PLoS ONE: Mangiferin mildert Magengeschwür in Ischemia /Reperfusion Ratten: Die Beteiligung von PPAR-γ, NF-kappaB und Nrf2 /HO-1 Signaling Pathways

Abstrakt

Mangiferin (MF), ein xanthonoid von Mangifera indica, bewiesen wurde antisekretorische und Antioxidans magenschützende Wirkung gegen verschiedene Magengeschwür Modelle zu haben; jedoch hat seine molekulare Mechanismus bisher nicht aufgeklärt worden. Daher war das Ziel dieser Studie seine modulierende Wirkung auf mehrere Signalwege zu testen, die Ischämie /Reperfusion-Modell zum ersten Mal verwendet wird. Die Tiere wurden mit MF, Omeprazol (OMP) behandelt, und das Fahrzeug. Die mechanistischen Studien zeigten, dass MF seine gastroprotektive Wirkung vermittelt zum Teil über Induktion der Expression von Nrf2, HO-1 und PPAR-γ zusammen mit der von NF &kgr; B Herunterregulieren. Überraschenderweise lag die Wirkung von MF, insbesondere der hohen Dosis, dass mit Ausnahme von Nrf2 von OMP vermittelt. Die molekularen Ergebnisse wurden auf den Biomarker reflektiert gemessen, wobei die antioxidative Wirkung von MF durch die Erhöhung gesamte antioxidative Kapazität und Glutathion manifestiert wurde, neben Malondialdehyd Niveau normalisieren. Zusätzlich verringert die MF I /R-induzierten Stickstoffmonoxid-Elevation, einen Effekt, der als der OMP besser war. Im Serum, Dosis MF, abhängig, endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase verbessert, während die induzierbare Isoform reduziert. Im Hinblick auf die entzündungshemmende Wirkung von MF, es reduziert Serumspiegel von IL-1β und sE-Selektin, Effekte, die auf dem Gewebeniveau von Myeloperoxidase, die neutrophile Infiltration Marker gespiegelt wurden. Darüber hinaus besaß MF eine anti-apoptotische Charakter bewiesen durch Bcl-2-Ebene erhebt und dass von Caspase-3 in einer dosisabhängigen Reihenfolge zu reduzieren. Als Abschluss werden die deuteten gastroprotektive Mechanismen MF vermittelten, durch Modulation von oxidativem Stress, Entzündung und Apoptosis möglicherweise über die Nrf2 /HO-1, PPAR-γ /NF &kgr; B-Signalwege teilweise.

Citation : Mahmoud-Awny M, Attia AS, Abd-Ellah MF, El-Abhar HS (2015) Mangiferin mildert Magengeschwür in Ischemia /Reperfusion Ratten: Die Beteiligung von PPAR-γ, NF-kappaB und Nrf2 /HO-1 Signalwege. PLoS ONE 10 (7): e0132497. doi: 10.1371 /journal.pone.0132497

Editor: Ashraf B. Abdel-Naim, Fakultät für Pharmazie, Ain Shams University, Ägypten

Empfangen: 18. März 2015; Akzeptiert: 15. Juni 2015; Veröffentlicht am: 21. Juli 2015

Copyright: © 2015 Mahmoud-Awny et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten innerhalb des Papiers sind

Finanzierung:.. die Autoren haben keine Unterstützung oder Finanzierung zu berichten

konkurrierende Interessen:. die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einleitung

Während der Magengeschwür Krankheit Wohlstand Upshots zu Not, das Gleichgewicht zwischen der zerstörerischen und den Schutz Ereignisse versammelt. Oxidativer Stress ist ein wichtiger Faktor, Magengeschwür und führt zur Überproduktion von freien Radikalen (FRS) [1] erzeugt. Die Magen-Ischämie /Reperfusions (I /R) Urbild nachahmt-Stress induzierte Magengeschwür, wobei in diesem Fall erhöhte FRs, Stickstoffmonoxid (NO), Leukozyten- Adhäsionsmolekül "E-Selektin" [2], Neutrophilen-Infiltration [3], Redox-Ungleichgewicht [4] eine wesentliche Rolle in der Pathogenese spielen. nuclear factor-kappa B (NF &kgr; B), ein Redox-sensitive Transkriptionsfaktor, weist ebenfalls eine zentrale Rolle in der I /R Verletzung [5]. Es reguliert die Expression von mehreren Genen, die mit Entzündung und Zellverletzung verbunden sind, wie Interleukin (IL) -1β, -6, zelluläre Adhäsionsmoleküle und induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS). Auf der anderen Seite, die Gastroprotektion gegen oxidative Schädigung mehrere Faktoren durch die Linderung der Entzündungsreaktion zu vermitteln, dazu gehören Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor (PPAR) -γ [6, 7] und heamoxygenase-1 (HO-1) [8]. Letzteres ist die induzierbare Isoform der HO, die, wie oxidativer Stress und es bleibt weithin als Schutzmechanismus gegen oxidativen Gewebeverletzung [9] Spannungen reagiert.

