PLoS ONE: Konjugierte Linolsäure Supplementation unter einer fettreichen Diät Moduliert Magen-Protein Expression und Darmmikrobiota in erwachsenen Mäusen

Abstrakt

Der Magen-Darm-Trakt bildet eine physiologische Schnittstelle zu integrieren Nährstoff- und Mikrobiota-Host-Stoffwechsel. Konjugierte Linolsäuren (CLA) wurden beitragen berichtet zu einer verminderten Körpergewicht und Fett Akkretion. Die Modulation durch diätetische CLA von Magen-Proteine ​​Energie-Homöostase oder Mikrobiota im Zusammenhang kann, beteiligt werden, obwohl dies bisher nicht untersucht worden. Dies wird in der vorliegenden Studie untersucht, welche die möglichen Mechanismen von CLA zu unterstreichen, zielt darauf ab, die an der Gewichtsregulation beitragen. Erwachsene Mäuse wurden entweder ein normales Fett (NF, 12% kJ Gehalt als Fett) oder einen hohen Fettgehalt (HF, 43% kJ Gehalt als Fett) Diät gefüttert. Im letzteren Fall wird die Hälfte der Tiere erhielten tägliche orale Gabe von CLA. Ausdruck und Inhalt von Magen-Proteine ​​und spezifische Bakterienpopulationen von Blinddarms wurden analysiert. CLA-Supplementierung wurde mit einem Anstieg der Magen-Protein-Expression verbunden sind, und übte eine präbiotische Wirkung auf beide Bacteroidetes /Prevotella
und Akkermansia muciniphila
. Allerdings CLA-Supplementierung nicht in der Lage war, auf die negativen Auswirkungen von HF-Diät außer Kraft zu setzen Bifidobacterium
spp., Die sowohl HF und HF + CLA Gruppen verringert wurde. Unsere Daten zeigen, dass CLA können Magen-Protein-Expression zu modulieren und eine präbiotische Wirkung auf spezifische Darmbakterienarten

Citation ausüben. Chaplin A, Parra P, Serra F, Palou A (2015) Konjugierte Linolsäure Supplementation unter eine fettreiche Diät moduliert Magen-Protein Expression und Darmmikrobiota in erwachsenen Mäusen. PLoS ONE 10 (4): e0125091. doi: 10.1371 /journal.pone.0125091

Academic Editor: Marià Alemany, Fakultät für Biologie, Spanien

Empfangen: 3. Februar 2015; Akzeptiert: 13. März 2015; Veröffentlicht: 27. April 2015

Copyright: © 2015 Chaplin et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb des Papiers und seiner Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der Gewährung AGL2012-33692 und dem EU-geförderten Projekt (BIOCLAIMS FP7-244995) unterstützt wurde. Die Autoren Gruppe erhält finanzielle Unterstützung von Instituto de Salud Carlos III, Centro de Investigación Biomédica en Red Fisiopatología de la obesidad y Nutrición, CIBERobn. Autoren gehören der Nutrigenomik-Gruppe, ausgezeichnet als "Group of Excellence" von CAIB und unterstützt von "Direcció General d'Universitats, Recerca i Transferencia del Coneixement" der Regionalregierung (CAIB) und FEDER Mittel (EU). AC durch ein Promotionsstipendium von Conselleria d'Educació, Cultura i Universitats unterstützt wird, Govern de les Illes Balears, ein Projekt, das vom Europäischen Sozialfonds kofinanziert wird. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Fettleibigkeit ist derzeit auf einer Epidemie Rate wächst, als eine große Gefahr für die Gesundheit auf der ganzen Welt, und was zu einem erhöhten Risiko für Diabetes mellitus Typ II, einige Arten von Krebs, Fettlebererkrankungen, Bluthochdruck, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und eine erhöhte Mortalität. Trotz großer Forschungsanstrengungen auf die Auswirkungen von Ernährung, Bewegung, Bildung, Operation oder medikamentöse Therapien, gibt es noch keine langfristige Lösung, um effizient zu verhindern oder Fettleibigkeit entgegenzuwirken [1].

