Up-regolazione di CLDN1 nel carcinoma gastrico è correlato con ridotta sopravvivenza

Up-regolazione di CLDN1 nel carcinoma gastrico è correlato ad una ridotta sopravvivenza
Abstract
sfondo
Le variazioni genetiche in adenocarcinoma gastrico sono estremamente non sono stati ancora identificati marcatori tumorali complesse e affidabili. Ci sono anche differenze geografiche rilevanti nella distribuzione di questa malattia. Il nostro obiettivo è stato quello di identificare i geni più differenzialmente regolati in 20 adenocarcinomi gastrici da una selezione norvegese, rispetto alla mucosa normale abbinati, e noi abbiamo i nostri risultati relativi alla prognosi, la sopravvivenza e Helicobacter pylori
infezione cronica.
Metodi
biopsie da adenocarcinomi gastrici e adiacente mucosa gastrica normale sono stati ottenuti da 20 pazienti immediatamente dopo la resezione chirurgica del tumore. genoma intero, cDNA microarray analisi è stata effettuata su RNA isolato dalle coppie di campioni per confrontare i profili di espressione genica tra il tumore contro mucose abbinato. I campioni sono stati esaminati al microscopio per classificare gastrite. La presenza di H. pylori
è stata esaminata mediante microscopia ed immunoistochimica.
Risultati
130 geni hanno mostrato regolazione differenziale di sopra di un livello di cut-off predefinito. L'interleuchina-8 (IL-8
) e Claudin-1 (CLDN1
) sono stati i più costantemente geni up-regolata nei tumori. Molto alta CLDN1
espressione nel tumore è stato identificato come un gene predittore indipendente e significativa riduzione della sopravvivenza post-operatorio. Ci sono stati nettamente diversi profili di espressione tra il gruppo del tumore e il gruppo di controllo della mucosa, e i sottoinsiemi istologici di tipo misto, tipo diffuso e il cancro tipo intestinale hanno dimostrato ulteriormente sub-clustering. Up-regolate geni sono stati mappati alla cella-adesione, i processi di collagene legati e l'angiogenesi, mentre le normali funzioni intestinali come la digestione ed escrezione sono stati associati con geni down-regolato. Abbiamo in relazione i risultati attuali per la nostra precedente studio sulla risposta genica delle cellule epiteliali gastriche a H. pylori
infezione.
Conclusioni
CLDN1
era altamente up-regolati nel cancro gastrico e CLDN1
espressione era indipendentemente associata ad una prognosi infausta post-operatorio, e può avere un importante valore prognostico. IL-8 Comprare e vendere CLDN1 possono rappresentare maglie centrali tra la risposta gene visto in H. pylori
infezione acuta delle cellule epiteliali gastriche, e il cancro gastrico in ultima analisi.
Parole
cancro gastrico interleuchine 8 Claudin-1 Helicobacter pylori
cDNA microarray sopravvivenza prognosi Sfondo
cancro gastrico (GC) è secondo solo al cancro del polmone nei decessi correlati al cancro in tutto il mondo, ma ci sono grandi differenze geografiche nella distribuzione GC. I dati a partire dal 2010 dimostrano che l'incidenza GC in Norvegia è molto basso (maschi 6,9, femmine 3,0 per 100.000) [1] rispetto alle aree meno sviluppate, in particolare in Asia Orientale, dove l'incidenza è pari a circa 6 volte (maschi 42,4, femmine 18.3 per 100.000) [2].
