Opregulering af CLDN1 i mavekræft er korreleret med reduceret overlevelse

Opregulering af CLDN1 i mavekræft er korreleret med nedsat overlevelse
Abstract
Baggrund
De genetiske ændringer i gastrisk adenocarcinom er ekstremt endnu ikke er blevet identificeret komplekse og pålidelige tumormarkører. Der er også bemærkelsesværdige geografiske forskelle i fordelingen af ​​denne sygdom. Vores mål var at identificere de mest varierende regulerede gener i 20 gastriske adenokarcinomer fra en norsk udvalg, sammenlignet med matchede normal slimhinde, og vi har relateret vores resultater til prognose, overlevelse og kronisk Helicobacter pylori
infektion.
Metoder
Biopsier fra gastriske adenokarcinomer og tilstødende normale maveslimhinden blev opnået fra 20 patienter umiddelbart efter kirurgisk resektion af tumoren. Hele genomet, blev cDNA microarray analyse udført på RNA isoleret fra prøven par for at sammenligne genekspressionsprofilerne mellem tumoren mod matchede slimhinde. Prøverne blev mikroskopisk undersøgt for at klassificere gastritis. Tilstedeværelsen af ​​H. pylori
blev undersøgt under anvendelse mikroskopi og immunhistokemi.
Resultater Salg 130 gener viste differentiel regulering over en foruddefineret skæringsniveau. Interleukin-8 (IL-8
) og Claudin-1 (CLDN1
) var den mest konsekvent opreguleret gener i tumorerne. Meget høj CLDN1
udtryk i tumoren blev identificeret som en selvstændig og væsentlig prædiktor gen af ​​reduceret postoperativ overlevelse. Der var tydeligt forskellige udtryk profiler mellem tumor og kontrolgruppen slimhinde gruppen, og de histologiske undergrupper af blandet type, diffuse type og tarm typen kræft demonstrerede yderligere sub-klyngedannelse. Up-regulerede gener blev kortlagt til celle-vedhæftning, kollagen-relaterede processer og angiogenese, mens normale tarmfunktion såsom fordøjelse og udskillelse var forbundet med ned-regulerede gener. Vi relaterer de nyeste resultater til vores tidligere undersøgelse om gen respons af gastriske epitelceller til H. pylori
infektion.
Konklusioner
CLDN1
var meget opreguleret i mavekræft, og CLDN1
ekspression blev uafhængigt forbundet med en dårlig postoperativ prognose, og kan have vigtige prognostisk værdi. IL-8
og CLDN1
kan repræsentere centrale forbindelser mellem genet respons ses i akut H. pylori
infektion af gastriske epitelceller, og i sidste ende mavekræft.
Nøgleord
mavekræft interleukin 8 claudin-1 Helicobacter pylori
cDNA microarray Survival Prognose Baggrund
mavekræft (GC) er kun sekunder til lungekræft i verdensomspændende kræftrelaterede dødsfald, men der er store geografiske forskelle i GC distribution. Data fra 2010 viser, at GC forekomst i Norge er meget lav (hanner 6,9, hunner 3,0 per 100.000) [1] i forhold til mindre udviklede områder, især i Østasien, hvor forekomsten er ca. 6 gange (hanner 42,4, hunner 18.3 pr 100.000) [2].
