Alterazioni di E-caderina e β-catenina in Alterazioni cancer

gastrici di E-caderina e β-catenina nel carcinoma gastrico
Abstract
sfondo
Il complesso E-caderina-catenina svolge un ruolo cruciale nel cellulo-epiteliale adesione cellulare e nel mantenimento dell'architettura tissutale. Perturbazione nell'espressione o la funzione di questo complesso si traduce in perdita di adesione intercellulare, con possibile conseguente trasformazione delle cellule e la progressione del tumore.
Metodi
abbiamo studiato le alterazioni di E-caderina e β-catenina in una serie di 50 primarie tumori gastrici utilizzando la perdita di eterozigosi (LOH) analisi, lo screening di mutazione del gene, il rilevamento dei trascritti aberranti e immunoistochimica (IHC).
Risultati
a ad alta frequenza (75%) di LOH è stato rilevato a 16q22.1 contenente e locus -cadherin. Tre casi (6%) hanno mostrato l'identico mutazione missenso, A592T. Questa mutazione non è in grado di contribuire fortemente alla carcinogenesi del cancro gastrico, perché una bassa frequenza (1,6%) di questa mutazione è stata trovata anche in 187 individui normali. Abbiamo anche rilevato una bassa frequenza (0,36%, 0%) di questa mutazione in 280 tumori al seno e 444 altri tumori, tra cui, rispettivamente, colon e del retto, del polmone, endometrio, ovaio, testicolo, del rene, della tiroide e sarcomi carcinomi,. Abbiamo anche analizzato i aberranti mRNA E-caderina nei tumori gastrici e hanno trovato che 7 tumori (18%) avevano mRNA aberranti in aggiunta al normale mRNA. Questi mRNA aberranti possono produrre anormali molecole E-caderina, con conseguente debole adesione cellula-cellula e il comportamento invasivo delle cellule di carcinoma. ridotta espressione di E-caderina e β-catenina è stato identificato alla frequenza di 42% e 28% rispettivamente. Specialmente, 11 tumori (22%) hanno mostrato una colorazione citoplasmatica positiva per β-catenina IHC. Un associazione è stata trovata tra la ridotta espressione di E-caderina e β-catenina. Inoltre, l'associazione è stata rilevata tra ridotta espressione di E-caderina e istotipo diffuso.
Conclusione
I nostri risultati supportano l'ipotesi che le alterazioni di E-caderina e β-catenina svolgono un ruolo nell'inizio e nella progressione del cancro gastrico .
Sfondo
e-caderina (120 kDa; cromosoma 16q) è un caderina classica e costituisce la componente funzionale chiave di giunzioni di aderenza tra le cellule epiteliali [1]. Esso è vincolato tramite una serie di proteine ​​sottopelo, le catenine (α, ß e γ) al citoscheletro actina [1]. Questo legame tra caderine transmembrana e filamenti di actina del citoscheletro è necessario formare una forte adesione cellula-cellula. Una e-caderina intatto - complesso catenina è necessario per il mantenimento della normale adesione intercellulare. Alla luce di questo, diversi gruppi hanno proposto che nei carcinomi, funzioni E-caderina come una molecola di un'invasione soppressore in modo tale che la sua perdita permessi o migliora l'invasione dei tessuti normali adiacenti. studi di immunoistochimica in tumori umani, tra cui il cancro gastrico, hanno spesso dimostrato che una percentuale di carcinomi invasivi e carcinomi in situ
mostrare livelli aberranti di E-caderina e /o l'espressione catenina in confronto al loro tessuto normale correlata [2-4] . In generale, E-caderina e catenina colorazione è forte nei tumori ben differenziati che mantengono la loro adesività delle cellule e sono meno invasive, ma è ridotta nei tumori scarsamente differenziati, che hanno perso la loro adesione cellula-cellula e mostrare un comportamento invasivo forte [2, 3].
E-caderina è coinvolto nella inibizione da contatto della crescita cellulare inducendo l'arresto del ciclo cellulare [5]. Esso ha la capacità di inibire la proliferazione cellulare dalla sovraregolazione di p27 coinvolti nella regolazione del ciclo cellulare [5], anche se il meccanismo con cui E-caderina regola p27 è ancora chiaro. Pertanto, E-caderina, generalmente descritto come un soppressore invasione [6], può agire come un importante soppressore di crescita /proliferazione.
