PLOS ONE: konjugerad linolsyra Komplettering under fettrik kost Modulerar mage Protein Expression och tarmens bakterieflora hos vuxna Mice

Abstrakt

mag-tarmkanalen utgör en fysiologisk gränssnitt integrerar näringsämne och mikrobiota-värd metabolism. CLA (CLA) har rapporterats att bidra till minskad kroppsvikt och fett anhopning. Moduleringen av dietary CLA av magen proteiner besläktade med energi homeostas eller mikrobiota kan vara inblandade, även om detta inte tidigare har analyserats. Detta undersöks i denna studie, som syftar till att understryka de potentiella mekanismerna för CLA som bidrar till kroppens viktreglering. Vuxna möss matades antingen en normal fett (NF, 12% kJ innehåll som fett) eller en fettrik (HF, 43% kJ innehåll som fett) kost. I det senare fallet, hälften av djuren erhöll daglig oral supplementering av CLA. Uttryck och innehåll av magen proteiner och specifika bakteriepopulationer från caecum analyserades. CLA tillskott förknippades med en ökning av magen proteinuttryck, och utövade en prebiotiska verkan på både Bacteroidetes /Prevotella Mössor och Akkermansia muciniphila
. Men CLA tillskott kunde inte åsidosätta de negativa effekterna av HF diet på Bifidobacterium
spp., Som sänktes i både HF och HF + CLA grupper. Våra data visar att CLA kan modulera magen proteinuttryck och utöva en prebiotiska effekt på specifik gut bakterieart

Citation. Chaplin A, Parra P, Serra F, Palou A (2015) konjugerad linolsyra Komplettering enligt en fettrik kost Modulerar mage Protein Expression och tarmens bakterieflora hos vuxna möss. PLoS ONE 10 (4): e0125091. doi: 10.1371 /journal.pone.0125091

Academic Redaktör: Marià Alemany, fakulteten för biologi, SPANIEN

Mottagna: 3 februari 2015, Accepteras: 13 mars 2015, Publicerad: 27 april 2015

Copyright: © 2015 Chaplin et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet: Alla relevanta uppgifter är inom pappers- och dess stödjande information filer

Finansiering:. Detta arbete stöddes av bidraget AGL2012-33692 och EU-finansierat projekt (BIOCLAIMS FP7-244995). Författarnas grupp får ekonomiskt stöd från Instituto de Salud Carlos III, Centro de Investigación Biomedica en Red Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición, CIBERobn. Författare tillhör Nutrigenomics-gruppen, tilldelades som "Group of Excellence" av CAIB och stöds av "Direcció General d'Universitäts, Recerca i Transferencia del Coneixement" av den regionala regeringen (CAIB) och Feder medel (EU). AC stöds av en PhD stipendium från Conselleria d'Educació, Cultura i Universitäts, Govern de les Illes Balears, ett projekt som samfinansieras av Europeiska socialfonden. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Fetma är för närvarande växer med en epidemi takt, vara ett stort hot mot hälsan i hela världen, och resulterar i en ökad risk för diabetes mellitus typ II, vissa typer av cancer, fettlever, högt blodtryck, hjärt-kärlsjukdom och ökad dödlighet. Trots stora forskningsinsatser om effekterna av kost, motion, utbildning, kirurgi eller läkemedelsterapier, finns det fortfarande ingen långsiktig lösning för att effektivt förhindra eller motverka fetma [1].

Dietary CLA (CLA) hänvisa till en blandning av geometriska och positionella isomerer av linolsyra med konjugerade dubbelbindningar som finns huvudsakligen i idisslare kött och mejeriprodukter [2]. Växande forskning har visat att de isomerer cis
-9, trans
-11-CLA och trans
-10, cis
-12-CLA i synnerhet har en viktig roll i regleringen av kroppsvikt och kroppsfett i både djur [3-9] och mänskliga [10-13] studier