gastrisk adenocarcinom er bemærkelsesværdigt heterogen genetisk, cytologisk og arkitektonisk sammenlignet med andre gastrointestinale carcinomer. Søgningen efter pålidelige tumormarkører og konsekvente prognostiske indikatorer har vist sig vanskeligt. Flere forfattere har forsøgt at forudsige GC sygdom og prognose baseret på en enkelt eller flere gener [3-8], men der er uoverensstemmelser mellem undersøgelserne, og i øjeblikket ingen gen signatur eller biomarkører er i rutinemæssig klinisk brug. Forståelse af mekanismerne bag mavekræft er en af ​​de store udfordringer i kræft genomforskning. Den Lauren klassifikationen inddeler adenokarcinomer i tre forskellige histologiske undertyper: tarm og diffuse typer, og en blandet variant [9], som menes at tage forskellige veje for carcinogenese. Tarmens typen skyldes en flertrins progression af kronisk gastritis gennem gastrisk atrofi, metaplasi, dysplasi og i sidste ende ondartet sygdom [10]. Diffuse typer kan opstå kronisk inflammation uden
en klar manifestation af mellemliggende præmaligne trin [11-13]. Den blandet type viser ikke-homogene blandinger af både tarm- og diffus art arkitektur, og kan udgøre en særskilt kræft kategori med eksklusive genmutationer og en mere aggressiv kurs [14, 15]. På trods af omfattende forskning i de genetiske ændringer i GC, mekanismerne bag sygdommen stadig er langt fra forstået, og sygdommen kan ikke let forklares ved en adenom-carcinom model ligesom i kolorektal cancer. Der er tre molekylære mekanismer, der driver gastrisk carcinogenese: Kromosom ustabilitet, mikrosatellit ustabilitet og epigenetiske ombygninger [16]. Nettoresultatet er aktivering af onkogener, inaktivering af tumorsuppressorgener og deregulering af signalveje [11, 12]. Aberrant cellecyklusregulering og ændringer i ekspressionen af ​​vækstfaktorer og cytokiner regulerer differentiering og overlevelse af tumorceller. Mutationer af celle-adhæsion og angiogene gener spiller en vigtig rolle i den invasive og metastatiske adfærd GC celler.
Formålet med nærværende undersøgelse var at identificere de mest differentielt regulerede gener i kirurgisk resektion gastrisk adenocarcinom i forhold til matchede normal slimhinde, ved anvendelse hele genomet cDNA microarray profilering. Vi forsøger også at identificere gener, der har indflydelse GC prognose og overlevelse. Resultaterne er sammenlignet med den gastriske epitelcelle gen respons på H. pylori
infektion, som blev analyseret i en tidligere offentliggjort dokument [17]. Denne undersøgelse tilføjer understøttelse til betydningen af ​​IL-8
og CLDN1
i gastrisk carcinogenese, samt demonstrerer vigtige genetiske ændringer i GC og deres mulige relevans for H. pylori
infektion.
Metoder
Tissue og patientkarakteristika
Biopsier blev opnået fra patienter diagnosticeret med non-Cardia gastrisk adenocarcinom ved endoskopi ambulatoriet ved Akershus Universitetssygehus, Norge. Thoraco-abdominal computertomografibilleddannelse blev foretaget for at udelukke patienter med metastatisk sygdom. 20 patienter med både tarm- og diffuse former for GC blev medtaget. Patienter og klinisk-patologiske egenskaber er vist i tabel 1. På optagelse til elektiv kirurgi, skrevet, blev informeret samtykke til deltagelse i undersøgelsen opnået fra deltagerne. Inden for 5 minutter af fjernelse af de vigtigste kirurgiske prøve, blev der udtaget prøver fra både tumor grænse og fra sunde gastrisk corpal slimhinde inden for samme maven område, men mere end 5 cm fra tumoren, og lagres på RNAlater
(Applied Biosystems , USA). Alle prøver blev opbevaret i + 4 ° C i ca. 1-2 uger for at tillade fuldstændig vævsgennemtrængning af RNAlater
, før prøverne blev tørret og lagres permanent i -80 ° C. Alt erhvervelse og håndtering prøve blev udført af de samme individual.Table 1 Patient karakteristika og klinisk-patologiske træk ved de 20 gastriske tumorer, der anvendes i undersøgelsen
Sex
Hunner n = 5, hanner n = 15
Etnicitet
kaukasiske n = 18, asiatiske n = 2
Alder ved kirurgi
Total: 68,7 år (± 12,5)
Kvinder: 65,7 år (± 21,8)
Hanner: 69,7 år (± 8,6)
Postoperativ overlevelse (afdøde personer)
Total: 13,2 måneder (± 8,8)
Hunner (n = 4): 16,6 måneder (± 6,4)
Hanner (n = 10): 12,0 måneder (± 9,7 )
Postoperativ overlevelse (levende individer ved undersøgelsens afslutning)
Total: 45,8 måneder (± 7,9)
Hunner (n = 1): 48,0 måneder
mænd (n = 5): 44,9 måneder (± 8.8)
Tumor størrelse
49 mm (± 27)
Tumor fase
T1
2
T2
10
T3
5
T4
3
Nodal etape
n0
10
N1
5 fotos N2
3
N3
2
Histologisk typen
Intestinal
5
Diffuse
12
Blandet
3
Patient karakteristika og klinisk-patologiske træk ved de 20 gastriske tumorer, der anvendes i undersøgelsen. Værdier er middelværdien plus /minus standardafvigelsen.