Un'importante funzione di β-catenina in segnalazione cellulare, è stato chiarito [7]. In assenza di un segnale mitotico dall'esterno della cellula, β-catenina è sequestrato in un complesso con il prodotto adenomatosa poliposi coli (APC) gene, una serina treonina glicogeno sintetasi chinasi (GSK-3β) e un axin proteina adattatrice (o omologo conductin), che permette la fosforilazione e la degradazione del libero β-catenina dal sistema ubiquitina-proteasoma [8]. Quando un segnale mitotico viene consegnato dal pathway Wnt, per associazione della famiglia Wg /Wnt di glicoproteine ​​secrete e il loro recettore di membrana frizzled, che porta all'attivazione del spettinato (DSH) di proteine, che viene reclutato per la membrana cellulare. Il DSH attivato downregulates complesso proteico, in modo che non può più fosforilare β-catenina, che non viene quindi degradata. Il rilascio di β-catenina dal complesso fosforilazione e la degradazione favorisce la stabilizzazione β-catenina e segnalazione. Ciò si traduce in un incremento di connessione cystolic β-catenina, che trasloca nel nucleo e direttamente lega i fattori di trascrizione Lef e Tcf, portando all'attivazione dell'espressione genica. Pertanto β-catenina svolge funzioni distinte in adesione cellula-cellula E-caderina-mediata e in Wnt segnalazione [8].
Perdita del locus E-caderina sul braccio lungo del cromosoma 16 (16q22) si verifica in gastrica (24 %), epatocellulare (50%), seno lobulare (50-100%) e esofagee (66%) carcinomi [4, 9-12]. Ci sono stati diversi rapporti su E-caderina mutazioni del gene in tumori umani [13]. Nei tumori scarsamente differenziati, come il cancro al seno lobulare e diffondere-tipo di cancro gastrico, E-caderina mutazioni svolgono un ruolo importante nello sviluppo del tumore [14, 15]. Diversi studi hanno riportato linea germinale mutazioni nel gene E-caderina in famiglie con un tipo di diffuso ereditaria di cancro gastrico [16, 17]. Solo una minoranza dei tumori gastrici può essere rappresentato da mutazioni E-caderina. Frequenti mutazioni somatiche del gene β-catenina sono stati trovati in piccoli adenomi colorettali e tipo intestinale cancro gastrico [18, 19]. La maggior parte delle mutazioni ha comportato la perdita di serine o threonines dalla regione fosforilazione GSK-3β. alterazioni genetiche in β-catenina che aboliscono adesività cellula-cellula sono stati osservati in due linee cellulari di cancro gastrico, HSC39 e 40A; derivano entrambi dalla stessa carcinoma a cellule anello con il sigillo dello stomaco e mostrano un modello di crescita diffusa [20, 21]. Questa mutazione si traduce in un tronco di β-catenina che manca la regione per l'interazione con β-catenina. Transfection di queste linee cellulari con wild-type β-catenina ripristina adesività cellulare [21].
Qui, abbiamo effettuato E-caderina e beta-catenina mutazione genetica e analisi di espressione in una serie di 50 tumori gastrici primari per capire meglio il coinvolgimento delle alterazioni di e-caderina e β-catenina nella carcinogenesi del cancro gastrico.
Materiali e metodi
campioni
inclusi nello studio sono stati 50 i tumori e corrispondenti campioni normali, di cui due tumori (17 e 23) sono della stessa famiglia, il resto sporadica (Tabella 1). Questi casi sono stati diagnosticati da parte del Dipartimento di Patologia, Ospedale Universitario di Islanda. Tessuto è stato ottenuto appena il giorno di intervento chirurgico o da materiale incluso in paraffina. Informazioni riguardanti la fase del tumore, istotipo e grado è stata acquisita anche dallo stesso reparto. DNA per PCR è stato isolato dal proteinasi K trattamento [22]. RNA per RT-PCR è stato estratto utilizzando Tri Reagent (Molecular Research Center, INC. USA). Per la mutazione A592T, abbiamo proiettato 187 individui normali, 280 al seno e 444 altri malati di cancro con colon e del retto, del polmone, endometrio, ovaio, testicolo, del rene, della tiroide e sarcomi carcinomi. Tutti i singoli identificatori sono stati rimossi dai campioni di controllo prima dell'analisi, e gli investigatori furono così accecati alla identificazione di campioni che non può più essere ricondotti a individui specifici. Il consenso è stato presunto per i campioni dei pazienti. Per i casi 294 e 728 con A592T mutazione, abbiamo analizzato i loro pedigree e abbiamo scoperto che non c'erano altri casi di cancro nel pedigree del caso 294, ma c'erano altri 5 casi di cancro nel pedigree del caso 728, di cui 2 tumori della prostata, 1 pelle cancro, il cancro del polmone e 1 1 tumore di poco chiaro origin.Table 1 Sintesi delle alterazioni della e-caderina e β-catenina in una serie di 50 tumori gastrici.