Eine der Transkriptionsregulatoren von HO-1 ist die nuclear factor-E2-verwandten Faktor-2 (Nrf2) [9], die in dem Zytoplasma unter normalen Bedingungen lokalisiert ist und mit Keap1 (der molekularen Sensor cysteinreiche Protein Kelch-like ECH assoziieren protein 1) schnell abgebaut werden, durch das Ubiquitin-Proteasom-Weg [10, 11]. Umgekehrt, unter oxidativen Stressbedingungen wird Keap1 oxidiert und Nrf2 Ubiquitinierung gesenkt wird [11], zu befreien, damit Nrf2 von Keap1. Nrf2 wird dann in den Zellkern transloziert mit dem Antioxidans-Response-Element des Zielgens Promotor anbinden [12, 13] mit sofortiger Transaktivierung der kodierenden Gene. Diese Gene umfassen viele enzymatische Antioxidans und Entgiftungsgene, wie Glutathion (GSH) Peroxidase /Reduktase, HO-1 und GSH-S-Transferase [14].

Mangiferin (MF), ein natürlich vorkommendes glucosylxanthone besitzt eine gastroprotektiver Wirkung über
seine antisekretorische und Antioxidantien-Aktivitäten, wie in verschiedenen Tiermodellen von Magengeschwürbildung überprüft [15], aber nicht die I /R-Modell, das das Ziel der vorliegenden Arbeit ist. MF wurde berichtet seine antioxidative Wirkung auf verschiedenen Ebenen der oxidativen Sequenz zu vermitteln. Es erzeugt MF Phenoxyreste und bindet an Metallionen (Fe ^{2 + /3 +) in der Form einer stabilen MF-Eisen-Komplex, der nicht die Erzeugung von Hydroxyl (OH) Radikale und /oder oxo-Ferryl erlaubt Gruppen und abfängt Lipid peroxy /Alkoxyreste, wobei das zellulare oxidations Antioxidans Gleichgewicht beibehalten [16]. Trotz der detaillierten zellulären Reaktionen beschrieben, jedoch hat die molekularen Signalwege nicht vor in Angriff genommen worden.}

Auf molekularer Ebene ist die vorliegende Ziel war es, die mögliche Beteiligung von Nrf2 /HO-1, PPAR und NF zu bewerten -κB signal~~POS=TRUNC in der gastroprotektiver Wirkung von MF, neben anderen Biomarkern die möglichen magen Mechanismen zu beschreiben, die Hypoxie /Reoxygenierung Modell.

Material und Methode

Tiere

Männlich Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 180-220 g (Research Institute of Ophthalmology, Giza, Ägypten) wurden auf einem 12h Hell /dunkel-Zyklen, konstante Umgebungsbedingungen gehalten und wurden auf eine richtige Ernährung Futter und Wasser gehalten ad libitum
. Vor dem Versuch (24 hrs) Alle Tiere wurden einzeln in weitmaschig Bodenkäfigen gehalten und fasteten. (PT 575 Permit Number) Die Tiere wurden nach den Richtlinien von der Animal Care und Use Committee der Fakultät für Pharmazie, Universität Kairo, Kairo, Ägypten genehmigt behandelt. Alle chirurgischen Verfahren wurden unter Thiopental durchgeführt, und alle Anstrengungen unternommen wurden, um das Leiden zu minimieren.

Drugs

Mangiferin [MF] von Sigma-Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO erworben wurde, USA) und Omeprazol [OMP] von Chemo SA (Lugano, Schweiz). Alle anderen Chemikalien und Reagenzien waren von analytischer Qualität. MF und OMP wurden in Kochsalzlösung gelöst, um intraperitoneal injiziert werden.

Induktion der Magenschleimhaut Ischämie /Reperfusions (I /R) und Behandlungen

Die I /R-Modell wurde nach dem Verfahren durchgeführt, die zuvor von Kotani et al. [17] mit einigen Modifikationen. Kurz gesagt, unter Thiopental (50 mg /kg, i.p.) wurde die Ratte abdominalen Arterie für 30 min okkludiert., Wonach Reperfusion durch Entklemmspannung die Arterie für 72 Stunden gelassen. Ratten wurden in 5 Gruppen zugeteilt (n = 7-9); Tiere in der ersten empfangenen Gruppe Salzlösung und die abdominale Arterie behandelt wurde, ohne Spann als scheinoperierten Kontrollgruppe dienen. Ratten in den folgenden Gruppen wurden zu I /R unterworfen; der unbehandelten (zweiten) Gruppe erhielt Kochsalzlösung und wurde als positive Kontrolle (I /R), während die anderen drei Gruppen behandelt wurden, mit MF bezeichnet (10 mg /kg; MF _{10; dritte Gruppe), MF ( 20 mg /kg; MF 20; vierte Gruppe) und OMP (20 mg /kg; OMP 20; fünfte Gruppe). Alle Behandlungen wurden 30 min durchgeführt. vor der Operation und 3 Tage nach der Reperfusion.}