adenocarcinoma gastrico è notevolmente eterogenea geneticamente, citologicamente e architettonicamente rispetto ad altri carcinomi gastrointestinali. La ricerca di marcatori tumorali affidabili e indicatori prognostici coerenti è dimostrato difficile. Diversi autori hanno tentato di predire la malattia GC e la prognosi sulla base di geni singoli o multipli [3-8], ma ci sono discrepanze tra gli studi, e attualmente non firma gene o biomarkers sono in uso clinico di routine. La comprensione dei meccanismi alla base del cancro gastrico è una delle maggiori sfide nel campo della genomica del cancro. La classificazione Lauren divide adenocarcinomi in tre diversi sottotipi istologici: tipi intestinali e diffuse e una variante mista [9], che si pensa di prendere diversi percorsi di carcinogenesi. Il tipo intestinale è attribuibile ad una progressione più fasi da gastrite cronica attraverso l'atrofia gastrica, metaplasia, displasia e malattie maligne in ultima analisi, [10]. Diffuse tipi possono derivare da infiammazione cronica senza
una chiara manifestazione di passaggi intermedi precancerose [11-13]. Il tipo misto mostra miscele non omogenee sia di tipo di architettura intestinale e diffuso, e potrebbe rappresentare una categoria di cancro separato con mutazioni del gene esclusive e un decorso più aggressivo [14, 15]. A dispetto di una ricerca approfondita dei cambiamenti genetici di GC, i meccanismi alla base della malattia sono ancora lontani dal capire, e la malattia non può essere facilmente spiegato con un modello di adenoma-carcinoma, come nel cancro colorettale. Ci sono tre meccanismi molecolari che guidano carcinogenesi gastrica: instabilità cromosomica, instabilità microsatellite e alterazioni epigenetiche [16]. Il risultato netto è l'attivazione di oncogeni, l'inattivazione di geni oncosoppressori e la deregolamentazione delle vie di segnalazione [11, 12]. Aberrant regolazione del ciclo cellulare e cambiamenti nell'espressione di fattori di crescita e citochine regolano il differenziamento e la sopravvivenza delle cellule tumorali. Le mutazioni di cellule-adesione e geni angiogenici svolgono un ruolo importante nel comportamento invasivo e metastatico delle cellule di GC.
Lo scopo di questo studio è stato quello di identificare i geni più differenziale regolamentati adenocarcinoma gastrico chirurgicamente asportato rispetto alla mucosa normale corrispondenza, utilizzando intero genoma cDNA microarray profiling. Abbiamo anche tentare di identificare i geni che influenzano la prognosi GC e la sopravvivenza. I risultati sono confrontati alla risposta gene cellule epiteliali gastrico per H. pylori
infezione, che è stato analizzato in un articolo pubblicato in precedenza [17]. Questo studio aggiunge il supporto per il significato di IL-8
e CLDN1
nella carcinogenesi gastrica, così come dimostra importanti modifiche genetiche in GC e la loro possibile rilevanza per H. pylori
infezione.
Metodi
tessuti e le caratteristiche del paziente
le biopsie sono state ottenute da pazienti con diagnosi di non-cardiale adenocarcinoma gastrico presso la clinica di endoscopia ambulatoriale presso Akershus University Hospital, in Norvegia. Toraco-addominale immagini tomografia computerizzata è stata intrapresa per escludere pazienti con malattia metastatica. 20 pazienti con entrambi i tipi intestinali e diffuse di GC sono stati inclusi. I pazienti e le caratteristiche clinico-patologici sono presentati nella tabella 1. Al momento del ricovero per la chirurgia elettiva, scritto, il consenso informato per la partecipazione allo studio è stato ottenuto da parte dei partecipanti. Entro 5 minuti dalla rimozione dei principali pezzo operatorio, i campioni sono stati prelevati sia dal confine del tumore e dal sano mucosa gastrica Corpal all'interno della stessa zona dello stomaco, ma più di 5 cm di distanza dal tumore, e memorizzati su RNAlater
(Applied Biosystems , STATI UNITI D'AMERICA). Tutti i campioni sono stati conservati in + 4 ° C per circa 1-2 settimane per consentire la penetrazione del tessuto completa di RNAlater
, prima che i campioni sono stati essiccati e permanentemente memorizzati in -80 ° C. Tutto l'acquisizione e la manipolazione del campione sono state eseguite dagli stessi individual.Table 1 Le caratteristiche dei pazienti e le caratteristiche clinico-patologici dei 20 tumori gastrici utilizzati nello studio
Sex
femmine n = 5, i maschi n = 15
etnica
caucasica n = 18, n = 2 asiatico
Età alla chirurgia
Totale: 68,7 anni (± 12,5)
femmine: 65,7 anni (± 21,8)
maschi: 69,7 anni (± 8.6)
la sopravvivenza postoperatoria (persone decedute)
totale: 13,2 mesi (± 8.8)
femmine (n = 4): 16,6 mesi (± 6.4)
Maschi (n = 10): 12,0 mesi (± 9,7 )
la sopravvivenza postoperatoria (individui vivi alla fine dello studio)
totale: 45,8 mesi (± 7.9)
femmine (n = 1): 48.0 mesi
maschi (n = 5): 44,9 mesi (± 8.8)
Le dimensioni del tumore
49 millimetri (± 27)
stadio del tumore
T1 2
T2 10
T3
5
T4
3
fase nodale
N0 10
N1
5
N2 3
N3 2
tipo istologico
intestinale
5
Diffuse
12
misto 3
caratteristiche del paziente e le caratteristiche clinico-patologici dei 20 tumori gastrici utilizzati nello studio. I valori sono la media più /meno deviazione standard.
