gemiddelde = 2,14) als de groep divider, hoge en lage expressie CLDN1
patiënten vertoonden verschillende patronen overleving (p < 0,001), zoals geïllustreerd in de Kaplan-Meier-curve Figuur 4. Figuur 4 Kaplan Meier plot van de patiënten met resected maag tumoren. De vaste lijn vertegenwoordigt onder het gemiddelde CLDN1
tot expressie brengen tumoren (FC < 2.14) en de gestippelde lijn bovengemiddeld CLDN1
tot expressie brengen tumoren (FC > 2,14). 6 patiënten in de lage CLDN1
tot expressie brengen groep nog in leven waren aan het einde van de studie periode, zoals blijkt uit de vaste lijn verticale tics.
Histopathologisch kenmerken van aangrenzende niet-kanker slijmvlies
Van de 20 gematched mucosa specimens, 10 vertoonden tekenen van niet-atrofische gastritis en 10 aangetoond multifocale atrofische gastritis. Intestinale metaplasie werd gescoord 1-3 in het antrum en corpus gebieden van de monsters. Type de intestinale tumoren waren significant geassocieerd met zowel atrofische gastritis en intestinale metaplasie (p < 0,001), terwijl de diffuse soort tumoren werden geassocieerd met niet-atrofische gastritis (p < 0,001). Zowel histologische en immunohistochemische bewijs van H. pylori
werden aangetoond in de mucosa tegenhanger van 1 1 darm- en diffuus soort kanker (figuren 5 en 6), zowel bij blanke patiënten. De overige 18 monsters vertoonden geen bewijs van H. pylori
. Er waren geen significante verschillen tussen soorten kanker, soorten gastritis, of de aanwezigheid van H. pylori
enerzijds, en de correlatie met de genexpressie van CLDN1
of IL-8
. Figuur 5 Histologische doorsnede van H. pylori geïnduceerde niet-atrofische chronische gastritis. De pijl wijst op een gebied van actieve ontsteking met karakteristieke granulocytaire infiltratie in de crypte epitheel.
Figuur 6 Immunohistologische bewijs van H. pylori. H. pylori werd ontdekt in 2 van de 20 monsters mucosa. Het monster uit figuur 5 is onderworpen aan een immunohistochemie door anti-Helicobacter
-antibody, kleuring H. pylori
bruin. Discussion
In deze studie identificeerden we CLDN1
als een van de constantst up-gereguleerde genen in GC en een sterke correlatie tussen up-regulatie van CLDN1 Kopen en verminderde overleving bij 20 patiënten met maag adenocarcinomen. Deze correlatie is nog sterker gecorrigeerd voor andere parameters zoals lymfeklieren stadium, tumorgrootte en histologische type. Onze klinische steekproefomvang is klein, maar de resultaten zijn consistent.
Claudins zijn eiwitten die betrokken zijn bij cellulaire tight junctions en zijn belangrijk voor de handhaving van normale epitheel, met name barrièrevorming, celpolariteit en signaaltransductie. Ontregeling van deze genen zijn geïdentificeerd in verschillende kankers. Gebaseerd op tumorbiologie, neerwaartse regulatie van CLDN1
zou leiden tot vernietiging van tight junctions en verlies van cel-cel adhesie veroorzaakt tumorprogressie [33], maar de klinische significantie van maagkanker is complex. Er zijn aanwijzingen dat een aantal van de Claudins, CLDN1
opgenomen, tonen toenemende niveaus als de maag epitheel ontwikkelt tot metaplasie en vroege maagcarcinoom [34] intestinale. CLDN1
kunnen beïnvloeden intracellulaire signalering, aangetoond door Liu et al. die aantoonde dat verhoogde expressie van CLDN1 in borstkankercellen bijgedragen aan een anti-apoptotisch effect via twee mechanismen: inhibitie van caspase-8 klieving en activatie van de Wnt /β-catenine signaalroute [35]. CLDN1 is geïdentificeerd in de kern van maagkanker AGS cellen in vitro
, suggereert een regulerende rol van CLDN1 op celproliferatie, migratie en invasiviteit op een nucleair niveau [36]. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Integratieve rol van transformerende groeifactor-α in de celbescherming mechanismen van maagslijmvlies
• Vereniging van thiazolidinedionen met maagkanker in type 2 diabetes mellitus: een populatie-gebaseerde case-control studie