PLOS ONE: Aumento de la interleucina-32 expresión se asocia con Helicobacter pylori Gastritis

Extracto

Antecedentes

La interleucina-32 (IL-32) es una citoquina proinflamatoria recientemente descubierta, e involucrada en inflamatoria enfermedades. Se determinó la expresión de un mecanismo de IL-32 y su regulación en la respuesta inflamatoria de los pacientes con Helicobacter pylori gratis ( H. Pylori
) la infección.

Diseño y Métodos

IL-32 ARNm y la expresión de proteínas en los tejidos gástricos se detectó por cuantitativa en tiempo real PCR e inmunohistoquímica. La regulación de la IL-32 en la línea celular de epitelio gástrico humano AGS fue investigado por la estimulación de citoquinas diferente y diferente H. pylori
infección por una cepa.

Resultados

gástrico IL-32 mRNA y expresión de la proteína estaban elevados en los pacientes con H. pylori
infección y correlacionó positivamente con la gastritis. En H. pylori
pacientes infectados, el nivel de ARNm de IL-32 también se correlacionó con la de las citocinas proinflamatorias IL-1ß y TNF-a. in vitro hotels, IL-1β y TNF-α podía aumentar la IL-32 ARNm y proteínas en las células AGS, que era dependiente de la vía de señalización NF-kB. La regulación de la IL-32 expresión en respuesta a H. pylori
: infección podría debilitarse mediante el uso de anticuerpos neutralizantes para bloquear IL-1β y TNF-α. Por otra parte, H. pylori
células AGS infectados también inducida por IL-32 mRNA y expresión de la proteína, que dependía de CagA.

Conclusiones

IL-32 nivel es elevado en los pacientes con H . pylori
infección y su expresión está regulada por estímulos proinflamatorios, lo que sugiere que la IL-32 puede jugar un papel en la patogénesis de H. pylori
gastritis -relacionado

Visto:. Peng L-s, Zhuang Y, Li W-h, Zhou Y-Y, Wang T-T, N Chen, et al. (2014) elevada interleucina-32 expresión se asocia con Helicobacter pylori
relacionados con la PI La gastritis. PLoS ONE 9 (3): e88270. doi: 10.1371 /journal.pone.0088270

Editor: Ivo G. Boneca, Instituto Pasteur de París, Francia |

Recibido: 24 Agosto, 2013; Aceptó 8 de enero de 2014; Publicado: 14 de marzo 2014

Derechos de Autor © 2014 Peng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Proyecto de Formación Juvenil de Ciencias Médicas del Ejército de Liberación del Pueblo chino (13QNP108) y el Programa Nacional de Investigación básica de China (973 Programa, Nº 2009CB522606). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Helicobacter pylori
( H. pylori
) es una bacteria Gram-negativa, bacteria microaerophilic que coloniza el estómago de aproximadamente 50% de la población en todo el mundo. La infección persistente de H. pylori ¿Qué causa la gastritis crónica y persistente y aumenta el riesgo de úlcera péptica y cáncer gástrico.

H. pylori
mucosa gástrica infectado con se ha caracterizado por la infiltración de células inmunes y la producción de factores inflamatorios. Th1 y Th2 son reportados para mediar en la respuesta inmune a H. pylori
, y la respuesta Th1 se piensa que es predominante [1]. A continuación, la inducción de la respuesta Th17 en H. pylori del estómago infectado con
se confirma [2]. Además de las células Th1, Th2 y Th17, las células T reguladoras (Tregs) también juegan un papel importante en H. pylori
-relacionado gastritis [3]. Mientras tanto, las citoquinas proinflammtory tales como IL-1β, TNF-α e IL-6 también se han demostrado ser elevados en H. pylori del estómago infectado con
[4], y estas citoquinas podrían influir en la respuesta inmune de las células T en trastornos inflamatorios, lo que sugiere que los factores inflamatorios pueden ser cruciales en H. pylori
inflamación gástrica -relacionado. Sin embargo, el mecanismo exacto del proceso no ha sido totalmente dilucidado.