Efter resektion af tumoren, blev de vigtigste prøve udsættes for histolopathological undersøgelse af to senior specialist patologer at bekræfte diagnosen og klassificere tumor i henhold til Lauren klassifikationen [9]. Antral og corpal gastrisk mucosa blev undersøgt for gastritis, atrofi og metaplasi, og tilstedeværelsen eller fraværet af H. pylori
blev undersøgt mikroskopisk og efterfølgende identificeret ved immunohistokemi. Den Opdateret Sydney System blev brugt til at klassificere og kvalitet graden af ​​gastritis [18, 19].
Undersøgelsen blev godkendt af det norske regionale udvalg for medicin og sundhed Etik (REC South East). Alle prøver og patientdata blev kodet og blindet før analysen.
RNA-isolering, kvalitetskontrol og cDNA-syntese
Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af RNeasy blod og væv (Qiagen GmbH, Tyskland) ifølge producentens standard forberedelse protokol . RNA koncentration og kvalitet blev bestemt ved hjælp af en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies, USA) og Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA). RNA integritet nummer var passende for cDNA-syntese.
Illumina TotalPrep RNA-amplifikation Kit (Ambion Inc., USA) blev anvendt til at amplificere RNA til hybridisering på Illumina BeadChips. For at syntetisere første streng cDNA ved revers transkription anvendte vi totalt RNA fra hver prøve indsamlet ovenfor. Efter den anden streng cDNA-syntese og cDNA-oprensningstrin, in vitro
transkription at syntetisere cRNA blev fremstillet natten over i 12 timer.
CDNA oligonucleotid microarray analyse
genekspressionsprofilerne blev målt ved anvendelse Illumina human HT-12 v3 Expression BeadChip (Illumina, USA), som giver hele genomet ekspressionsanalyse (48800 transkripter, svarende til ca. 37800 gener) af 12 prøver parallelt på en enkelt microarray. 35967 af sonderne blev designet ved hjælp af RefSeq (bygge 36,2, frigive 22) bibliotek og 12.837 prober blev afledt fra UniGene (bygge 199) database [20, 21].
Immunhistokemi
Tilstedeværelsen af ​​H. pylori
i de kirurgiske prøver blev analyseret under anvendelse af et polyklonalt anti-Helicobacter
-antistof (Dako, Danmark, kode B0471, fortynding 1: 200). 4 um sektioner af formalin-fikseret, paraffinindstøbt væv fra ikke-tumorform slimhinde blev anvendt på coatede objektglas. Afparaffinering, rehydrering og epitopgenfinding blev udført i et Dako PT Link (Dako, Danmark) ved 97 ° C i 20 minutter. Proceduren for immunfarvning blev udført i en Dako Autostainer Plus anvende Envision ™ Flex, High pH-system (Dako, Danmark).
Bioinformatik og statistik
R /BioConductor [22, 23] med pakken Beadarray [24] blev anvendt til forbehandling af microarray tekstdata fra BeadStudio. Rumlige artefakter blev fjernet ved hjælp af BASH [25], før udtrykket data var log 2-transformeret og fraktil normaliseret. Loggen 2 gange ændring (FC) af hver probe på arrayet inden hvert væv par (tumor vs matchet normal mucosa) blev derefter beregnet, og dataene blev fyldt i den J-express softwarepakke [26]. Nummer produkt test [27] blev dernæst udført for at teste, om den differentielle ekspression mellem tumorvæv og matches normal slimhinde var betydelig. Den differentielle ekspression blev erklæret signifikant, hvis den justerede p-værdi, dvs. FDR q-værdi, var mindre end 0,05. Hierarkisk klyngedannelse blev udført ved hjælp af gennemsnitlige kobling og Euklidiske afstand foranstaltning. Analyserne blev udført ved hjælp af J-express softwarepakke [26]
At producere en rimelig størrelse liste over de mest differentielt udtrykte gener, mindre udtrykte gener blev filtreret ud på en cutoff niveau FC >.; 1.5, der producerer en liste over de 130 mest differentielt udtrykte gener. Dette datasæt blev importeret til Onto-Express og Pathway Express [28, 29], en del af Ind på-Tools softwarepakke, til funktionel analyse, og grupperet i Gene Ontology (GO) vilkår og Kegg (Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer) cellulære signalveje [30]. Pathway Express beregner en Impact Factor (IF), som anvendes til at rangere de berørte signalveje, baseret på fold ændring, antallet af de involverede gener i pathway'en, og mængden af ​​forstyrrelser i nedstrøms gener [31].