Die histopathologische Untersuchungen

Magen, aus drei repräsentativen Tiere in jeder Gruppe wurde sofort in 10% Formalin-Kochsalzlösung getaucht, in Paraffin eingebettet und 5 um Abschnitte wurden hergestellt, mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt und mikroskopisch untersucht

Biochemische Messungen

Am Ende der Reperfusion Zeit und unter tiefer Äthernarkose, Blut von gesammelt wurde. die Jugularvene Seren herzustellen, wurden dann Tiere getötet und der Magen wurde herausgeschnitten, entlang der großen Kurvatur geöffnet und mit einer eiskalten Salzlösung gespült. Das Ausmaß der Brutto Schädigung der Schleimhaut (Ulcus-Index) als Summe von Geschwüren Längen pro Magen in mm [18] bewertet und. Kurz gesagt, wurde eine beleuchtete Lupe (3x) verwendet, um die Länge der langen Läsionen (mm) im Drüsenteil des Magens zu messen, während die petechea Läsionen und jeweils fünf Läsionen als 1 mm von Geschwüren dargestellt wurden gezählt wurden.

Über 50 mg der Magenschleimhaut wurde über Nacht in RNA später Lösung getaucht, bei -80 ° C bis quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) Quantifizierung gespeichert. Die verbleibende Schleimhaut wurde abgeschabt und in eiskaltem Salzlösung (MPW-120, Polen) mit der maximalen Geschwindigkeit für 1 min homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 4 ° C für 5 min bei 5000 rpm zentrifugiert und die resultierenden Überstände wurden in Aliquots und gelagert bei -80 ° C bis zur Bestimmung der Magenparameter.

Estimation Homogenat /Serumparameter unter Verwendung von ELISA gehalten Technik

Das Homogenat /Serumspiegel der folgenden Parameter ausgewertet wurden, um die entsprechenden ELISA-Kits, wie in Klammern angegeben:.. IL-1β, sE-Selektin (Abcam Inc., Cambridge, UK, Cat No. ab100768 und ab171334, beziehungsweise), iNOS, eNOS (EIAab, Wuhan, China, Cat No. E0837r und E0868r, beziehungsweise), B-Zell-Leukämie /Lymphom-2 (Bcl-2;. USCN Life Science Inc., Wuhan, China, Katze Nein. E90778Bo.) und Caspase-3 (Cusabio Biotech Co., Wuhan, China, Kat. Nr CSB-E08857r). Jeder Biomarker wurde verarbeitet gemäß den Herstellerverfahren zur Verfügung gestellt. Serum gesamte antioxidative Kapazität (TAC) wurde mit der Methode von Benzie und Starin gemessen [19]. Kurz gesagt, wurde Ferri tripyridyltriazine (Fe ^{3 + -TPTZ) -Komplex durch die Antioxidantien bei einem sauren pH-Wert in der Probe vorhandenen zu dem eisenhaltigen Form reduziert, eine intensive blaue Farbe zu ergeben, die bei durch die Messung der Änderung der Extinktion überwacht werden kann 593 nm. Die Änderung wird die kombinierte oder Gesamt-Reduktionskraft des elektronenabgebenden nichtenzymatische Antioxidantien in der Reaktionsmischung unmittelbar verbunden. Die TAC wurde als &mgr; M /L ausgedrückt.}

Die Einschätzung der Magen-Aktivität /Gehalt von Myeloperoxidase (MPO), Malondialdehyd (MDA), reduziertes Glutathion (GSH) und Gesamt-Stickoxid (NOx).