den aktuella studien genomfördes för att ytterligare karakterisera effekterna av CLA på kroppsvikt förvaltning, genom att behandla vissa aspekter som till vår kunskap har inte studerats tidigare. Mag-tarmkanalen är den största endokrina av kroppen och ansvarar för omvandlingen av mat till energi, är metaboliskt högaktiv och hem till biljoner mikrober [14, 15]. Magen är en av de första platserna i mag-tarmkanalen som svarar på födointag. Det syntetiserar proteiner som har en viktig roll i energibalansen och har visat sig moduleras genom diet [16-21]. En annan intressant komponent är caecum innehåll, som hyser en stor mängd bakterier som utför ett antal funktioner som är involverade i energireglering, såsom behandling av icke-smältbara polysackarider, metabolism av proteiner, syntes av vitaminer och produktion av energi [22- 25]. Emerging bevis tyder på att tarmfloran kan vara inblandade i fetma [26-28], och att fettrik kost i synnerhet kan bidra till moduleringen av denna bakterie gemenskap [29-33]. Därför är den roll som mat i modifiera tarmfloran mot en mer fördelaktig profil av stort intresse [34].

Sammantaget understryker detta vikten av samspelet mellan mat och de olika komponenterna i mag-tarmkanalen. Syftet var att undersöka potentialen av CLA i regleringen av både magen proteinuttryck och specifik tarmbakteriearter i feta möss under en HF diet.

Material och metoder

Djur

C57BL /6J möss från Charles River (Barcelona, ​​Spanien) som vägde 21 ± 0,1 g (5 veckor gamla) inhystes under standardbetingelser i burar i grupper om 4-5 och förvaras i en 12-h ljus: mörker-cykel vid 22 ° C med mat och vatten behag
. Burar var Makrolon typ III (Tecniplast, Biosis Biologiska Systems S.L.) och sängkläder var Ultrasorb gran spån (Panlab S.L.U). Strö ändrades varje vecka. Efter mottagning, fick djuren tilläts acklimatisera i en vecka och uppdelades i grupper som säkerställer likvärdig viktmedel. Mat byttes två gånger i veckan, och intag och kroppsvikt registrerades var tredje dag under hela försöket [35]. Djuret protokoll följdes i denna studie granskades och godkändes av bioetiska kommitté vid universitetet i Balearerna (godkännande 13 ^{februari 2006) och University riktlinjer för användning och skötsel av försöksdjur strikt. Alla ansträngningar gjordes för att minimera lidandet.}

Möss delades in i tre behandlingsgrupper (n = 8). Alla dieter framställdes genom forskning Diets (Inc, New Brunswick) och presenteras som pellets till djuren. Detaljerad sammansättning av dessa dieter kan hittas i S1 tabell. Möss fick en av följande dieter för 54 dagar: en standard normalfettdiet (NF), innehållande 12% kJ innehåll som fett, användes som kontroll, eller en fettrik kost (HF), som innehöll 43% kJ innehåll fett. Dieter baserades på standard gnagardiet AIN-76A. Därför är både dieter innehöll lika stor andel av protein (20% kJ innehåll) och kolhydrat användes för att justera energiinnehållet. Sålunda innehöll NF diet 40% (vikt /vikt) sackaros och HF 35% (vikt /vikt). Därefter tillsattes en daglig dos av CLA som ges till hälften av djuren som fick den HF-diet. Tonalin (vänligen tillhandahållen av Cognis) användes som CLA supplement, vilket ger 6 mg CLA /dag (21,4 nmol /isomer /dag), ges som en oral sondmatning. Tonalin TG 80, som härrör från safflorolja, består av triacylglyceroler innehållande ca 80% CLA med en 50:50 förhållandet mellan de aktiva CLA-isomerer cis
-9, trans
-11 och trans
-10, cis
-12. Vid slutet av experimentet, hade kroppsvikten inte mellan HF och CLA gruppen, medan kroppsfett var statistiskt lägre hos CLA djur. Komplett uppsättning av data, inklusive djurens vikt, kroppsfett (dag 40) och beräknad födointag har tidigare publicerats [35].

Offer och provsamling

Offer av alla djur genomfördes förs inom de djuranläggningar, vid början av ljuscykeln och efter 10h i brist på mat. Djuren bedövades med en intraperitoneal injektion består av en blandning av xilacine (10 mg /kg kroppsvikt) och ketamin (100 mg /kg kroppsvikt). Organ och prover av intresse skars ut och vägdes (mage och caecum). Magen öppnades och insidan skrapades för att samla upp mukosan. Caecum också uppskuren och innehåll samlats. Alla vävnader sköljdes med koksaltlösning innehållande 0,1% dietylpyrokarbonat (Sigma, Madrid, Spanien) och snabbfrystes vid -80 ° C.