Tumour

Stage

Type

Grade

LOH

E-cad mutazioni del gene
Aberrant mRNA
E-cad
β-cat
Esempio



a 16q22.1
e polimorfismi
di e-CAD
IHC
IHC

1
T3N3
diff
+
IVS1+6T→C
-
+/-
++/-∇
3
T3N1
squ
G1
+
IVS4+10C→G
ND
-
+/-
17
T3N1
diff
ND | GTG (Val) → GTC (Val) a cd832
ND | - -
23
incontrato
+
GCC (Ala) → ACC (Thr ) a cd592 *
ND | +++ /-
+++ /-
43
T3N2
diff
+ -
-
-
+++ /-
50
T3N1
diff
-
IVS1+6T→C
-
++/-
++/-
165
T3N1
int
G3
ND
-
-
+++/-
+++/-∇
174
T3N2
int
G3
-
-
ND
+++/-
++/-
193
T3N2
int
G3
+
-
ND
-/+++
-/++
200
T3N1
int
G2
-
IVS4+10C→G
-
++/-
+++/-
231
T3N0
mi
G3
+
-
-
++/-
++/-∇
283
T3N0
int
G3
ND
-
ND
++/-
++/-
287
T3N1
int
G2
+
-
-
-/+
++/-
294
T3N1M1
mi
G4
+
GCC(Ala)→ACC(Thr) a cd592♦
-
++/-
++/-∇
304
T3N3
int
G2
-
-
-
-/+++
+/-
308
T3N1
int
G2
+
-
-
+++/-
++/-
314
T3N1
diff
-
CAC (suo) → CAT (il suo) a cd632 -
+++ /-
++ /- ∇
GGC (Gly) → a cd865 360
T2N1
int
G3
+
IVS4 + 10C → G
+ ♣
++ /-
+/-
369
incontrato
+
-
+♣
+++/-
++/-
433
T3N1
mi
G3
-
IVS4+10C→G
-
-/++
-/+
435
T2N0
int
G3
+
-
-
-/+++
-/++
443
T2N0
int
G4
-
-
-
+++/-
+++/-
451
T4N0
int
G2
ND
-
ND
+++/-
++/-
474
T3N1
int
G3
ND
-
ND
-
+/-
493
T3N1
int
G3
+
-
-
-/+++
+/-
503
T3N1
int
G3
ND
-
-
-
+++/-
556
T3N2
int
G2
-
IVS1+6T→C
ND
++/-
+/-
5'UTR-71C → G
568
T3N2
mi
G3
+
-
+♣
++/-
++/-
612
T3N0
int
G2
ND
IVS4+10C→G
-
+++/-
+/-
AAC (Asn) → AAT (Asn) a cd751
636
T3N1
diff
+
IVS4+10C→G
ND
+++/-
+++/-∇
650
T2N0M1
int
G2
+
-
ND
-/+
++/-
675
T2N0
mi
G3
+
IVS4+10C→G
-
+/-
++/-∇
676
T3N1
int
G2
+
-
-
+++/-
-∇
680
T3N1
mi
G3
+
IVS1+6T→C
-
++/-
++/-
AAC (Asn) → AAT (Asn) a cd751
694
T3N1
int
G1
+
-
-
+++/-
+++/-
717
T3N1
int
G3
+
-
+♣
-/+++
+++/-
726
T2N1
int
G2
+
IVS4+10C→G
-
-/+++
++/-
728
T3N0
int
G2
+
GCC(Ala)→ACC(Thr) a cd592♦
-
-/+++
++/-
729
T3N1
int
G1
-
IVS1+6T→C
-
-/+++
+++/-
732
T2N1
int
G3
+
-
-
-/+++
+++/-
735
T4N3
diff
ND | AAC (Asn) → AAT (Asn) a cd751 -
+++ /-
+++ /- ∇
738
T3N2
diff
+ -
- -
-∇
750
soddisfatte
ND | AAC (Asn) → AAT (Asn) a cd751
+♣
++/-
+++/-
755
T2N1
int
G2
ND
-
+♥
+++/-
++/-
808
T3N0
int
G1
+
ACG(Thr)→ACA(Thr) a cd251
+♠
+++/-
++/-
811
T2N1
int
G2
+
-
-
+++/-
-/+
832
T3N2
int
G2
+
-
-
+++/-
+++/-∇
855
T3N2
int
G2
+
-
-
+++/-
+++/-
875
T3N2
int
G2
-
IVS4+10C→G
ND
+++/-
+++/-
904
T2N0
int
G3
+
IVS4+10C→G
-
-/+++
++/-
Useful
30 3
7
21
14
totale
40
50 | 38
50 | 50 |%
75
6
18
42
28
T, tumore (dimensioni e invasività); N, nodo (grado di metastasi); M, metastasi; G1, ben differenziato; G2, moderatamente differenziato; G3, poco differenziata; G4, non differenziata; diff, diffusa (grado di differenziazione = G4); mi, mista; int, intestino; incontrato, tumore metastatico probabilmente da tumore allo stomaco; squ, epiteliali squamose; LOH, perdita di eterozigosi; E-cad, E-caderina; β-cat, β-catenina; IHC, immunoistochimica; cd, codone; UTR, regione non tradotta; +, Positivo LOH, aberranti e-CAD mRNA, E-CAD e β-cat IHC, -, negativo LOH, E-caderina mutazione del gene, aberranti e-CAD mRNA, E-CAD e β-cat IHC; ND, non determinato o non fatto; +/-, ++ /- E +++ /-, oltre il 50% di cellule positive; - /+, - /++ E - /+++, cellule più di 50% negativo; *, Mutazione somatica; ♦, mutazione germinale; ♣, inserimento di introne 7 fra esoni 7 e 8, codone di stop 374; ♥, la cancellazione degli ultimi 72 basi dell'esone 7, esone 8 e le prime 124 basi dell'esone 9, codone di stop 322; ♠, delezione di esoni 8 e 9; l'eliminazione degli ultimi 84 basi dell'esone 8, codone di stop 358; ∇, questi campioni hanno mostrato una colorazione citoplasmatica di β-catenina IHC determinazione
LOH
marcatori microsatelliti utilizzati per l'analisi del cromosoma 16q LOH sono stati:. D16S503, D16S496, D16S421, D16S545 e D16S512 per la regione 16q22.1 contenente E locus -cadherin (Genome Database). I prodotti di reazione a catena della polimerasi (PCR) sono stati separati in un gel di acrilammide sequenziamento e trasferiti su una membrana di nylon caricata positivamente, Hybond-N + (Amersham, Reading, UK) e cotto per almeno 2 ore a 80 ° C. Il metodo di rilevamento non radioattivo usato per visualizzare i prodotti di PCR è stato descritto in precedenza [23]. Autoradiogrammi stati ispezionati visivamente da almeno due utenti, confrontando l'intensità di alleli di DNA normale e tumorale. L'assenza o una diminuzione significativa di un allele nel tumore rispetto al campione di riferimento normale è stato considerato come LOH. Proiezione
mutazione
Tutti i 16 esoni del gene E-caderina e esone 3 del gene β-catenina sono stati sottoposti a screening per mutazioni inattivazione con PCR-SSCP (singolo filamento conformazione polimorfismo) sui modelli di DNA genomico. I primer per E-caderina e β-catenina utilizzati nell'analisi SSCP sono stati descritti nel nostro precedente articolo [4] e Park ed altri. [1999], rispettivamente, e ordinato da Pharmacia Biotech o TAG Copenhagen A /S. DNA genomico è stato utilizzato a 30 ng per miscela di reazione di 25 ml contenente 5 pmol del avanti e retromarcia primer, 2.5 nmol di ciascun dNTP, 0,5 unità di DynaZyme polimerasi. I campioni sono stati amplificati in 35 cicli composti da 30 s di denaturazione a 94 ° C, 30 s di ricottura a 55-70 ° C, e infine 60 s di estensione a 72 ° C. Un hot start stato utilizzato dall'aggiunta dell'enzima nel primo ciclo a circa 70 ° C, dopo un tempo di preincubazione di 5 min a 94 ° C. Un'aliquota 4 microlitri di prodotti di PCR è stato mescolato con 7 ml di colorante formammide (95% formammide, 0,05% blu di bromofenolo e 0,05% xilene cianolo), denaturati a 94 ° C per 10 min e snapcooled in ghiaccio. Aliquote di 2 microlitri sono stati analizzati simultaneamente su due gel di poliacrilammide denaturante (non 5% acrilammide con 2% reticolazione), sia contenente 5% glicerolo o carenti glicerolo. L'elettroforesi è stata eseguita in 1 × TBE su gel verticali 6w notte o per 6 ore a temperatura ambiente. I prodotti di PCR sono stati visualizzati come marcatori microsatelliti. Campioni con bande mobilità anormale sono stati amplificati ancora per 35 