Die Aktivität von MPO (U /g), einem Marker von Gewebe neutrophile infitration wurde nach Bradley et al beurteilt. [20]. Das Verfahren basiert das Wasserstoffperoxid-abhängige Oxidation von o-Dianisidin nach Messung durch MPO katalysiert, die zur Bildung einer Verbindung führt bei 460 nm eine erhöhte Extinktion aufweisen. Als Index der Thiobarbitursäure reaktive Substanzen Lipidperoxidation (TBARS), von MDA dargestellt, wurde verwendet, um die oxidative Schädigung zu bestimmen, nach dem Verfahren von Mihara und Uchiyama [21]. Das MDA-TBA-Addukt entwickelt rosa Farbe, die von n-Butanol und gemessen bei zwei Wellenlängen extrahiert, nämlich
., 520 und 535 nm. Das beschriebene Verfahren von Ahmed et al. [22] erlassen, um die Nicht-Protein-Sulfhydrylgruppen (hauptsächlich GSH) durch Reaktion mit Ellman-Reagenz nach Ausfällen der Protein SH-Gruppen zu bewerten. Die Reaktion mit Ellman-Reagenz eine stabile gelbe Farbe von 5 mercapto-2-nitrobenzoesäure gebildet, die colorimetrisch bei 412 nm (mg /g) gemessen.

Magenschleimhaut NO-Produktion indirekt als Nitrit /Nitrat-Konzentration geschätzt wurde nach der Methode von Miranda et al. [23], wobei Vanadiumtrichlorid verwendet wurde, Nitrat zu Nitrit zu reduzieren. Die rosafarbene Azofarbstoff durch die Reaktion von Nitrit mit Sulfanilsäure durch die anschließende Kupplung mit N- (1-naphthyl) -ethylendiamin wurde bei 540 nm und NOx gemessen wurde kolorimetrisch uM /gm ausgedrückt folgt hergestellt.

Quantitative Echtzeit (RT) -PCR

die Gesamt-RNA wurde aus der Magenschleimhaut extrahiert einfach P Gesamt-RNA Extraction Kit (BioFlux, Hangzhou, China). Die Reinheit der erhaltenen RNA wurde spektrophotometrisch trisch bei 260/280 nm überprüft. Gleiche Mengen von RNA (0,368 &mgr; g) wurden in erster Strang komplementärer DNA (cDNA) für 50 min bei 37 ° C retrotranskribierten. unter Verwendung von 200 U /&mgr; l M-MuLV reverse Transkriptase (SibEnzyme, Novosibirsk, Russland), 1 ul Zufalls Hexamer (Qiagen, LRS Laboratories, Inc. Korea) und 0,1 M DTT in einem 50 ul Reaktionsgemisch. Um die Expression von Antioxidationsmittel und entzündungsbedingte Zielgene, RT-PCR wurde beurteilt durch den Hersteller unter Verwendung von SYBR green PCR Master Mix (Qiagen) beschrieben durchgeführt. grün auf 12,5 ul 2x SYBR Master in einem 25 ul Reaktionsvolumen, 5 ul cDNA hinzugefügt Mischung und 2,5 ul (2,5 uM) jedes Primers Kurz gesagt wurde. Die Sequenzen der Primer waren: PPAR-γ-Sense-Primer 5'-GCGGAGATCTCCAGTGATATC-3 '; Antisense-Primer 5'-TCA GCGACTGGGACTTTTCT-3 '; NF-kappaB p65-Sense-Primer 5'-TGCAGAAAGAAGACATTGAGGTG-3 '; Antisense-Primer 5 'AGGCTAGGGTCAGCGTATGG-3'; Nrf2-Sense-Primer 5'-ATGGCC ACACTTTTCTGGAC-3 '; Antisense-Primers 5'-AGATGTCAAGCGGGTCACTT-3 '; HO-1-Sense-Primer 5 'CGTGCAGAGAATTCTGAGTTC-3'; Antisense-Primer 5 'AGACG CTTTACGTAGTGCTG-3'; und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) Sense-Primer 5'-GGGCAGCCCAGAACATCA-3 '; Antisense-Primers 5'-TGACCTTG CCCACAGCCT-3 '. PCR-Reaktionen umfasste 15 min bei 95 ° C zur Aktivierung der HotStarTaq DNA Polymerase, gefolgt von 45 Zyklen bei 94 ° C für 15 sec (Denaturierung), 55 ° C für 30 sec (Annealing) und 72 ° C für 30 sec (Verlängerungs ). Die relative Expression wurde aus dem 2 ^{-ΔΔCT Formel [24] berechnet.}

Die statistische Analyse

Daten als Mittelwert ± S.E.M von 7-9 Tieren exprimiert wurden. Statistische Vergleiche zwischen den Mittelwerten wurden unter Verwendung von Einweganalyse der Varianz (ANOVA), gefolgt vom Student-Newman-Keuls-Test. Die statistische Signifikanz des Unterschieds bei galt als P
< 0,05.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Bidirektionale Übersprechen zwischen den Spannungs-induzierten Magengeschwüren und Depression unter chronischem Stress
• PLoS ONE: High-Mobility Group Box 1 Sperrt Magengeschwür Heilung durch Toll-like Rezeptor 4 und Rezeptor für Advanced Glycation End Products