Kvantifiering av gastric leptin och ghrelin

magslemhinnan homogeniserades vid 4 ° C i 1: 3 (w /v) PBS (mM: 137 NaCl, 2,7 KCl, 10 fosfatbuffert, pH 7,4) och centrifugerades vid 7000 x g
för 2min vid 4 ° C. Totalt protein bestämdes efter 5-faldig utspädning av den överstående vätskan med PBS med användning av Bradford-metoden [36]. Gastric leptin bestämdes i det ursprungliga homogenatet med en mus leptinenzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) -kit (R &D Systems, Minneapolis, MN). Ghrelin bestämningen i magen utfördes i enlighet med [37]. Magen homogenatet blandades med 10 volymer 1 M ättiksyra innehållande 20 mM HCl, kokades under 20 minuter och centrifugerades vid 7000 x g
under 2 minuter vid 4 ° C. Supernatanten lyofiliserades och återsuspenderades i PBS. Ghrelin koncentrationen i magen bestämdes sedan med användning av en mus ghrelin enzym immunosorbentanalys (EIA) -kit (Phoenix Europa, Karlsruhe, Tyskland).

RNA-isolering, retrotranskription och realtids qPCR

Totalt RNA extraktion från magen utfördes med Tripure Reagent (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Tyskland) i enlighet med tillverkarens instruktioner. Isolerade RNA kvantifierades med användning av Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies Inc., Wilmington, DE, USA) och dess integritet bekräftades med användning av agarosgelelektrofores.

Prover retrotranscribed och realtids-PCR utfördes under analysen av magen proteiner. Kortfattat, 0,25 | j, g av totalt RNA (i en slutlig volym av 5 | j, l) denaturerades vid 65 ° C under 10 min och sedan transkriberades omvänt till cDNA med användning av MuLV omvänt transkriptas (Applied Biosystems, Madrid, Spanien) vid 20 ° C under 15 min, 42 ° C under 30 min och ett slutligt steg av 5 min vid 95 ° C i en termocykelapparat (Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler, Madrid, Spanien).

Varje PCR utfördes med utspädd cDNA-mall, framåt och bakåt primers (5 ^ M vardera) och Power SYBR Green PCR master Mix (Applied Biosystems, CA, USA). Primers utformades och erhölls från Sigma-Aldrich Química SA (Madrid, Spanien) och sekvenser beskrivs i Tabell 1. Real-time PCR utfördes med användning av Applied Biosystems StepOnePlus realtids-PCR-system (Applied Biosystems) med följande mall: 10 min vid 95 ° C följt av totalt 42 temperaturcykler (15 s vid 95 ° C och 1 min vid 60 ° C). För att verifiera renheten hos de produkter som amplifierats framställdes en smältkurva produceras efter varje körning i enlighet med tillverkarens instruktioner. Tröskelcykeln (Ct) beräknades genom instrumentets programvara (StepOne Software v2.0), och den relativa expressionen av varje gen beräknades som en procentandel av NF möss med användning av 2 ^{-ΔΔCt metod [38]. Beta-aktin användes som referens gen.}