Dopo la resezione del tumore, i principali esemplare è stato sottoposto ad esame histolopathological da due patologi specializzati di alto livello per confermare la diagnosi e classificare il tumore secondo la classificazione Lauren [9]. Antrale e Corpal mucosa gastrica sono stati esaminati per la gastrite, l'atrofia e metaplasia, e la presenza o l'assenza di H. pylori
è stato esaminato al microscopio e successivamente identificati mediante immunoistochimica. Il sistema di Sydney aggiornato è stato utilizzato per classificare e grado dal grado di gastrite [18, 19].
Lo studio è stato approvato dal Comitato regionale norvegese per la ricerca medica e sanitaria Etica (REC sud-est). Tutti i campioni ei dati del paziente sono stati codificati e accecato prima dell'analisi.
Isolamento dell'RNA, controllo di qualità e cDNA sintesi
RNA totale è stato isolato utilizzando il RNeasy Sangue e kit di tessuti (Qiagen GmbH, Germania) secondo il protocollo di preparazione convenzionale del produttore . concentrazione di RNA e la qualità sono stati determinati utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, USA) e Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Stati Uniti d'America). Il numero integrità dell'RNA era adeguata per la sintesi del DNA.
L'RNA amplificazione Kit Illumina TotalPrep (Ambion Inc., USA) è stato utilizzato per amplificare l'RNA per l'ibridazione su Illumina BeadChips. Per sintetizzare il primo filamento di cDNA mediante trascrizione inversa, abbiamo utilizzato l'RNA totale di ogni campione raccolto sopra. Dopo la seconda sintesi del filamento cDNA e fasi di purificazione cDNA, la trascrizione in vitro
di sintetizzare cRNA è stato preparato durante la notte per 12 ore
. CDNA analisi oligonucleotide microarray
I profili di espressione genica sono stati misurati utilizzando Illumina umano HT-12 v3 espressione BeadChip (Illumina, USA), che consente l'analisi di espressione genome-wide (48800 trascrizioni, corrispondente a circa 37800 geni) di 12 campioni in parallelo su un singolo microarray. 35967 delle sonde sono state progettate utilizzando il RefSeq (36,2 costruire, rilasciare 22) biblioteca e 12.837 sonde sono state derivato dal UniGene (build 199) database [20, 21].
Immunoistochimica
La presenza di H. pylori
nei campioni chirurgici è stato analizzato utilizzando un policlonale anti-Helicobacter
-antibody (Dako, Danimarca, B0471 codice, la diluizione 1: 200). 4 sezioni micron di tessuto inclusi in paraffina fissati in formalina dalla mucosa non-tumorale sono stati applicati su vetrini rivestiti. Deparaffinizzazione, reidratazione e smascheramento sono stati eseguiti in un Dako PT Link (Dako, Danimarca) a 97 ° C per 20 min. La procedura di immunocolorazione è stata effettuata in un Dako Autostainer Inoltre l'applicazione della Envision ™ Flex, il sistema pH elevato (Dako, Danimarca).
Bioinformatica e statistica
R /BioConductor [22, 23] con il pacchetto Beadarray [24] sono stati utilizzati per la pre-elaborazione dei dati di testo microarray da BeadStudio. manufatti spaziali sono stati rimossi con BASH [25] prima che i dati di espressione erano registro 2-trasformati e quantile normalizzata. Il registro delle modifiche 2 volte (FC) di ciascuna sonda sulla matrice all'interno di ogni coppia di tessuto (tumore vs mucosa normale abbinato) è stato quindi calcolato, ed i dati sono stati caricati nel pacchetto software J-express [26]. test Classifica prodotto [27] è stata poi eseguita per verificare se l'espressione differenziale tra tessuto tumorale e abbinati mucosa normale è stato significativo. L'espressione differenziale è stata dichiarata significativo se il p-valore regolato, vale a dire il valore di q-FDR, era inferiore a 0.05. clustering gerarchico è stata effettuata utilizzando media linkage e misurare la distanza euclidea. Le analisi sono state effettuate utilizzando il pacchetto software J-express [26]
Per produrre un elenco di dimensioni ragionevoli dei geni più espressi in modo differenziale, geni meno espressi sono stati filtrati ad un livello cut-off di FC >.; 1.5, producendo un elenco dei 130 geni più differenzialmente espressi. Questo set di dati è stato importato in onto-Express e Pathway espresso [28, 29], parte della suite software su-Tools, per l'analisi funzionale, e raggruppati in Gene Ontology (GO) termini e KEGG (Kyoto Enciclopedia di geni e genomi) cellulare vie di segnalazione [30]. Pathway espresso calcola un Impact Factor (IF) che viene utilizzato per classificare le vie di segnalazione interessati, in base alla variazione piega, il numero dei geni coinvolti nella via, e la quantità di perturbazione di geni a valle [31].