datasættet blev indgået PASW Statistik (SPSS udgave 18.0.2) at udføre bivariate korrelationsanalyse at vælge gener, der er forbundet med klinisk-patologiske parametre. Både Pearson og Spearman korrelationskoefficienter var ansat til at identificere korrelerende gener. Blandt gener, der korrelerede, vi var især interesseret i dem, der viste en lignende udtryk i vores tidligere offentliggjort undersøgelse af H. pylori
-exposed gastriske epitelceller [17]. De udvalgte gener blev derefter underkastet en Cox multivariat regressionsanalyse at undersøge, hvorvidt nogen af ​​de gener var uafhængige prædiktorer for postoperativ overlevelse i GC patienter uafhængigt af histologisk type, tumor fase og størrelse, nodal sygdom og alder ved kirurgi. I det ene forudsigelse gen, der blev identificeret, var forskellige afskæringsværdier niveauer anvendes til at konstruere høje og lave ekspressionsniveau grupper, inden statistisk signifikans mellem grupperne blev vurderet ved anvendelse af en log-rank (Mantel-Cox) test. En Kaplan-Meier overlevelse plot blev oprettet for at demonstrere forskellen i overlevelse mellem høj og lav-udtryk grupper.
Den microarray data er tilgængelige under tiltrædelsen nummer E-mtab-1440 i ArrayExpress databasen [32].
Resultater
Genekspression
hele genomet ekspression profilering af 20 matchede gastriske tumorprøver blev udført under anvendelse af cDNA microarrays. Rank produkt statistisk test [27] af loggen 2 gange ændring (FC) udtryk værdier på ca. 38000 gener på mikroarraychippen afslørede 2297 gener, der var betydeligt opreguleret og 2259 gener, der var betydeligt nedreguleret i tumoren væv sammenlignet med matchede normal mucosa (p < 0,01). De 130 filtrerede gener, der differentielt blev reguleret af en gennemsnitlig FC > 1.5 er anført i tabel 2, og udgør datasættet, hvor der udføres yderligere analyse. Af de mest differentielt regulerede gener, viste 30 gener opregulering og 100 gener blev nedreguleret. IL-8
var den mest opreguleret gen, opreguleret i 18 af 20 væv parvis med en gennemsnitlig FC på 2,6 (figur 1), efterfulgt af COL1A1
og CLDN1
(figur 2 ). Den mest nedreguleret gen var PGA4
, være bemærkelsesværdigt nedreguleret i 18 af 20 væv par, efterfulgt af GIF
og ATP4A
. Hierarkisk klyngedannelse af datasættet (figur 3) viste at tumoren og kontrol væv dannet tydeligt forskellige genekspression klynger. I tumoren klynge, de forskellige histologiske kategorier diffunderer, intestinal og blandet cancer dannet næsten eksklusive individuelle klynger, hvilket viser tæt genetisk lighed inden for hver af de histologiske undergrupper. Blandt kontrol- væv, og blandt H. pylori