Dietary konjugierte Linolsäuren (CLA) beziehen sich auf eine Mischung aus geometrischen und Stellungsisomere von Linolsäure mit konjugierten Doppelbindungen hauptsächlich in Wiederkäuern Fleisch und Milchprodukten gefunden [2]. Wachsende Forschung hat gezeigt, dass die Isomeren cis
-9, trans
-11-CLA und trans
-10, cis
-12-CLA insbesondere eine wichtige Rolle bei der Regulierung von Körpergewicht und Körperfett in beiden Tier [3-9] und menschliche [10-13] Studien,

die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um die Wirkungen von charakterisieren CLA auf das Körpergewicht Management, durch bestimmte Aspekte behandelt, dass nach unserem Wissen nicht vor untersucht worden sind. Der Magen-Darm-Trakt ist die größte endokrine des Körpers und ist verantwortlich für die Umwandlung von Nahrung in Energie, ist metabolisch hochaktive und die Heimat Billionen von Mikroben [14, 15]. Der Magen ist einer der ersten Seiten in den Gastrointestinaltrakt, die Nahrungsaufnahme reagiert. Es synthetisiert Proteine, die eine wichtige Rolle bei der Energiebilanz und wurden durch Diät [16-21] zu modulierenden gezeigt. Eine weitere interessante Komponente caecum Gehalt, der eine große Menge an Bakterien, birgt die eine Reihe von Funktionen in Energieregulierung beteiligt durchzuführen, wie beispielsweise die Verarbeitung von nicht verdaulichen Polysacchariden, den Metabolismus von Proteinen, die Synthese von Vitaminen und Erzeugung von Energie [22- 25]. Beweise Schwellen deutet darauf hin, dass auf die Modulation dieser bakteriellen Gemeinschaft [29-33] in Fettleibigkeit beteiligt sein können [26-28], und dass hohe Fett-Diät könnte insbesondere die Darmflora beitragen. Daher ist die Rolle der Nahrung bei der Modifizierung Darmflora zu einem günstigeren Profil von großem Interesse [34].

Insgesamt ist dies unterstreicht die Bedeutung des Zusammenspiels zwischen Nahrung und den verschiedenen Komponenten des Magen-Darm-Trakt. Das Ziel war es, das Potenzial von CLA in der Regulation der sowohl Magen-Protein-Expression und spezifische Darmbakterienarten in fettleibigen Mäusen unter einer HF-Diät zu studieren.

Materialien und Methoden

Tiere

Männliche C57BL /6J-Mäuse von Charles River (Barcelona, ​​Spanien) mit einem Gewicht von 21 ± 0,1 g (5 Wochen alt) wurden in Käfigen in Gruppen von 4-5 unter Standardbedingungen untergebracht und befinden sich in einem 12-h Licht: dunkel-Zyklus bei 22 ° C mit Nahrung und Wasser ad libitum
. Die Käfige waren Makrolon Typ III (Tecniplast, Biosis Biologischer Systeme S. L.) und Bettwäsche war Ultrasorb fir Späne (Panlab S.L.U). Bettwäsche wurde wöchentlich gewechselt. Nach dem Empfang wurden die Tiere für eine Woche zu akklimatisieren erlaubt und in Gruppen Gewährleistung der Gleichgewichtsmittel geteilt. Das Essen wurde zweimal pro Woche gewechselt, und Aufnahme und Körpergewicht wurden alle drei Tage während des gesamten Experiments aufgezeichnet [35]. Das Tier Protokoll folgte in dieser Studie wurde von der Bioethical Kommission der Universität der Balearischen Inseln überprüft und genehmigt (Genehmigung 13 ^{th Februar 2006) und der Universität Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Labortieren wurden strikt eingehalten. Alle Anstrengungen unternommen wurden Leiden zu minimieren.}