il set di dati è stato stipulato PASW Statistics (SPSS versione 18.0.2) per eseguire l'analisi di correlazione bivariata per selezionare geni che associate ai parametri clinico-patologici. Entrambi i coefficienti di correlazione di Pearson e Spearman sono stati impiegati per identificare i geni che correlano. Tra i geni che correlati, siamo stati particolarmente interessati a quelli che hanno mostrato una simile espressione nel nostro studio pubblicato in precedenza di H. pylori
-exposed gastrici cellule epiteliali [17]. I geni selezionati sono stati quindi sottoposti ad un'analisi di regressione multivariata di Cox per indagare se qualcuno dei geni erano predittori indipendenti di sopravvivenza post-operatorio nei pazienti GC, indipendentemente dal tipo istologico, stadio del tumore e la dimensione, la malattia linfonodale, e l'età al momento dell'intervento. In un gene predittore che è stato identificato, diversi livelli di cut-off sono stati applicati per costruire gruppi di alto e basso livello di espressione, prima di significatività statistica tra i due gruppi è stata valutata utilizzando un log-rank (Mantel-Cox) test. Una trama di sopravvivenza di Kaplan-Meier è stato creato per dimostrare la differenza nella sopravvivenza tra i gruppi ad alta e bassa espressione. Quali sono disponibili con il numero di adesione E-MTAB-1440 I dati di microarray nel database ArrayExpress [32].
Risultati
Gene espressione
tutta l'espressione del genoma profilazione dei 20 campioni di tumore gastrico corrispondenti è stata effettuata utilizzando cDNA microarrays. Classifica prodotto test statistici [27] del registro 2 fold change (FC) valori di espressione di circa 38000 geni sul chip microarray ha rivelato 2297 geni che erano significativamente up-regolati e 2259 geni che erano significativamente down-regolato nel tumore tessuto rispetto a mucosa normale abbinato (p < 0,01). I 130 geni che sono stati filtrati differenziale regolate da un FC media > 1.5 sono elencati nella Tabella 2, e costituiscono il set di dati su cui viene eseguita un'ulteriore analisi. Dei geni più differenziale regolamentati, 30 geni hanno dimostrato up-regolazione e 100 geni sono stati down-regolato. IL-8
è stato il singolo gene più up-regolato, up-regolata in 18 su 20 coppie di tessuto, con una media di 2,6 FC (figura 1), seguito da
COL1A1 e CLDN1
(Figura 2 ). Il più gene down-regolato era
PGA4, essendo notevolmente down-regolato in 18 su 20 coppie di tessuto, seguita da GIF
e ATP4A
. clustering gerarchico del set di dati (Figura 3) ha dimostrato che i tessuti tumorali e di controllo formate nettamente diversi cluster di espressione genica. All'interno del gruppo del tumore, le diverse categorie istologiche diffondono, il cancro intestinale e mista formata quasi esclusivo cluster individuali, dimostrando stretta somiglianza genetica all'interno di ciascuno dei sottoinsiemi istologici. Tra i tessuti di controllo, e tra i H. pylori