IL-32 es una citocina proinflamatoria recientemente identificado producida por las células inmunes (células NK, células T, monocitos) y células no inmunes (células endoteliales , células epiteliales) [5] - [7]. Se clonó originalmente como un gen inducido por la IL-2 y llamado NK-4, pero su función era desconocida hasta 2005 [5], [8]. Hay seis variantes de empalme incluyendo IL-32α, β, γ, δ, ε, y ζ, y diversos papeles están potencialmente interpretados por sus diferentes isoformas. Sin embargo, un receptor específico para IL-32 no se ha descubierto, aunque proteinasa de neutrófilos 3 se une a IL-32 con una alta afinidad [9]. IL-32 juega un papel importante en diversos trastornos inflamatorios y su expresión se ha demostrado que se correlaciona con la gravedad de las enfermedades en la artritis reumatoide, la enfermedad y dermatitis atópica de Crohn [10] - [12]. Por otra parte, la IL-32 había sido implicado en algunas enfermedades infecciosas como H. pylori
la infección [13] - [16]. Sin embargo, la asociación entre IL-32 expresión y H. pylori
gastritis inducida y su mecanismo de regulación exacta incluyendo si automatiza /paracrinos efectos sobre la expresión de IL-32 puede estar involucrado en el proceso fue siguen siendo desconocidos.

En el presente estudio, se detectó IL -32 expresión en muestras de biopsias de pacientes con H. pylori
infección y se analizó la relación entre gástrico nivel de IL-32 y de la gravedad de la inflamación de la mucosa. Posteriormente, se analizó el impacto de los estímulos proinflamatorios y H. pylori
infección en IL-32 expresión en líneas celulares de epitelio gástrico humano. Nuestros resultados mostraron que la IL-32 podría estar implicado en la patogénesis de H. pylori
gastritis -relacionado.

Materiales y Métodos

Declaración de Ética

biopsias de la mucosa gástrica humana se recogieron mediante endoscopia de rutina en el Hospital Xinqiao de la Tercera Universidad Médica Militar . La sangre se obtuvo de la misma materia que se sometieron a una endoscopia para H. pylori
examen de serología. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Xinqiao, Tercera Universidad Médica Militar. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada tema

Los sujetos

tejidos gástricos y la sangre se obtuvieron de 54 pacientes. (hombre /mujer = 27/27, con una edad promedio de 47 ± 1,2 años) con H. pylori
infección que se sometieron a una endoscopia en el Hospital Xinqiao de la Tercera Universidad Médica Militar. H. pylori
infección fue confirmada por la prueba rápida de ureasa-, serología, ^{13 C-urea prueba de aliento y la histología. Los pacientes fueron clasificados como H. pylori
positivo si dos de las cuatro pruebas fueron positivas. tejidos gástricos normales a partir de 47 sujetos (hombres /mujeres = 23/24; edad media 47 ± 1,3 años). que tuvieron resultados negativos para las cuatro pruebas se inscribieron como controles}

especímenes de biopsia y Evaluación Histología

las muestras de biopsia se tomaron de los sujetos en cada una endoscopia. Uno se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C para la extracción de RNA. El resto de las muestras de biopsias se fijaron en formalina y embebidos en parafina. Hematoxilina-eosina (H & E) manchadas secciones fueron examinadas por dos anatomopatólogo con experiencia. La gravedad de la gastritis histológica se calificó de normal a severa en base a la densidad de la infiltración de células mononucleares y polimorfonucleares de acuerdo con los criterios establecidos [17], [18].

Cell Cultura y

El gástrica línea epitelial AGS (ATCC, American Type Culture Collection) se cultivó a 37 ° C y 5% de CO _{2 en F12 de Ham (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.), que contenía suero de ternera fetal 10% (FCS). Las células AGS se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 1 × 10 ^{6 células /pocillo y se estimularon con 10 ng /ml de TNF-α y /o 10 ng /ml de IL-1β (Peprotech, Rocky Hill, NJ , ESTADOS UNIDOS); Se recogieron las células en los tiempos indicados para análisis de IL-32 ARNm y la expresión de proteínas. Para el ensayo de inhibición de la vía de señalización, inhibidor de NF-kB (BAY 11-7082), MEK1 /2 inhibidor (U0126), p38 /inhibidor de MAPK (SB203580), inhibidor de JNK (SP600125), JAK inhibidor I (todos a 10 M y todas de Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.) o el vehículo DMSO (Sigma, Saint Louis, MO, EE.UU.) se añadieron al cultivo de células 1 hora antes de la estimulación de citoquinas.}}