cicli come descritto sopra. Un'aliquota di 5 ml di prodotti della PCR è stato poi incubato con 10 U exonulease I e 2 U fosfatasi alcalina gamberetti per rimuovere primer e dNTP (US70995, Amersham) eccessivi. Sequenze di entrambi i filamenti sono stati determinati da Thermo Sequenase DNA polimerasi (Thermo Sequenase marcata radioattivamente Terminator Cycle Sequencing Kit, Amersham) utilizzando i due primer PCR originali. Abbiamo eseguito l'analisi di mutazione A592T su quei tipi di cancro, eccetto il cancro di origine poco chiara, nella famiglia di caso 728 con il sequenziamento diretto.
Aberrante mRNA di screening
1-5 mg di RNA totale è stato inversamente trascritto in cDNA usando primo kit di sintesi filamento cDNA (Amersham Pharmacia Biotech). Tutti i campioni sono stati esaminati per le eliminazioni di cDNA E-caderina e inserimenti. E-caderina cDNA è stato amplificato utilizzando coppie di primer EX7-REX10 /2 e EX9 /2a-rEx11 per la regione di esoni 7-10 che codificano per i siti di legame di calcio [24]. I prodotti di PCR sono stati visualizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio. frammenti anormali sono stati asportati e sequenziati usando avanti e indietro primer per determinare i confini delle eliminazioni e inserimenti. Qui, abbiamo usato BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit pronto Reazione (Perkin-Elmer, Foster City, CA) e sequenziatore automatico ABI PRISM ™ 3100 (Perkin-Elmer) per il sequenziamento
colorazione immunoistochimica
immunoistochimica per l'E-caderina e β catenina è stata eseguita su sezioni di 5 micron da blocchi di tessuto tumorale in paraffina con anticorpi monoclonali e-caderina 5H9 e di capra anti-beta-catenina (indagini diagnostiche, Inc. NJ, USA), rispettivamente, utilizzando il protocollo antigene recupero descritto da Hazelbag et al. [1995]. I tumori sono stati classificati dalla intensità della colorazione come negativo (-), debolmente positivo (+), (++) e (+++) analisi moderatamente positivo fortemente positiva
statistica
Un Χ 2 test o. test esatto di Fisher è stato utilizzato per valutare la relazione tra i parametri di cui sopra.
Risultati
la frequenza di LOH alla regione 16q22.1 era il 75% (Tabella 1).
Tre tumori (6%) ha mostrato lo stesso A592T mutazione missense dell'esone 12, di cui 2 casi avevano mutazione germinale, e un caso aveva mutazione somatica. Informazioni per i polimorfismi rilevati è stato incluso nella tabella 1. Tre di 187 (1,6%) individui normali e 1 su 280 (0,36%) tumori al seno hanno mostrato questa mutazione germinale. La mutazione non venne trovata in 444 altri tumori (Tabella 2) .table 2 Frequenza di A592T mutazione missenso nel carcinoma gastrico, altro cancro e individui normali
Variabili
A592T /totale
%
cancro gastrico
3/50
6 cancro al seno

1/280
0,36
altro cancro *
0/444
0
normale popolazione
3/187
1.6
* compresi colon e del retto, del polmone, endometrio, ovaio, testicolo, del rene, della tiroide e sarcomi carcinomi.