individui positivi, nessuna particolare il clustering era seen.Table 2 I geni più differenzialmente regolati nel tumore gastrico vs mucosa controllo
up-regolati geni (n = 30)
geni
down-regolato (n = 100)
simbolo Gene
media FC
Gene simbolo
FC media

simbolo Gene
media FC
simbolo Gene
media FC
IL-8
2.58
PGA4
-5.58
MAL
-2.22
AKR7A3
-1.79
COL1A1
2.18
GIF
-5.48
SCNN1B
-2.22
KIAA1324
-1.79
CLDN1
2.14
ATP4A
-5.28
SOX21
-2.22
CCDC121
-1.78
SPP1
2.09
PGA3
-4.72
CAPN9
-2.21
FBP2
-1.76
CLDN2
2.09
ATP4B
-4.71
AGXT2L1
-2.20
FCGBP
-1.75
CEACAM6
2.09
PGA5
-4.34
HDC
-2.18
ORM2
-1.75
SERPINB5
2.06
LIPF
-3.91
GSTA1
-2.18
FAM3B
-1.73
KRT17
2.00
CPA2
-3.78
KLK11
-2.12
TRIM50
-1.73
H19
1.94
GHRL
-3.75
APLP1
-2.12
DUOX1
-1.72
CLDN7
1.93
GKN2
-3.26
MT1H
-2.09
RAP1GAP
-1.70
TFF3
1.92
KCNE2
-3.19
ADH1C
-2.09
EEF1A2
-1.70
OLFM4
1.91
SST
-3.12
DPCR1
-2.06
ANGPTL3
-1.70
THBS2
1.91
CHGA
-3.02
AKR1B10
-2.03
B3GAT1
-1.69
PI3
1.90
PSCA
-3.00
MT1G
-2.03
C6ORF105
-1.68
SULF1
1.89
CHIA
-2.88
CKB
-2.01
FGG
-1.68
BGN
1.82
GKN1
-2.88
SH3GL2
-1.99
ADA
-1.65
KRT6B
1.80
KCNJ16
-2.82
REP15
-1.97
C6ORF58
-1.63
THY1
1.72
GC
-2.66
CKM
-1.95
ZNF533
-1.60
MMP11
1.70
CLIC6
-2.65
FGA
-1.95
RPESP
-1.59
KLK6
1.67
SOSTDC1
-2.53
SLC9A4
-1.92
MT1F
-1.58
SERPINA3
1.65
ESRRG
-2.52
MFSD4
-1.92
PNPLA7
-1.57
FNDC1
1.64
CCKBR
-2.51
ALDOB
-1.89
FUT9
-1.57
COL1A2
1.63
TMED6
-2.44
SCNN1G
-1.87
RPRM
-1.56
CST1
1.63
MT1M
-2.44
IRX2
-1.87
GUCA2B
-1.56
FAP
1.60
GPER
-2.43
SLC26A9
-1.87
TCN1
-1.55
COL6A3
1.60
CKMT2
-2.36
CLCNKA
-1.87
PKIB
-1.55
SFRP4
1.56
VSIG2
-2.36
CAPN13
-1.86
SLC9A2
-1.55
TMEM158
1.53
FLJ42875
-2.33
TTR
-1,86
homer2
-1.53 ​​
MMP7
1,50
CXCL17
-2.32
GSTA2
-1.85
AKR1C4
-1.50
MMP10
1.50
CA9
-2.32
NKX6-2
-1.83
REG3A
-1.50
AKR1C2
-2,27
CA2
-1,83
PI16
-1.50
ALDH3A1
-2,24
FOLR1
-1.82
MAP7D2
- 1,50
SCGB2A1
-2,23
RDH12
-1,81
AQP4
-2,24
irx3
-1,80
geni differenzialmente regolati con log2FC media di > 1.5 (n = 130). estratto da tutta l'espressione del genoma. sono elencati i livelli medi di log2FC corrispondenti a ogni gene. Nove geni. mostrato in grassetto. dimostrato regolamento simile in entrambe corso di studio e in uno studio precedente in cui le cellule epiteliali gastriche sono state esposte a H. pylori
[17].
figura 1 interleuchina-8 espressione genica nei tumori gastrici vs mucosa di controllo abbinato. La linea continua rappresenta il rapporto relativo di IL-8
espressione nel tessuto tumorale rispetto al controllo abbinato mucosa gastrica, come il cambiamento log2 piega (log2 tumore /controllare i livelli di espressione). Un punteggio positivo indica un'espressione più elevata nel tumore rispetto alla mucosa gastrica. IL-8
era il gene più costantemente up-regolati nello studio. Lo sfondo grigio rappresenta l'espressione di circa 37 800 altri geni.