Die Mäuse wurden in drei Behandlungsgruppen aufgeteilt (n = 8). Alle Diäten wurden von Research Diets (Inc, New Brunswick) und präsentierte als Pellets zu den Tieren hergestellt. Genaue Zusammensetzung dieser Diäten können in S1 Tabelle zu entnehmen. Die Mäuse erhielten eine der folgenden Diäten 54 Tage: eine Standardnormal-Fett-Diät (NF), mit 12% kJ Gehalt als Fett, das als Kontrolle oder einer fettreichen Diät (HF), die 43% kJ Inhalt enthalten ist, wie Fett. Diäten wurden auf dem Standard-Nagerfutter AIN-76A basiert. Deshalb enthalten beide Diäten gleich Anteil an Protein (20% kJ-Gehalt) und Kohlenhydrat verwendet wurde, den Energiegehalt einzustellen. Somit enthalten NF Ernährung 40% (w /w) Saccharose und HF 35% (w /w). Dann wurde Diät auf die Hälfte der Tiere Empfangen des HF eine tägliche Dosis von CLA gegeben. Tonalin (mit freundlicher Unterstützung von Cognis) wurde als CLA zu ergänzen, bietet 6 mg CLA /Tag (21,4 nmol /Isomer /Tag), gegeben als orale Gabe verwendet. Tonalin TG 80, aus Distelöl gewonnen, besteht aus Triglyceriden, die etwa 80% CLA mit einem Verhältnis von 50:50 der aktiven CLA Isomere cis
-9, trans
-11 und trans
-10, cis
-12. Am Ende des Experiments, das Körpergewicht zwischen HF und CLA-Gruppe nicht unterscheiden, während Körperfett statistisch niedriger in CLA Tieren. Komplett-Set von Daten, einschließlich Gewicht der Tiere, Körperfett (Tag 40) und der geschätzten Nahrungsaufnahme zuvor veröffentlicht worden sind [35].

Opfer und Probensammlung

Opfer aller Tiere durch aus in den Tieranlagen, zu Beginn des Lichtzyklus und nach 10h von Nahrungsentzug. Die Tiere wurden aus einer Mischung von xilacine mit einer intraperitonealen Injektion hergestellt anästhesiert (10 mg /kg Körpergewicht) und Ketamin (100 mg /kg Körpergewicht). Organe und Proben von Interesse wurden herausgeschnitten und gewogen (Magen und Blinddarm). Magen wurde geöffnet und das Innere abgeschabt wurde die Schleimhaut zu sammeln. Blinddarm wurde auch aufgeschnitten und der Inhalt gesammelt. Alle Gewebe mit Kochsalzlösung, die 0,1% Diethylpyrocarbonat (Sigma, Madrid, Spanien) und schockgefroren bei -80 ° C gespült wurden.

Die Quantifizierung von Magen-Leptin und Ghrelin

Magenschleimhaut wurde homogenisiert bei 4 ° C in 1: 3 (w /v) PBS (mM: 137 NaCl, 2,7 KCl, 10 Phosphatpuffer, pH 7,4) und bei 7000 zentrifugiert x g
für 2min bei 4 ° C. Das Gesamtprotein wurde mit PBS unter Verwendung des Bradford-Methode [36] nach 5-fachen Verdünnung des Überstandes bestimmt. (; D Systems, Minneapolis, MN R &) Gastric Leptin wurde in dem ursprünglichen Homogenats mit einem Maus-Leptin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) -Kit bestimmt. Ghrelin Bestimmung erfolgte im Magen erfolgt nach [37]. Stomach Homogenat wurde mit 10 Volumina 1 M Essigsäure gemischt, das 20 mM HCl, gekocht für 20 min und bei 7000 zentrifugiert x g
für 2 min bei 4 ° C. Der Überstand wurde in PBS resuspendiert und lyophilisiert. Ghrelin-Konzentration im Magen wurde dann unter Anwendung eines Maus Ghrelin Enzym Immuno Assay (EIA) Kit (Phoenix Europe, Karlsruhe, Deutschland).