Inoltre, 3 di 280 tumori al seno hanno mostrato un altro mutazione missenso GCC (Ala) → TCC (Ser) al codone 592 identiche, di cui 2 casi sono stati mutazione germinale; il terzo era chiaro perché il tessuto normale non era disponibile. Il tipo istologico dei 4 tumori al seno era duttale.
Nella famiglia di caso 728, abbiamo scoperto che il paziente con cancro della pelle e uno dei pazienti con carcinoma della prostata ha mostrato la stessa mutazione germinale come casi di 728. È interessante notare che, mutazioni sono stati individuati i campioni tumorali di questi due casi. Probabilmente, gli alleli mutati sono stati persi durante lo sviluppo del tumore. L'età di esordio per i casi con mutazioni germinali nel pedigree erano 78 anni per il caso 728, 73 anni per il cancro della pelle e 76 anni per il cancro alla prostata.
Non abbiamo rilevare la mutazione da SSCP e sequenziamento del DNA in esone 3 della il gene β-catenina nei 50 tumori gastrici.
sette tumori gastrici hanno mostrato le trascrizioni aberranti della E-caderina. Tumori 360, 369, 568, 717 e 750 mostrati inserimento di introni 7 fra esoni 7 e 8. Tumori 755 ha mostrato la cancellazione degli ultimi 72 basi dell'esone 7, esone 8 e le prime 124 basi dell'esone 9. Tumori 808 visualizzata due mRNA aberranti, dei quali aveva delezione di esoni 8 e 9, e un caso con delezione degli ultimi 84 basi dell'esone 8 (Tabella 1).
Infine, abbiamo eseguito colorazione immunoistochimica di e-caderina e β-catenina. Una variante regionale della colorazione è stata rilevata attraverso i tumori. Le rigature +/-, ++ /- e +++ /- fare riferimento a celle di oltre il 50% positive, e rigature - cellule /+++ indicando oltre il 50% negativi - /+, - /++ e. Negativo (-) o ridotto (- /+, - /++, - /+++ e +/-) espressione di E-caderina e β-catenina è stato rilevato in 21/50 (42%) e 14/50 ( 28%) casi rispettivamente. Inoltre, per β-catenina IHC, 11 tumori hanno mostrato colorazione citoplasmatica positivo (Tabella 1). Una significativa associazione è stata trovata tra espressione negativa o ridotto di E-caderina e β-catenina (p = 0,048, Χ 2 test). Inoltre abbiamo trovato una associazione tra ridotta espressione di E-caderina e istotipo diffuso (p = 0,04, test esatto di Fisher) Discussione.
L'alta frequenza di LOH alla regione 16q22.1 suggerisce fortemente che ci sono uno o più geni oncosoppressori in questa regione, la cui perdita potrebbe innescare carcinogenesi del cancro gastrico. Il gene E-caderina è stato mappato sul cromosoma 16q22.1 [26]. L'espressione e genica ridotti mutazioni di E-caderina in diversi tipi di tumori tra cui gastrica e il cancro al seno lobulare sono stati identificati, indicando che il gene E-caderina è un gene soppressore del tumore [2-4], [13-17, 27] . In questo studio 3 casi (6%) hanno mostrato l'identico mutazione missenso A592T. I motivi di calcio vincolante situati nei domini extracellulari 1-5 sono considerati come l'elemento chiave per la funzione di E-caderina, dal momento che una molecola sintetica con una singola sostituzione di aminoacidi in un motivo legante il calcio non hanno mostrato alcuna adesività [28] . Inoltre, in linea cellulare umana MKN45 da cancro gastrico, che mancava adesione cellula-cellula stretto, una delezione 4-ammino-acido è stato trovato al confine tra esoni 6 e 7, che è stato considerato per alterare la conformazione circonda il tasto legante il calcio motivi e per l'abolizione della proprietà adesiva della e-caderina molecole [29]. Il singolo sostituzione di aminoacidi nel presente studio si trova entro il quinto dominio extracellulare di E-caderina, in cui un motivo legante il calcio potrebbe esistere. È concepibile, quindi, che le mutazioni nei tre casi funzione della E-caderina distrutti anche. È interessante notare che i tre casi hanno anche dimostrato LOH