Infección de células AGS con MARIDO. pylori

H. pylori
11637 cepa y su isogénica CagA-negativos cepa mutante (CagA ^{- deformación) se cultivaron en placas de infusión de cerebro y corazón con sangre de conejo 10% a 37 ° C bajo condiciones microaerophilic (5% O _{2 , 10% de CO 2, el 85% de N 2). H. pylori
se lavó de las placas de cultivo con PBS y se centrifugó a 2500 xg durante 5 min, antes de ser resuspendido en PBS para la cuantificación de densidad óptica a 600 nm (1 OD 600 = 1 × 10 9 H. pylori
/ml). Una multiplicidad de infección (MOI) de 1, 10, y 100 se utilizó para infectar células AGS. Para los ensayos de neutralización, anticuerpos neutralizantes contra el TNF-α (α-nTNF, 1 g /ml, Biolegend) o IL-1β (Nil-1β, 1 g /ml, eBioscience) se añadió en el sistema de cocultivo.}}

Aislamiento de ARN y cuantitativa en tiempo real PCR

se extrajo ARN de muestras de biopsia o células de TRIzol Reagent® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) y transcribe a invertir cDNA utilizando ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japón). Quantitative PCR en tiempo real se llevó a cabo por el sistema de detección de iQ5 (Bio-Rad, EE.UU.). Los cebadores de PCR se diseñaron para cruzar una frontera exón-intrón y se usan para detectar la expresión de ARNm de IL-32, TNF-α, IL-1β y β-actina y sus secuencias son las siguientes: IL-32, hacia adelante, 5 ' -ACGACTTCAAAGAGGGCTACC-3 '; revertir, 5'-GCCTCGGCACCGTAATCCAT-3 '; TNF-α, adelante, 5'-TCTCTAATCAGCCCTCTGGC-3 '; revertir, 5'-ATGAGGTACAGGCCCTCTGA-3 '; IL-1β, adelante, 5'-GTTCTTTGAAGCTGATGGCC-3 '; revertir, 5'-GTGGTCGGAGATTCGTAGCT-3 '; β-actina, adelante, 5'-TTCCTTCCTGGGCATGGAGTCC-3 '; revertir, 5'-TGGCGTACAGGTCTTTGCGG-3 '. β-actina se utilizó como control interno. La expresión génica relativa se calculó como factor de cambio por el método ΔΔCt.

La inmunohistoquímica

Cuarenta muestras incluidas en parafina se cortaron en secciones de 5 micras. Después de ser deparaffinized e hidratada, las secciones en tampón de citrato (pH = 6,0) se sometieron al calor inducida por la recuperación de antígenos en un horno microondas y se trata con peróxido de hidrógeno al 3%. Después de la incubación con conejo anti-IL-32 (Abcam, MA, EE.UU.) durante la noche a 4 ° C, diapositivas fueron tratados con el anticuerpo secundario anti-conejo-peroxidasa de rábano conjugada (Zhongshan puente Golden Biotech., Pekín, China) seguido de sustrato 3,3 '-Diaminobencidina tetrahidrocloruro (DAB). Isotipo de anticuerpo emparejado se utilizó como control negativo. Las imágenes fueron adquiridas en un microscopio equipado con una cámara digital Nikon Eclipse 80i (Tokio, Japón). Para el análisis semi-cuantitativo de la inmunohistoquímica, cada sección fue elegido para la evaluación de IL-32 inmunotinción en los tejidos gástricos y se calificó de la siguiente manera: Puntuación 0, no expresión; una puntuación de 1, baja expresión; Resultado 2, la expresión intermedia; puntuación 3, de alta expresión.