Bakteriell profilering av qPCR

Totalt bakteriellt DNA extraherades från ungefär 50 mg av blindtarmsprovs använda E.Z.N.A. Pall DNA-kit (Omega Biotek, GA, USA). DNA-koncentrationen bestämdes med användning av en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies Inc., Wilmington, DE, USA) och dess integritet bekräftades genom agarosgel. Bedömning av närvaron och den relativa mängden av bakteriearter bestämdes genom att mäta DNA-överflöd av 16S rRNA-gensekvenser från qPCR med Applied Biosystems StepOnePlus realtids-PCR System (Applied Biosystems), följande tidigare beskrivna protokoll [39, 40]. Specifika primers för Clostridium coccoides
, Clostridium leptum Mössor och Lactobacillus
spp. (Firmicutes representanter ); Bacteroides /Prevotella
(Bacteroidetes); Bifidobacterium
spp. (Aktinobakterier); Akkermansia muciniphila
(Verrucomicrobia); Enterobacteriaceae
(Proteobacteria); och Totalt Bakterier
erhölls från Sigma (Madrid, Spanien). Totala Bakterier
hänvisar till en bred-spektrum universell primer som känner igen den konserverade regionen av 16S rRNA som kodar genen för ett brett spektrum av bakteriearter, och användes för att normalisera analysen till total bakteriell DNA. Sekvenser beskrivs i Tabell 2. tröskelcykeln beräknades med hjälp av två ^{-ΔΔCt metod [38], och relativ bakteriehalt och faldig förändring (FC) beräknades (Log _{22 -ΔΔCt). Värden normaliserades med genomsnittet av NF-gruppen.}}

Statistisk analys

Data presenteras som medelvärden ± SEM. Lika skillnader mellan grupper bedömdes av Levene test. När homogeniteten hos varianser antogs, var en envägs ANOVA användes för att bestämma signifikansen av de olika parametrar mellan grupper. Om det fanns en signifikant skillnad, var en Bonferroni-test används för att bestämma där skillnaden låg och att korrigera för multipel testning. När homogenitet av avvikelser inte antogs, data logaritmerade. Linjära samband mellan nyckelvariabler testades med Pearsons korrelationskoefficienter. Tröskeln för signifikans var satt till P < 0,05. Analysen genomfördes med hjälp av SPSS för Windows version 21.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).

Resultat

CLA tillskott modulerar uttrycket av regulatoriska proteiner i magen

Expression av proteiner i samband med energimetabolism och reglering av födointag bestämdes i mus mage. Leptin mRNA uttryck i HF-gruppen ändrades inte, men leptinprotein ökades i dessa djur (2-faldiga jämfört med NF, p = 0,003). Å andra sidan, tillskott med CLA orsakade en 6-faldigt högre uttryck av leptin mRNA (i jämförelse med NF, p = 0,001), vilket var i överensstämmelse med högre halt av gastrisk leptin (2-faldigt, p = 0,014 vs. NF ) (figur 1A). CLA-matade djuren uppvisade också ökad ghrelin mRNA uttryck (3-faldig, p = 0,006 vs.NF), men inga förändringar sågs bland grupper om ghrelin protein (Fig 1B).

Dessutom CLA tillskott förknippades till ökat uttryck av alla magen proteiner analyseras och statistisk signifikans uppnåddes i fallet med resistin (RETN) (3-faldig, p = 0,026), G-proteinkopplad receptor 39 ( Gpr39) Review (4-faldig , p = 0,001), glukagon ( GCG) Review (2-faldig, 0,001) och glukagon receptor ( Gcgr) Review (5-faldig, p = 0,011) (Fig 1C).

caecum mikrobiota moduleras av CLA

för att ytterligare undersöka effekten av CLA var blindtarmen innehåll av möss analyseras för att bestämma bakteriearter potentiellt associerade till fetma och energiomsättning. En betydande ökning av bakterie-DNA caecum innehåll observerades i möss livnärde en HF diet (tre gånger mot NF, p = 0,032), som minskade med CLA tillskott och visade inga skillnader jämfört med NF djur (Fig 2A). Detta åtföljdes av skillnader i tarmfloran sammansättning.

Det finns inga statistiskt säkerställda förändringar konstaterades beträffande Firmicutes innehåll i de olika dietbehandlingar (Fig 2B). HF utfodring huvudsakligen associerad med en minskning i Bifidobacterium
spp. (P = 0,009 jämfört med NF, med en fold change (Log _{2 FC) av -3,07). CLA tillskott inte motverka denna minskning, presenterar liknande värden (p = 0,034 jämfört med NF, -2,18 Log 2 FC) (Figur 2C). Däremot djur som fick CLA visade en signifikant ökning av två bakteriearter av intresse: Bacteroides /Prevotella
(p = 0,021 jämfört med NF, 1,30 Log 2 FC) (Figur 2D) och En
. muciniphila
, som ökat dramatiskt jämfört med både NF (p = 0,014; 4,33 Log 2 FC) och HF (p = 0,002) (Fig 2E). Inga väsentliga förändringar på Enterobacteriaceae
profil sågs (Fig 2F).}