Figura 2 Claudin 1 espressione genica nei tumori gastrici vs mucosa di controllo abbinato. La linea continua rappresenta il rapporto relativo di CLDN1
espressione nel tessuto tumorale rispetto al controllo abbinato mucosa gastrica, come il cambiamento log2 volte (log2 tumore /controllare i livelli di espressione). Un punteggio positivo indica un'espressione più elevata nel tumore rispetto alla mucosa gastrica. Lo sfondo grigio rappresenta l'espressione di circa 37 800 altri geni.
Figura 3 clustering gerarchico della espressione genica di 20 tumori mucosa gastrica e di controllo. espressione del genoma intero di coppie di tessuto /controllo 20 tumore sono stati filtrati per produrre un insieme di dati che contiene i 130 geni più differenziale regolamentati. La maggior parte dei campioni di tumore raggruppati separato per i campioni di controllo. I campioni tumorali tipo diffuse sono evidenziate in grigio chiaro, il tipo intestinale in grigio medio e il tipo misto in grigio scuro per illustrare il subclustering dei tre diversi tipi di cancro istologici.
Geni dal set di dati correnti sono stati incrociati confrontato il la maggior parte dei geni differenzialmente regolati identificati nel nostro precedente studio, in cui le cellule epiteliali gastriche sono state esposte a H. pylori
per 24 ore in vitro
[17]. Entrambi pylori
-exposed cellule epiteliali gastriche H. e le biopsie tumorali hanno dimostrato significativo up-regolazione di cinque geni comuni (IL-8, CLDN1, KRT17, CLDN7
e MMP7
) e down-regulation di quattro geni comuni (GPER, KIAA1324, ADA
e SLC9A2
).
Gene ontology
Avanti, il set di dati dei 130 geni più differenzialmente regolati sono stati analizzati per l'annotazione funzionale utilizzando termini GO (Tabella 3). Tra i 30 geni up-regolati, i processi di adesione cellulare, e in particolare l'adesione cellula-cellula di calcio-indipendenti, sono stati tra i termini più altamente arricchito. Inoltre, i processi sintetici come morfogenesi pelle e sviluppo dei vasi sanguigni, ei processi di collagene legati sia catabolici e sintetici sono stati tra i termini significativi identificati. Solo una parte minore dei geni down-regolato sono stati mappati per ontologie specifiche rispetto ai geni up-regolati, in cui la digestione e l'eliminazione erano i termini più arricchite. Diversi processi metabolici, regolazione del pH e cobalamina e trasporto di ioni sono stati inoltre arricchito significativamente termini GO tra i geni down-regolato (Tabella 4) .table 3 Gene associazioni ontologia in up-regolate geni
P-value
No di geni coinvolti
% di geni coinvolti
Gene ontologia
Go: numero
0,00,066 mila 3
10,0
calcio adesione cellula-cellula -indipendente
GO: 0.016.338
0,0007 2
6,67
morfogenesi pelle
GO: 0.043.589
0.023
5
16,67
adesione cellulare
GO: 0.007.155
0.023 2
6,67
collagene processo catabolico
GO: 0.030.574
0.023 2
6,67
collagene organizzazione fibrilla
GO: nave 0030199
0.027 2
6.67
Sangue development
GO:0001568
0.042
1
3.33
Copulation
GO:0007620
0.042
1
3.33
Regulation di replicazione del genoma retrovirale
GO: 0045870
0,042
1 3.33
Responsen di corticosteroidi stimolo
GO: 0.031.960
0,042
1 3.33
mineralizzazione dei denti
GO: 0034505
notevolmente arricchito termini Gene Ontology nei geni up-regolati dal set di dati
Tabella 4 Gene associazioni ontologia nei geni down-regolato
P-value
No di geni coinvolti
% dei geni coinvolti
Gene ontology

GO:number

0.0
8
7.41
Digestion
GO:0007586
0.00011
5
4.63
Excretion
GO:0007588
0.0005
3
2.78
Creatine processo metabolico
GO: 0.006.600
0,0019 3
2.78
Cellular processo metabolico aldeide
GO: 0.006.081
0,0043 3
2.78
regolamento pH
GO: 0.006.885
0.013 2
1.85
trasporto cobalamina
GO: 0.015.889
0.015
9
8.33
Ion transport
GO:0006811
0.015
2
1.85
Secretion
GO:0046903
0.015
2
1.85
Cobalt trasporto di ioni
GO: 0.006.824
0,02,013 mila 2
1.85