Western Blot

Las células se lavaron en PBS enfriado con hielo y luego interrumpidas en tampón de lisis (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de Triton X-100, pirofosfato de sodio 2,5 mM, glicerofosfato 1 mM, Na3VO4 1, 1 mg /ml de leupeptina y el inhibidor de la proteasa). La concentración de proteína se midió con un kit de ensayo de proteínas BCA (boster, Wuhan, China). Los lisados ​​celulares se separaron por 12% SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon durante 1 h con 3% de albúmina de suero bovino en solución salina tamponada con Tris-Tween a temperatura ambiente y después se incubaron durante la noche a 4 ° C con conejo anti-humano IL-32 (Abcam, MA, EE.UU.) o anti-ratón β-actina humana ((Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd, china). el rábano picante anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa fue utilizado según las instructures del fabricante. las proteínas de interés se visualizaron mediante el uso de reactivos sustrato Duración Supersignal® West Dura (Thermo, IL , EE.UU.).

análisis estadístico

Todos los resultados se resumieron como media ± error estándar de la media (SEM), y el análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism 5.0. las diferencias entre los dos . grupos se analizaron por los grupos de ensayo y múltiples Mann-Whitney U se analizaron mediante un análisis de una vía de la varianza (ANOVA) Cuando se detectaron variaciones, se usó la correlación de Spearman para evaluar el grado de asociación entre las variables P <. 0,05 se consideró estadísticamente significativa.

resultados

elevada de IL-32 mRNA nivel detectado en pacientes con H. pylori
infección

Para estudiar si la IL-32 está implicada en la patogénesis de la H. pylori
indujo gastritis, primero se determinó la expresión de ARNm de IL-32 en muestras de biopsias gástricas de los sujetos con y sin H. pylori
infección. Como se muestra en la Fig. 1A, IL-32 expresión fue significativamente mayor en H. pylori
muestras positivas a que en H. pylori
muestras gramnegativas (P < 0,001). Para evaluar si la expresión de IL-32 se relaciona con el grado de inflamación en H. pylori
muestras gástricas infectados, se dividieron las muestras en grupos gastritis normales y leves, moderados y severos en base a la evaluación de la histología como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados mostraron que los niveles de IL-32 mRNA en H. pylori
muestras -positivas se correlacionó positivamente con el grado de inflamación gástrica (Fig. 1B). Por otra parte, el nivel de IL-32 mRNA también mostró una correlación positiva con TNF-α y los niveles de IL-1β de ARNm (Fig. 1C).

El aumento de IL-32 expresión de proteínas en pacientes con H. La infección pylori

Para visualizar la IL-32 expresión en muestras de biopsias gástricas, la tinción inmunohistoquímica de IL-32 se realizó en tejidos incluidos en parafina. Como se muestra en la Fig. 2B, algunas de las células IL-32 productoras se detectaron en H. pylori
tejidos gástricos-negativos, mientras que en H. pylori
tejidos gástricos -positivos, se observó que la IL-32 expresión de la proteína se incrementó significativamente (Fig. 2C). Además, la evaluación semi-cuantitativa de IL-32 inmunoreactividad confirmó que la expresión de IL-32 en los tejidos gástricos de H. pylori
pacientes infectados a nivel de proteínas se aumentó también significativamente en comparación con los de H. pylori
tejidos gástricos-negativos y en la gastritis leve.

IL-32 ARNm y proteínas se upregulated por el TNF-α e IL-1β

Debido a que se encontró una relación positiva entre la IL -32 niveles de mRNA y el grado de inflamación gástrica en los tejidos gástricos y correlación entre IL-32 e IL-ARNm 1β y TNF-α ARNm, la regulación de las citoquinas proinflamatorias IL-32 en la expresión de ARNm se investigó en células AGS. Como se muestra en la Fig. 3A, después de ser tratado con citoquinas durante 24 horas, IL-32 el nivel de ARNm se upregulated significativamente: 5,0 ± 0,5 veces por TNF-α, 6,9 ± 0,5 veces mediante IL-1β, y 11,2 ± 1,4 veces mediante IL-1β y TNF-α. Este efecto era completamente dependiente de la vía de señalización NF-kappa B como tratamiento previo con inhibidor de NF-kB BAY 11-7082, pero no JNK, p38 /MAPK, inhibidores de la señalización MEK1 /2 o JAK /STAT inhibió la inducción de IL-32 mRNA después de la estimulación por TNF-α o IL-1β (Fig. 3C). Además, Western blot confirmó que la IL-32 nivel de proteína también fue inducida por TNF-α y /o la estimulación de IL-1β que dependía de NF-kB vía de señalización (Fig. 3B y D). A continuación estudiamos si el TNF-α o IL-1β participó en H. pylori
la regulación positiva de la expresión inducida por IL-32. células AGS fueron infectados con H. pylori
y se trató simultáneamente con anticuerpos neutralizantes para bloquear TNF-α o IL-1β. Como se muestra en la Fig. 3E, H
. pylori
inducida por la expresión de la proteína IL-32 se redujo significativamente mediante el uso de anticuerpos que bloquean las citocinas indicadas.