positive individer, ingen særlig klyngedannelse var seen.Table 2 De differentielt regulerede gener i gastrisk tumor vs kontrol mucosa Salg opreguleret gener (n = 30)

Down-regulerede gener (n = 100)
Gene symbol
Gennemsnitlig FC
Gene symbol
Gennemsnitlig FC

Gene symbol
Gennemsnitlig FC
Gene symbol
Gennemsnitlig FC
IL-8
2,58
PGA4
-5.58
MAL
-2.22
AKR7A3
-1.79
COL1A1
2.18
GIF
-5.48
SCNN1B
-2.22
KIAA1324
-1,79
CLDN1
2,14
ATP4A
-5.28
SOX21
-2.22
CCDC121
-1.78
SPP1
2.09
PGA3
-4.72
CAPN9
-2.21
FBP2
-1.76
CLDN2
2.09
ATP4B
-4.71
AGXT2L1
-2.20
FCGBP
-1.75
CEACAM6
2.09
PGA5
-4.34
HDC
-2.18
ORM2
-1.75
SERPINB5
2.06
LIPF
-3.91
GSTA1
-2.18
FAM3B
-1.73
KRT17
2.00
CPA2
-3.78
KLK11
-2.12
TRIM50
-1.73
H19
1.94
GHRL
-3.75
APLP1
-2.12
DUOX1
-1.72
CLDN7
1,93
GKN2
-3.26
MT1H
-2.09
RAP1GAP
-1.70
TFF3
1.92
KCNE2
-3.19
ADH1C
-2.09
EEF1A2
-1.70
OLFM4
1.91
SST
-3.12
DPCR1
-2.06
ANGPTL3
-1.70
THBS2
1.91
CHGA
-3.02
AKR1B10
-2.03
B3GAT1
-1.69
PI3
1.90
PSCA
-3.00
MT1G
-2.03
C6ORF105
-1.68
SULF1
1.89
CHIA
-2.88
CKB
-2.01
FGG
-1.68
BGN
1.82
GKN1
-2.88
SH3GL2
-1.99
ADA
-1,65
KRT6B
1.80
KCNJ16
-2.82
REP15
-1.97
C6ORF58
-1.63
THY1
1.72
GC
-2.66
CKM
-1.95
ZNF533
-1.60
MMP11
1.70
CLIC6
-2.65
FGA
-1.95
RPESP
-1.59
KLK6
1.67
SOSTDC1
-2.53
SLC9A4
-1.92
MT1F
-1.58
SERPINA3
1.65
ESRRG
-2.52
MFSD4
-1.92
PNPLA7
-1.57
FNDC1
1.64
CCKBR
-2.51
ALDOB
-1.89
FUT9
-1.57
COL1A2
1.63
TMED6
-2.44
SCNN1G
-1.87
RPRM
-1.56
CST1
1.63
MT1M
-2.44
IRX2
-1.87
GUCA2B
-1.56
FAP
1.60
GPER
-2,43
SLC26A9
-1.87
TCN1
-1.55
COL6A3
1.60
CKMT2
-2.36
CLCNKA
-1.87
PKIB
-1.55
SFRP4
1.56
VSIG2
-2.36
CAPN13
-1.86
SLC9A2
-1,55
TMEM158
1,53
FLJ42875
-2,33
TTR
-1,86
HOMER2
-1,53
MMP7
1,50
CXCL17
-2.32
GSTA2
-1.85
AKR1C4
-1.50
MMP10
1.50
CA9
-2.32
NKX6-2
-1.83
REG3A
-1.50
AKR1C2
-2,27
CA2
-1,83
PI16
-1,50
ALDH3A1
-2,24
FOLR1
-1,82
MAP7D2
- 1,50
SCGB2A1
-2,23
RDH12
-1,81
AQP4
-2,24
IRX3
-1,80 Salg Differentielt regulerede gener med gennemsnitlig log2FC af > 1,5 (n = 130). ekstraheret fra hele genomet ekspression. Gennemsnitlige log2FC niveauer svarende til hvert gen, er vist. Ni gener. vist med fed skrift. demonstrerede lignende regulering i både den aktuelle undersøgelse og i en tidligere undersøgelse, hvor gastriske epitelceller blev udsat for H. pylori
[17].
Figur 1 Interleukin-8 genekspression i gastriske tumorer vs matchet kontrol slimhinde. Den faste linie repræsenterer det relative forhold af IL-8
ekspression i tumorvæv sammenlignet med tilsvarende kontrolgruppe maveslimhinden, som log2 gange ændring (log2 tumor /kontrol ekspressionsniveauer). Et positivt resultat indikerer en højere ekspression i tumoren sammenlignet med den normale gastriske mucosa. IL-8
var den mest konsekvent opreguleret gen i undersøgelsen. Den grå baggrund er udtryk for omkring 37 800 andre gener.