morfogenesi di un epitelio
GO: 0002009
notevolmente arricchito termini Gene Ontology nei geni down-regolato dal set di dati
. vie di segnalazione cellulare KEGG
Il set di dati è stato poi analizzato per KEGG segnalazione cellulare associazioni pathway. 11 dei 30 geni up-regolati sono state mappate a 8 significativi percorsi KEGG (p < 0,05). In particolare, le molecole di adesione cellulare (CAM) percorso e percorso di migrazione dei leucociti transendoteliale sono stati assegnati in un fattore di alto impatto, a causa della forte up-regulation di CLDN1, CLDN7
, e Thy1
geni, e l'alto impatto relativo di questi geni sul percorso CAM. IL-8, COL1A1, COL1A2, THBS2, SPP1,
COL6A3 e SFRP4
sono stati mappati a diversi percorsi altamente impatto: la migrazione dei leucociti transendoteliale, recettore matrice extracellulare, giunzione a tenuta, di segnalazione delle cellule epiteliali in H. pylori
infezione, TGFβ percorso di segnalazione, toll-like receptor segnalazione e di segnalazione Wnt (Tabella 5). Nessuno dei 100 geni down-regolati sono stati mappati ad alcun significativo vie di segnalazione cellulare KEGG pathways.Table 5 KEGG
Classifica
nome Pathway
IF
P-value
1
molecole di adesione cellulare (CAM)
734.0
0,000,129 mila 2
leucociti transendoteliale migrazione
672,1
0,000,879 mila 3
ECM recettore interazione
10,9
0,00,215 mila 4
giunzione a tenuta
10,6
0,000,296 mila
5
segnalazione cellulare epiteliale in Helicobacter
7.2
0.006
6
TGF-beta percorso di segnalazione
6.3
0.013 7
adesione focale
6.2
0.014
8
calcio via di segnalazione
5.1
0.035
notevolmente arricchito KEGG vie di segnalazione cellulare nel set di dati (p < 0,05). Impact Factor (IF) è utilizzato per classificare i percorsi di segnalazione colpite, in base alla variazione piega, il numero dei geni coinvolti nella via, e la quantità di perturbazione dei geni a valle.
Clinicopatologico correlazione Con gli l'insieme totale dei 130 geni più differenziale regolamentati, i livelli di espressione FC di 20 geni hanno mostrato una correlazione significativa con la sopravvivenza post-operatorio, 8 geni correlati con il tipo istologico, 5 geni correlati con le dimensioni del tumore, e 1 gene correlato con lo stadio dei linfonodi (sui file 1 ). Alcuni geni hanno mostrato correlazione con più di un parametro. A causa delle dimensioni moderate campione (n = 20), un livello di significatività di p < 0,01 è stato scelto.
Cox analisi multivariata dei geni associati con la sopravvivenza post-operatorio ha dimostrato che un alto livello di espressione CLDN1
era il solo gene predittore indipendente di sopravvivenza post-operatoria. CLDN1
espressione e la dimensione del tumore covariate, frazione del linfonodo positivo, tipo istologico, il sesso e l'età al momento dell'intervento sono stati inseriti in un modello di regressione lineare (Tabella 6), dimostrando che solo CLDN1
e la frazione di linfonodi positivi sono stati significativi predittori di sopravvivenza post-operatoria. Quando tutti i determinanti non significative dove rimosso, c'è stata una forte correlazione negativa tra CLDN1
espressione e la sopravvivenza post-operatoria (R = -0.7, p < 0,001). C'erano alcuna associazione significativa tra CLDN1
espressione e la classificazione Lauren, H. pylori
infezione, etnia, dimensioni del tumore o linfa metastatico nodo status.Table 6 I fattori che influenzano la sopravvivenza dopo un intervento chirurgico per cancro gastrico
co-variata
coefficiente di correlazione R
P-value
CLDN1
espressione (fold change log 2)
-0.53
0.008
linfa frazione nodo
-0.46
0.016
Le dimensioni del tumore
-0.27
0.186
Età alla chirurgia
-0.13
0,491
tipo istologico (tipo intestinale)
-0.03
0,888
genere maschile
-0.05
0.792 analisi di regressione lineare
di molteplici fattori che influenzano la sopravvivenza post-operatorio in pazienti sottoposti a chirurgia per cancro gastrico.