Caecum mikrobiota korrelerar med kroppsvikt och kroppsfett

Vi testade nästa hypotesen att förekomsten av specifika bakterie arter i mus blindtarm innehåll kan associeras med modulering av kroppsvikt och kroppsfett. Å ena sidan, C
. coccoides
(r = 0,433, p = 0,044) och C
. leptum
(r = 0,488, p = 0,021), som båda tillhör Firmicutes "gruppen, visade positiva korrelationer med kroppsvikt. Bacteroides /Prevotella
visade också en positiv korrelation (r = 0,581, p = 0,006) med kroppsvikt. Å andra sidan var kroppsfett negativt korrelerad med Bifidobacterium
spp. (R = -.547, p = 0,008). Korrelationsmatrisen presenteras i tabell 3.

Diskussion

Den aktuella studien visar att CLA tillskott under HF diet har en märkbar effekt på vissa platser i mag-tarmkanalen i mus, genom att öka gastric proteinuttryck och genom att främja en prebiotisk effekt på tarmfloran. Med tanke på att mag-tarmkanalen integrerar samspelet mellan mat, mikrobiota och metabola effekter på värden, kan dessa resultat vara relevant för utvecklingen av strategier viktkontroll, eftersom CLA föreningar används för att minska fettmassan hos människor [10-13] .

Gut hormoner utsöndras i magsäcken som svar på födointag och spelar en viktig roll i signalering matintag till hjärnan [41]. Leptin och ghrelin utgör två av de mest studerade proteiner involverade i energiomsättningen, båda utsöndras i relevant mängd av magslemhinnan [42-47]. I enlighet med leptin mRNA-nivåer var högre gastrisk proteininnehåll även observeras, vilket är i enlighet med de ökade plasmaleptinnivåer som beskrivs i dessa djur [35]. Det har tidigare beskrivit att fettrik matning stimulerar gastric leptin signalväg [44], en effekt som inte skulle motverkas av CLA och skulle bidra till delvis förklara varför inga skillnader sågs om födointag i denna experimentella inrättat [35 ]. Å andra sidan, är ghrelin genen en gut orexigenic hormon som huvudsakligen regleras genom att mata [48], och även om mRNA-expression ökade med CLA, protein ghrelin nivåer kunde inte ändras. Den bristande överensstämmelsen mellan mRNA-expression och proteinnivåer skulle knytas till närvaron av dygnsrytmer beskrivits för både ghrelin och leptin i mag miljö som möjliggör en bättre metabol kontroll [49]. Förutom dessa huvudgastriska proteiner analyserade vi ghrelin o-acyltransferas ( Mboat4) Review, resistin och Gpr39
, samt glukagon, somatostatin och deras receptorer, proteiner som också är involverade i energibalans och har beskrivits i magslemhinnan [50-56], även om deras potential i viktkontroll inte har studerats ingående. I detta sammanhang, Mboat4
var av särskilt intresse eftersom det är det enzym som ansvarar för acylering av ghrelin [56] och aktiveras av dietlipider, vilka verkar som acylerings substrat [57]. Intressant nog alla proteinerna analyserades visade ökat uttryck med CLA-tillskott, vilket tyder på att CLA-isomerer är specifikt avkänns av de gener som kodar gastriska proteiner som svarar på livsmedels cues.

Utöver de ovannämnda effekterna, CLA främjas förändringar i tarmfloran av den nedre delen av mag-tarmkanalen. Under de senaste åren, har det föreslagits att i feta stater finns ett ökat förhållande mellan Firmicutes till Bacteroidetes samt en förlust av bakteriell mångfald [26-28] men för närvarande mer fokus läggs på bakteriearter värd ämnesomsättning karakterisering som ny uppgifter framträder (diskuteras i en färsk granskning [58]). Varken CLA tillskott eller HF enbart diet var associerad med förändringar bland bakteriearter i Firmicutes "phylum. Men sänkte HF matning Bifidobacterium
spp., I enlighet med tidigare djurstudier [59-62], en minskning som inte motverkades av CLA. Med tanke på tillskott kunde inte återupprätta normal kroppsvikt [35], var ett positivt samband med kroppsvikt hittades för både C
. coccoides Köpa och C
. leptum
, i överenskommelse med potentiell skadlig roll dessa bakteriearter på fetma [33, 63, 64], liksom en negativ korrelation med Bifidobacterium
spp., En förening som har även tidigare finns i både djurmodeller och humanstudier [60-63].