a 16q22.1 contenente il locus E-caderina. Così si può ritenere che due eventi genetici conseguente inattivazione del gene è verificato nei due alleli del gene E-caderina, rispettivamente. I risultati sopra indicato che il gene E-caderina è un gene soppressore del tumore perché è in conformità con la classica teoria dei due hit per geni oncosoppressori [30]. Precedenti studi di cancro al seno lobulare supportano anche questo parere [4, 14]. In linea di cellule MKN45 di cui sopra (scarsamente differenziato adenocarcinoma) con debole adesione cellula-cellula, a 12 bp nel frame delezione del gene del E-caderina e la perdita del tipo allele selvaggio sono stati rilevati [29]. Ma questa linea cellulare mostrava ancora forte espressione di mRNA e di proteine, il che suggerisce che non solo ridotta espressione, ma anche anomalie strutturali si possono provocare l'inattivazione del sistema di adesione cellulare E-caderina-mediata [29]. Pertanto, una singola sostituzione aminoacidica trovato in questo studio può causare cambiamenti strutturali di E-caderina e causare adesione cellula-cellula limitata, anche se due dei casi (23 e 294) mostrava espressione proteica sufficiente.
Interessante notare che il stessa variante sequenza di mutazione somatica e linea germinale è stato trovato contemporaneamente in diversi pazienti gastrici. Caso 23 con mutazione somatica avuto una età di esordio di 56 anni, ma i casi 294 e 728 con linea germinale mutazione era età di insorgenza di 71 e 78 anni, rispettivamente. Una spiegazione di questo fenomeno potrebbe essere che la perdita del secondo allele di E-caderina nel caso in cui si è verificato il 23 molto presto, così triggerring carcinogenesi relativamente presto nel caso in 23. Ma c'è un'altra possibilità che questa mutazione in caso 23 ha giocato un ruolo solo in progressione il tumore, ma non nella iniziazione, dove altri eventi genetici potrebbero probabilmente responsabili dell'avvio del cancro gastrico. Ma i casi 294 e 728 con mutazioni germinali avevano età insorgenza tardiva. Questo può essere causa l'inattivazione di un altro allele avvenuto molto tardi. Un articolo ha riferito che i portatori obbligatorie con mutazioni tronche in gene E-caderina nei loro anni '80 e '90 sono rimasti inalterati [31]. Pertanto, ulteriore identificazione di modificatori genetici e /o ambientali che potrebbe spiegare la variabile età di insorgenza deve essere effettuata. Specialmente, caso 294 aveva tre tumori allo stomaco, che è in linea con i tumori genetici essendo di norma multipla [30].
La frequenza (6%) di mutazione A592T in 50 tumori gastrici è quasi quattro volte quello della popolazione normale , suggerendo nuovamente che questa mutazione effettivamente contribuito alla tumorigenesi in un sottogruppo di tumori gastrici. Futhermore, 0,36% dei tumori al seno e altri tumori, ha mostrato identica mutazione germinale, che indica che ci potrebbe essere una differenza istologico per questa mutazione nel tumore gastrico e altro cancro.
Solo altri due casi esposti A592T mutazione nella famiglia di caso 728. specialmente, questa mutazione è stata rilevata solo in corrispondenti tessuto normale, ma non nel tessuto tumorale, suggerendo che gli alleli mutanti sono stati persi durante la tumorigenesi. Da questi possiamo concludere che questa mutazione non può giocare un ruolo nella tumorigenesi della prostata e il cancro della pelle, ma potrebbe essere gastrico-cancro specifica.
Concludiamo che la mutazione A592T può aumentare il rischio di sviluppare cancro gastrico, ma è chiaramente una variante sequenza di bassa penetranza. I nostri risultati di due sequenze diverse varianti al codone 592 (A592T e A592S), come linea germinale e mutazioni somatiche, suggeriscono che questo codone è un hotspot di mutazioni nella patogenesi del tumore.