Figur 2 Claudin 1 genekspression i gastriske tumorer vs matchet kontrol slimhinde. Den faste linie repræsenterer relative forhold CLDN1
ekspression i tumorvævet sammenlignet med tilsvarende kontrolgruppe maveslimhinden, som log2 gange ændring (log2 tumor /kontrol ekspressionsniveauer). Et positivt resultat indikerer en højere ekspression i tumoren sammenlignet med den normale gastriske mucosa. Den grå baggrund er udtryk for omkring 37 800 andre gener.
Figur 3 Hierarkisk klyngedannelse af genekspressionen af ​​20 gastriske tumorer og kontrol mucosa. Hele genomet ekspression af 20 tumor /kontrol væv par blev filtreret til frembringelse af et datasæt indeholder de 130 mest differentielt regulerede gener. De fleste tumor prøver klynger adskilt til kontrolprøverne. De diffuse typen tumorprøver er fremhævet i lysegrå, at den intestinale type medium grå og blandet i mørkegrå illustrere subclustering af de tre forskellige histologiske typer kræft.
Gener fra den aktuelle datasæt blev cross-matchet mod fleste differentielt regulerede gener identificeret i vores tidligere undersøgelse, hvor gastriske epitelceller blev udsat for H. pylori
i 24 timer in vitro
[17]. Både H. pylori
-exposed gastriske epitelceller og tumor biopsier viste signifikant opregulering af fem fælles gener (IL-8, CLDN1, KRT17, CLDN7
MMP7
) og nedregulering af fire fælles gener (GPER, KIAA1324, ADA
SLC9A2
).
Gene ontologi
Dernæst datasættet af de 130 mest differentielt regulerede gener blev analyseret for funktionel kommentering hjælp GO vilkår (tabel 3). Blandt de 30 up-regulerede gener, celle-adhæsionsprocesser, særlig calcium-uafhængig celle-celle-adhæsion, var blandt de mest højt beriget termer. Desuden syntetiske processer som huden morfogenese og udvikling blodkar, samt både kataboliske og syntetiske kollagen-relaterede processer var blandt de væsentlige vilkår identificeret. Kun en mindre del af de ned-regulerede gener blev kortlagt til specifikke ontologier i forhold til de op-regulerede gener, hvor fordøjelse og udskillelse var de mest berigede vilkår. Adskillige metaboliske processer, pH-regulering og cobalamin og ion transport blev også væsentligt beriget GO vilkår blandt de ned-regulerede gener (Tabel 4) .table 3 Gene ontologi foreninger i up-regulerede gener
P-værdi
ingen af ​​gener involveret
% af gener involveret
Gene ontologi
GO: nummer
0,00066
3
10,0
Calcium -uafhængige celle-celle adhæsion
GO: 0016338
0,0007
2
6,67
hud morfogenese
GO: 0.043.589
0,023
5
16.67
celleadhæsion
GO: 0007155
0,023
2
6,67
Collagen kataboliske proces
GO: 0.030.574
0,023
2
6,67
Collagen fibril organisation
GO: 0030199
0.027
2
6,67
Blodkar development
GO:0001568
0.042
1
3.33
Copulation
GO:0007620
0.042
1
3.33
Regulation af retroviral genom replikation
GO: 0045870
0,042
1
3.33
Responsen til kortikosteroid stimulus
GO: 0.031.960
0,042
1
3,33
Tand mineralisering
GO: 0034505
Markant beriget Gene ontologi vilkår i de up-regulerede gener fra datasættet
Tabel 4 Gene ontologi foreninger i ned-regulerede gener
P-værdi
Ingen af ​​gener involveret
% af gener involveret
Gene ontology

GO:number

0.0
8
7.41
Digestion
GO:0007586
0.00011
5
4.63
Excretion
GO:0007588
0.0005
3
2.78
Creatine metaboliske proces
GO: 0006600
0,0019
3
2,78
Cellular aldehyd metaboliske proces
GO: 0.006.081
0,0043
3
2,78
Regulering af pH
GO: 0006885
0,013
2
1.85
Cobalamin transport
GO: 0.015.889
0,015
9
8.33
Ion transport
GO:0006811
0.015
2
1.85
Secretion
GO:0046903
0.015
2
1.85
Cobalt ion transport
GO: 0006824
0,02013
2
1.85
Morfogenese af en epitel
GO: 0002009
Markant beriget Gene ontologi vilkår i de ned-regulerede gener fra datasættet .