i motsats till CLA inducerade en prebiotisk effekt i kompletterade djur. Bacteroides /Prevotella
är en bakterieart är kända för att använda kost polysackarider i en prebiotiska sätt [65]. En anmärkningsvärd ökning konstaterades enligt CLA tillskott tyder på att CLA kunde ge en prebiotisk effekt. Detta stöds av en mycket hög induktion av A
. muciniphila
tillväxt genom CLA. Förekomsten av denna mucin nedbrytande bakteriearter, som finns i slemskiktet, är förbunden med en frisk slemhinna och är i allmänhet reducerad hos överviktiga tillstånd [66-68]. Everard et al. [69] har nyligen visat att oligofruktos återställer A
. muciniphila
innehåll hos överviktiga djur, och detta i samband med en förbättring av deras metabola profil. Därför ökade blindtarms innehållet i A
. muciniphila
finns under CLA tillskott tyder på att denna förening utövar en prebiotiska verkan på denna bakterieart också. Såvitt vi vet är detta det första beviset på en CLA-prebiotiska effekten gynnar den specifika tillväxt av potentiellt nyttiga bakteriearter i tarmen. Men denna ökning av både Bacteroides /Prevotella Mössor och A
. muciniphila
inte var tillräckligt för att en fullständig återhämtning eftersom dessa djur förblir överviktiga [35]. Vi kan inte utesluta att en högre CLA dosen och /eller längre behandling, som i allmänhet är förknippad med en magrare fenotyp [70], skulle orsaka en ännu högre ökning av A
. muciniphila
innehåll och har mer betydande effekter på metabola parametrar. Detta skulle passa med lägre induktion av A
. muciniphila
finns i den aktuella studien i jämförelse med andra [69, 71].

Sammantaget våra data visar att mag-tarmkanalen är en första plats för verkan av bioaktiva isomerer av CLA, kan att modulera gastric svar samt mikrobiota-värd metabolism. Vi kan inte utesluta möjligheten samspelet mellan gastric miljö och bakterietillväxt i samband med livsmedels ledtrådar som åtföljer CLA intag. Emellertid CLA inducerade uttrycket av gener som kodar för gastriska proteiner besläktade med regleringen av energibalansen och utövade en prebiotisk effekt på utvalda bakteriearter. Tillväxt av potentiellt nyttiga bakteriearter, speciellt Bacteroidetes /Prevotella Mössor och A
. muciniphila
föreslår CLA ger en prebiotiska effekt, vilket skulle kunna bidra till en hälsosammare metabolisk profil. Ytterligare och grundlig forskning om hur specifika dietbehandlingar påverka specifika fysiologiska komponenter, såsom mag-tarmkanalen, kommer att bidra till att belysa deras inverkan på särskilda villkor, såsom fetma och utveckla effektiva strategier kropp viktkontroll.

Bakgrundsinformation
S1 tabell. Detaljerad sammansättning av dieter
sammansättning av normala och fettrik kost som används i experimentet
Doi:.. 10.1371 /journal.pone.0125091.s001
(DOCX) Review

Tack till

Vi tackar Sarah Laraichi (Laboratoriet för kalorimetri och material, naturvetenskapliga fakulteten, Abdelmalek Essaâdi universitet, 93030 Tétouan, Marocko) för hennes hjälp med djurvård och provsamling under sin vistelse i vårt labb.

• PLOS ONE: Påverkan av långvarig Acetylsalicylsyra Komplettering-inducerad gastrit på neurokemi av det sympatiska nervceller Leveransen Prepyloric Region svin magen
• PLOS ONE: på väg mot rätt riktning-Solution Package för endoskopisk submukosala Tunne resektion i magen