H. pylori
inducida por IL-32 Expresión

Para estudiar más a fondo el efecto directo de H. pylori
en la expresión de IL-32 en las células epiteliales gástricas, las células AGS se infectaron con H. pylori
a una MOI de 1, 10, y 100. Como se muestra en la Fig. niveles 4A y B, IL-32 ARNm y proteínas se incrementaron después de H. pylori
infección de una manera dependiente de la dosis. A continuación analizaron si H. pylori
diferencias de las cepas contribuirían a diferente expresión de IL-32. Las células fueron infectadas con el H. pylori 11637
tensión y CagA ^{- cepa. Aunque CagA - infección por una cepa aumentó ligeramente la expresión de IL-32 en células AGS, la inducción de IL-32 ARNm y proteínas CagA por - infección por una cepa fue significativamente inferior a la de H. pylori 11637
infección por una cepa (Fig. 4C y D).}

Discusión

En el presente estudio, se observó que gástrica IL-32 fue significativamente elevado en los pacientes con H . pylori
la infección, tanto en los niveles de proteína y ARNm. El nivel de ARNm de IL-32 aumentado correlaciona con la severidad de la inflamación gástrica. Además, los niveles de ARNm de IL-32 también se correlacionaron con el TNF-α e IL-1β de ARNm en H. pylori
muestras de biopsia gástrica positivos, y cualquiera de las dos citoquinas podría regular positivamente el ARNm de IL-32 y el nivel de proteína. Por otra parte, se encontró que los H. pylori
infección de líneas de células epiteliales gástricas también inducida por la IL-32 mRNA y expresión de la proteína. Estos resultados indican que la IL-32 es probable que participan en la inflamación gástrica de pacientes con H. pylori
infección.

IL-32 fue descrita recientemente como un factor proinflammtory implicado en muchos trastornos inflamatorios como la rinosinusitis crónica, una condición en su mayoría causadas por bacterias Gram positivas infección por bacterias [19], [20]. Elevada de IL-32 se informó a continuación, en el VHC y el hígado infectado con HBV y que se correlaciona con la severidad de la inflamación hepática y fibrosis hepática [15], [21]. En este estudio, hemos demostrado que la IL-32 mRNA nivel fue significativamente elevado en los pacientes con H. pylori
infección, y también se observó una alta correlación entre IL-32 mRNA y la inflamación gástrica, lo que sugiere que la IL-32 puede jugar un papel importante en H. pylori del estómago
infectados. Además, se utilizó la inmunohistoquímica para detectar la fuente de IL-32 y los resultados mostraron que la IL-32 se expresó en células epiteliales gástricas y se observó su expresión en altamente H. pylori
tejidos gástricos positivos. Debido a que la IL-32 se encontró para inducir la producción de IL-8 en células epiteliales gástricas e inhibió la secreción del factor VEGF proangiogénico por las células epiteliales bronquiales [16], [22], y también observó IL-32 mRNA nivel se correlacionó positivamente con IL-8 expresión (datos no mostrados). Es razonable que la IL-32 influyen en la función de las células epiteliales gástricas en H. pylori del estómago
infectados
.