Kegg cellulære signalveje
datasættet blev derefter analyseret for Kegg cellulære signalvej foreninger. 11 af de 30 opreguleret gener blev kortlagt til 8 signifikante Kegg pathways (p < 0,05). Især celleadhæsionsmolekyler (CAM) vej og leukocyt transendotelial migration sti blev tildelt en stor effekt faktor, på grund af den stærke opregulering af CLDN1, CLDN7
, og Thy1
gener, og den høje relative effekt af disse gener på CAM-vejen. IL-8, COL1A1, COL1A2, THBS2, SPP1, COL6A3
SFRP4
blev kortlagt til flere stærkt påvirket veje: leukocyt transendothelial migration, ekstracellulær matrix-receptor interaktion, tight junction, epitelial cellesignalering i H. pylori
infektion, TGFp-signalvejen, toll-like receptor signalering og Wnt-signalering (tabel 5). Ingen af ​​de 100 ned-regulerede gener blev kortlagt til væsentlige Kegg pathways.Table 5 Kegg cellulære signalveje
Rank
Pathway navn
HVIS
P-værdi
1
Cell adhæsionsmolekyler (CAMs)
734,0
0,000129
2
leukocyt transendothelial migration
672,1
0,000879
3
ECM receptor interaktion
10,9
0,00215
4
Tight junction
10,6
0,000296
5
epitelcelle signalering i Helicobacter
7.2
0,006
6
TGF-beta signalvejen
6,3
0,013
7
Focal vedhæftning
6,2
0,014
8
Calcium signalvejen
5.1
0,035
Markant beriget Kegg cellulære signalveje i datasættet (p < 0,05). Impact Factor (IF) bruges til at rangordne de berørte signalveje, baseret på fold ændring, at antallet af de involverede gener i vejen, og mængden af ​​forstyrrelse af nedstrøms gener.
Klinisk-patologisk korrelation
Blandt det samlede sæt af de 130 mest differentielt regulerede gener, FC ekspressionsniveauer af 20 gener viste signifikant korrelation med postoperativ overlevelse, 8 gener korrelerede med histologisk type, 5 gener korreleret med tumorstørrelse, og 1-genet korreleret med lymfeknude etape (Supplerende fil 1 ). Nogle gener viste korrelation med mere end én parameter. På grund af den moderate stikprøvestørrelse (n = 20), et signifikansniveau på p < 0,01 blev valgt.
Cox multivariat analyse af gener associeret med postoperativ overlevelse viste, at en høj CLDN1
ekspressionsniveau var den eneste uafhængige prædiktor gen af ​​postoperativ overlevelse. CLDN1
udtryk og kovariater tumorstørrelse, positiv lymfeknude fraktion, histologisk type, køn og alder ved kirurgi blev indgået en lineær regressionsmodel (tabel 6), hvilket viser, at kun CLDN1
og positiv lymfeknude fraktion var signifikante prædiktorer for postoperativ overlevelse. Når alle ikke-signifikante determinanter hvor fjernet, var der en stærkere negativ korrelation mellem CLDN1
udtryk og postoperativ overlevelse (R = -0,7, p < 0,001). Der var ingen signifikant sammenhæng mellem CLDN1
udtryk og Lauren klassificering, H. pylori
infektion, etnicitet, tumorstørrelse eller metastatisk lymfeknude status.Table 6 Faktorer, der påvirker overlevelse efter operation for mavekræft
Co-variate

Korrelationskoefficient R
P-værdi
CLDN1
udtryk (log2 fold ændring)
-0,53
0,008
Lymfeknude fraktion
-0,46
0,016
Tumor størrelse
-0,27
0,186
Alder ved kirurgi
-0,13
0,491
Histologisk type (intestinal type)
-0,03
0,888
Mand køn
-0,05
0,792
Lineær regressionsanalyse af flere faktorer, der påvirker postoperativ overlevelse hos patienter opereret for mavekræft.