I punti di rottura per inserimenti di introni 7 e delezione di esoni 8 e 9 sono a siti di splicing, in conformità con la regola "GU-AG" per mRNA splicing. Può essere ipotizzato che queste alterazioni non sono stati generati da splicing alternativo, in quanto non evidenze per splicing alternativo sono stati trovati all'interno del gene del mouse E-caderina [32] e non mRNA aberranti sono stati rilevati nei tessuti non tumorali. Le mutazioni nei siti di splicing dovrebbe essere responsabile per le alterazioni della E-caderina mRNA, anche se nessuna mutazione sono stati trovati sul livello del DNA in questo studio, presumibilmente perché il SSCP utilizzato per lo screening di mutazione ha una bassa efficienza. Un ulteriore 2 eliminazioni hanno mostrato i punti di interruzione in siti non-splicing, il cui splicing non è in linea con la regola "GU-AG", forse per indicare che un riarrangiamento di livello genomico può causare gli mRNA aberranti. Studi precedenti hanno dimostrato skipping dell'esone 8 o 9 in cancro gastrico [24, 33]. Queste aberrazioni possono provocare E-cadherins perdere motivi leganti il ​​calcio a causa della mancanza di esoni 8 e 9, e le molecole troncate a causa di mutazioni frameshift causate da inserzioni e delezioni, infine, che facilitano la dispersione delle cellule di carcinoma.
Ridotta espressione di E- caderina e β-catenina è stato trovato in alcuni tipi di cancro, tra cui cancro gastrico [8]. è stato trovato espressione eterogenei o instabile sia per la E-caderina e β-catenina attraverso i tumori. È stato dimostrato che nel 40% degli adenocarcinomi livelli E-caderina sono stati sollevati nelle loro componenti tumorali intravascolari rispetto ai compartimenti extravascolare [34]. Una spiegazione potrebbe essere che l'ingresso di un carcinoma a un compartimento intravascolare è associata ad un upregulation dell'espressione E-caderina, e che la successiva uscita nei tessuti extravascolari è associato downregulation [35]. Poiché E-caderina e β-catenina sono i componenti essenziali per formare complessi di adesione cellula-cellula, perdita di loro può provocare l'interruzione della funzione del complesso, che può causare debole adesione cellula-cellula e conferire proprietà invasive su un tumore . Inoltre, ridotta adesione cellula-cellula è associata a perdita di inibizione della proliferazione di contatto, consentendo fuga dal segnale di controllo della crescita, infine innescando carcinogenesi del cancro umano [8]. In questo studio, un'associazione tra anormale espressione di E-caderina e β-catenina stato trovato, suggerendo che la perdita di legame possono causare una ridistribuzione del β-catenina dalla membrana cellulare al citoplasma E-caderina. L'aumento gratuito β-catenina nel citoplasma potrebbe traslocare al nucleo e portare all'attivazione dell'espressione genica. Questo è supportato dai risultati che due casi (676 e 738) hanno mostrato colorazione negativa sulla superficie interna della membrana e colorazione positiva nel citoplasma, simultaneamente. Ma altre 9 tumori (tabella 1) che mostrano colorazione moderata o forte a membrana esposti anche colorazione positiva nel citoplasma, suggerendo che il normale degrado della libera β-catenina nel citoplasma è inibita. Inoltre, abbiamo trovato un'associazione tra l'espressione anormale di E-caderina e istotipo diffuso, che indica che le alterazioni della E-caderina possono svolgere un ruolo nei tumori gastrici scarsamente differenziato. È interessante notare, espressione aberrante di E-caderina e /o le catenine ha dimostrato di essere un indicatore prognostico indipendente in breve sopravvivenza in pazienti con cancro gastrico [8]. Di particolare interesse è la constatazione che E-caderina è un predittore indipendente di linfonodo occulto e micrometastasi nei nodi classificati come non con metodi istopatologici di routine [8]
. Conclusioni
I nostri risultati supportano che le alterazioni di E-caderina e β-catenina giocano un ruolo nell'insorgenza e nella progressione del cancro gastrico. L'espressione di entrambi i geni sono ridotti nel carcinoma gastrico, ma il meccanismo di regolazione negativa non è chiaro. LOH, mutazioni e alterazioni RNA splicing potrebbe spiegare una parte del down-regulation della E-caderina nel carcinoma gastrico.
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio di Ricerca islandese, l'Università di Scienze Islanda Fondo e l'islandese Cancer Society.
interessi concorrenti
Nessuno dichiarato

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