per rilevare le differenze di post-operatorio sopravvivenza tra gli individui con alta e bassa CLDN1
esprimente i tumori, i diversi livelli di cut-off sono stati utilizzati per creare gruppi di alto e basso che esprimono esprimono. Utilizzando il CLDN1
FC media (FC media = 2.14) come il divisore gruppo, ad alta e bassa espressione pazienti CLDN1
dimostrato significativamente diversi modelli di sopravvivenza (p < 0,001), come illustrato nella curva di Kaplan-Meier in Figura 4. Figura 4 Kaplan Meier trama sopravvivenza dei pazienti affetti da tumori gastrici resecati. La linea continua rappresenta sotto CLDN1 media
esprimente tumori (FC < 2.14) e la linea tratteggiata rappresenta sopra CLDN1 media
tumori esprimente (FC > 2.14). 6 pazienti nel basso CLDN1
esprimente il gruppo erano ancora vivi alla fine del periodo di studio, come dimostrano i tic verticali linea continua.
Caratteristiche istopatologiche di adiacenti non-cancerose mucosa rosa della 20 abbinato i campioni di mucosa, 10 hanno mostrato evidenza di gastrite non-atrofica, e 10 hanno dimostrato multifocale gastrite atrofica. metaplasia intestinale è stato segnato 1-3 nei antro e corpus aree dei campioni. I tumori di tipo intestinali sono risultati significativamente associati sia con gastrite atrofica e metaplasia intestinale (p < 0,001), mentre i tumori tipo diffuso sono stati associati con gastrite non-atrofica (p < 0,001). Sia evidenza istologica e immunoistochimica di H. pylori
sono state dimostrate nel controparte mucosa intestinale e 1 1 tumori tipo diffuso (figure 5 e 6), sia in pazienti caucasici. Gli altri 18 campioni hanno mostrato alcuna evidenza di H. pylori
. Non ci sono state differenze significative tra i tipi di cancro, tipi di gastrite, o la presenza di H. pylori
da un lato, e la correlazione con l'espressione genica di CLDN1
o IL-8
. Figura 5 Sezione istologica di H. pylori indotto non atrofica gastrite cronica. La freccia indica una zona di infiammazione attiva con la caratteristica infiltrazione granulocitaria nell'epitelio cripta.
Figura 6 prove immunoistologiche di H. pylori. H. pylori è stata scoperta in 2 dei campioni 20 mucosa. Il campione di Figura 5 è stato sottoposto a trattamento immunoistochimica da anti-Helicobacter
-antibody, macchiando H. pylori
marrone
. Discussione
In questo studio abbiamo identificato CLDN1
come uno dei più costantemente geni in GC e una forte correlazione tra up-regolazione di CLDN1
e ridotta sopravvivenza in 20 pazienti con adenocarcinoma gastrico up-regolata. Questa correlazione è ancora più forte dopo l'aggiustamento per altri parametri come la fase di linfonodi, le dimensioni del tumore e il tipo istologico. Il nostro campione clinico è piccola, ma i risultati sono coerenti.
Claudine sono proteine ​​coinvolte nella giunzioni strette cellulari e sono importanti per il mantenimento dell'epitelio normale, in particolare la formazione di barriera, polarità cellulare e trasduzione del segnale. Disregolazione di questi geni sono stati identificati in molti diversi tipi di cancro. Sulla base di biologia tumorale, down-regulation di CLDN1
comporterebbe la distruzione di giunzioni strette e la perdita di cella-a-cella di adesione che causano la progressione del tumore [33], ma il significato clinico nella carcinogenesi gastrica è più complessa. Ci sono prove che molte delle claudine, CLDN1
compresa, mostrano livelli crescenti come dell'epitelio gastrico intestinale progredisce a metaplasia e carcinoma gastrico precoce [34]. CLDN1
potrebbe influenzare la segnalazione intracellulare, dimostrata da Liu et al. che ha mostrato che livelli elevati di espressione di CLDN1 nelle cellule di cancro al seno ha contribuito ad un effetto anti-apoptotico attraverso due meccanismi: l'inibizione della caspasi-8 scissione, e l'attivazione del pathway di segnale /β-catenina Wnt [35]. CLDN1 è stato identificato all'interno del nucleo del cancro gastrico cellule AGS in vitro
, suggerendo un ruolo regolatore di CLDN1 sulla proliferazione cellulare, la migrazione e l'invasività a livello nucleare [36]. Wu et al. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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