La inflamación gástrica clásico con H. pylori
infección puede estar influenciado por la infiltración de células inmunes y citoquinas inflamatorias, la posterior puede incluir el recientemente descubierto IL-32 [19] - [22]. En nuestro estudio, encontramos que el TNF-α in vitro y /o IL-1β estimularon las células AGS regular al alza IL-32 mRNA y expresión de la proteína, que apoyó una relación positiva entre la IL-32 y TNF-α e IL-1β in vivo . Sin embargo, Th17 de citoquinas (IL-17A, IL-17F, IL-6), citocina Th2 IL-4, Tregs de citoquinas TGF-β1 y de citoquinas Th1 IFN-gamma todos fracasaron para inducir IL-32 ARNm y la expresión de proteínas en nuestro sistema, aunque se informó de todos los tipos de células inmunes relevantes y citoquinas para infiltrarse H. pylori del estómago
infectados (véase la figura S1). Estos resultados sugieren que la IL-32 es probable produjo antes de la infiltración de estas células, que se apoya en el informe que la IL-32 induce la maduración de células dendríticas y promueve la Th1 y Th17 polarización [23]. Por otra parte, la inducción de IL-32 ARNm y proteínas de TNF-α o IL-1β fue bloqueada por el inhibidor de NF-kappa B POR 11 a 7082, lo que indica que el mecanismo molecular que subyace a este proceso es probable NF-kappa B dependiente. Curiosamente, el uso de anticuerpos neutralizantes para bloquear TNF-α o IL-1β en paralelo con H. pylori
infección, se observó que IL-32 nivel de proteína se redujo significativamente. Por lo tanto, nuestros resultados indican que las citoquinas epiteliales (TNF-α e IL-1β) como respuesta a H. pylori
infección eran importantes para la regulación de la expresión de IL-32.

Nuestros resultados también mostraron que el nivel de ARNm y proteínas IL-32 se incrementaron en una forma dependiente de la dosis después de H. pylori
infección, lo que sugiere que el efecto de H. pylori
infección sobre la expresión de IL32 es directamente fisiológica. Además, las mutaciones CagA en H. pylori
podría debilitar significativamente la expresión de IL-32 en células AGS, lo que indica que H. pylori
inducida por IL-32 la regulación positiva dependía de CagA. H. pylori
expresar muchas proteínas para facilitar su patogénesis [24]. UreB es también una proteína de virulencia importante para la colonización de H. pylori Opiniones y mediada por H. pylori
disfunción inducida por la barrera gástrica [25], [26]. Se encontró que las mutaciones UreB también atenuados H. pylori
inducida por la expresión de ARNm de IL-32 (véase la figura S2). Por lo tanto, la expresión de IL-32 fue generalmente regulado por la translocación de CagA en las células epiteliales y otras proteínas de virulencia también puede influir en la respuesta patogénica de H. pylori
a las células epiteliales gástricas.

En conclusión, nuestros datos demuestran que la IL-32 expresión fue elevado en los pacientes con H. pylori
infección y correlaciona con la severidad de la inflamación gástrica. La regulación de la IL-32 expresión en respuesta a H. pylori
infección depende de diferentes factores que interactúan. Estos datos juntos sugieren que la IL-32 puede jugar un papel importante en la patogénesis de la gastritis causada por H. pylori
infección.

Apoyo a la Información
Figura S1.
células AGS se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 1 × 10 ^{6 células /pocillo y se estimularon con 10 ng /ml de citoquinas Th17 (IL-17A, IL-17F, IL-6), Th2 citocina IL-4, Tregs de citoquinas TGF-β1 y citoquinas Th1 IFN-γ durante 24 horas, y las células se recogieron para el análisis de IL-32 ARNm y la expresión de proteínas. Los datos son la media ± SEM de tres experimentos separados y se mostró una mancha representante
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088270.s001 gratis (TIF)
figura S2.
H. pylori cepa 26695
se cultivaron en placas de infusión de cerebro y corazón con sangre de conejo 10% a 37 ° C bajo condiciones microaerophilic (5% O _{2, 10% de CO 2, el 85% de N 2 ), y su isogénica subunidad B de la ureasa negativo cepa mutante (UreB - deformación) se obtuvo como antes se ha descrito [27]. Una multiplicidad de infección (MOI) de 100 se utilizó para infectar células AGS y GES-1. Las células se recogieron para el análisis de expresión de ARNm de IL-32. Los datos son la media ± SEM de tres experimentos separados. * P Hotel < 0,05; ** P Hotel < 0,01; *** P Hotel < 0,001
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088270.s002 gratis (TIF)}}

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