at detektere forskelle i postoperativ overlevelse mellem individer med høj og lav CLDN1
udtrykkende tumorer blev forskellige cut-off niveauer udnyttes til at skabe høj-udtrykkende og lav-udtrykkende grupper. Brug af CLDN1
FC middelværdi (FC betyde = 2.14), da gruppen divider, høj og lav udtrykker CLDN1
patienter viste signifikant forskellige overlevelse mønstre (p < 0,001) som illustreret i Kaplan-Meier plot i Figur 4. Figur 4 Kaplan Meier overlevelse plot af patienter med reseceret gastriske tumorer. Det faste linje repræsenterer under gennemsnittet CLDN1
udtrykkende tumorer (FC < 2.14) og den stiplede linje repræsenterer over gennemsnittet CLDN1
udtrykkende tumorer (FC > 2.14). 6 patienter i den lave CLDN1
udtrykkende gruppe var stadig i live ved slutningen af ​​undersøgelsesperioden, hvilket fremgår af den fuldt optrukne linje lodret tics.
Histopatologiske funktioner i tilstødende ikke-kræft slimhinde
Af de 20 matchede mucosa prøver, 10 viste tegn på ikke-atrofisk gastritis, og 10 viste multifokal atrofisk gastritis. Intestinal metaplasi blev scoret blandt 1-3 i antrum og corpus områder af prøverne. De intestinale typen tumorer blev signifikant associeret med både atrofisk gastritis og tarm metaplasi (p < 0,001), mens de diffuse typen tumorer blev forbundet med ikke-atrofisk gastritis (p < 0,001). Både histologiske og immunhistokemisk beviser for H. pylori
blev påvist i slimhinden modstykke til 1 tarm- og 1 diffuse typen cancere (figur 5 og 6), både i kaukasiske patienter. De øvrige 18 prøver viste ingen tegn på H. pylori
. Der var ingen signifikante forskelle mellem typer af kræft, typer af gastritis eller tilstedeværelsen af ​​H. pylori
på den ene side, og korrelationen med genekspression af CLDN1
eller IL-8
. Figur 5 histologisk snit af H. pylori induceret non-atrofisk kronisk gastritis. Pilen påpeger et område med aktiv inflammation med karakteristisk granulocytisk infiltration i krypten epitel.
Figur 6 Immunohistologisk beviser for H. pylori. H. pylori blev opdaget i 2 af de 20 slimhinde prøver. Prøven fra figur 5 er blevet underkastet immunhistokemisk behandling af anti-Helicobacter
-antistof, farvning H. pylori
brun.
Diskussion
I denne undersøgelse identificerede vi CLDN1
som en af ​​de mest konsekvent opreguleret gener i GC og en stærk korrelation mellem opregulering af CLDN1
og nedsat overlevelse i 20 patienter med gastrisk adenokarcinomer. Denne korrelation er endnu stærkere når der korrigeres for andre parametre, såsom lymfeknuder fase, tumorstørrelse og histologisk type. Vores klinisk prøve størrelse er lille, men resultaterne er konsistente. Salg Claudins er proteiner involveret i cellulære tætte forbindelser og er vigtige for opretholdelse af normal epitel, især barriere dannelse, cellepolaritet og signaltransduktion. Dysregulering af disse gener er blevet identificeret i mange forskellige cancerformer. Baseret på tumorbiologi, nedregulering af CLDN1
ville resultere i ødelæggelse af tight junctions og tab af celle-til-celle adhæsion forårsager tumor progression [33], men den kliniske betydning i gastrisk carcinogenese er mere kompleks. Der er beviser for, at flere af de claudins,
CLDN1 inkluderet, viser stigende niveauer, som gastrisk epitel skrider til intestinal metaplasi og tidlig gastrisk karcinom [34]. CLDN1
kunne påvirke intracellulær signalering, demonstreret af Liu et al. som viste, at forhøjet ekspression af CLDN1 i brystcancerceller bidraget til en anti-apoptotisk virkning gennem to mekanismer: inhibering af caspase-8-spaltning, og aktivering af Wnt /β-catenin signalvej [35]. CLDN1 er blevet identificeret i kernen af ​​gastrisk kræft AGS celler in vitro
, hvilket tyder på en regulerende rolle CLDN1 på celleproliferation, migration og invasionsevne på en nuklear niveau [36]. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Integrative roller transformerende vækstfaktor-α i cytoprotektion mekanismer maveslimhinden injury
• Foreningen af ​​thiazolidindioner med mavekræft i type 2-diabetes mellitus: en populationsbaseret case-kontrol study