RNA-Isolierung, Retrotranskription und Echtzeit-qPCR

Die Gesamt-RNA Extraktion von Magen wurde mit Tripure Reagenz (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Isolierte RNA wurde unter Verwendung von Nanodrop ND-1000 Spektrophotometer (Nanodrop Technologies Inc., Wilmington, DE, USA) quantifiziert und seine Integrität wurde mit Agarose-Gelelektrophorese bestätigt.

Die Proben wurden retrotranskribierten und real-time PCR wurde durchgeführt, für die Analyse von Magen Proteinen. Kurz gesagt, wurden 0,25 ug Gesamt-RNA (in einem Endvolumen von 5 &mgr; l) für 10 min bei 65 ° C denaturiert und dann in cDNA revers transkribiert unter Verwendung von MuLV Reverse Transkriptase (Applied Biosystems, Madrid, Spanien) bei 20 ° C für 15 min, 42 ° C für 30 min und einem Endschritt von 5 min bei 95 ° C in einem Thermocycler (Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler, Madrid, Spanien).

Jede PCR wurde mit verdünnter cDNA-Matrize durchgeführt wird, Vorwärts- und Rückwärtsprimer (jeweils 5 uM) und Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA). Die Primer wurden entworfen und von Sigma Aldrich Quimica SA (Madrid, Spanien) erhalten und Sequenzen sind in Tabelle 1 Real-time PCR beschrieben wurde, um die Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR-Systeme unter Verwendung von (Applied Biosystems) mit der folgenden Vorlage: 10 min bei 95 ° C mit insgesamt 42 Temperaturzyklen (15 s bei 95 ° C und 1 min bei 60 ° C) verfolgt. Um die Reinheit der Produkte verstärkt zu verifizieren, wurde eine Schmelzkurve nach jedem Durchlauf hergestellt gemäß den Anweisungen des Herstellers. Der Schwellenzyklus (Ct) wurde von der Gerätesoftware (StepOne Software v2.0) und die relative Expression jedes Gens wurde berechnet als Prozentsatz der NF-Mäuse berechnet, um die 2 unter Verwendung von ^{-ΔΔCt Methode [38]. Beta-Actin wurde als Referenz-Gen verwendet.}

Bakterielle Profilierung von qPCR

Insgesamt bakterielle DNA wurde aus etwa 50 mg caecal Proben extrahiert unter Verwendung des E.Z.N.A. Hocker DNA-Kit (Omega Biotek, GA, USA). Die DNA-Konzentration wurde unter Verwendung eines ND-ND-1000 Spektrophotometer (Nanodrop Technologies Inc., Wilmington, DE, USA) und ihre Integrität durch Agarosegel bestätigt bestimmt. Beurteilung des Vorhandenseins und der relativen Menge der Bakterien-Spezies wurde durch Messung DNA Abundanz der 16S-rRNA-Gensequenzen durch qPCR mit dem Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time-PCR-System (Applied Biosystems) bestimmt folgenden zuvor beschriebenen Protokollen [39, 40]. Spezifische Primer für Clostridium coccoides
, Clostridium leptum
und Lactobacillus
spp. (Firmicutes Vertreter ); Bacteroides /Prevotella
(Bacteroidetes); Bifidobacterium
spp. (Actinobacteria); Akkermansia muciniphila
(Verrucomicrobia); Enterobacteriaceae
(Proteo); und Total Bakterien
von Sigma (Madrid, Spanien) erhalten wurden. Total Bakterien-Mail an einen breiten Bereich Universalprimer bezieht, die für ein breites Spektrum von Bakterienarten, die konservierte Region der 16S rRNA codierenden Gens erkennt und verwendet wurde, den Test auf die Gesamt bakterielle DNA zu normalisieren. Die Sequenzen sind in Tabelle 2 Der Schwellenzyklus beschrieben wurde die 2 berechnet ^{-ΔΔCt Methode [38], und die relative Bakteriengehalt und mehrfache Änderung (FC) wurden berechnet (Log _{22 -ΔΔCt). Die Werte wurden mit dem Durchschnitt der NF-Gruppe normalisiert.}}

Die statistische Analyse

Die Daten sind als Mittelwert ± SEM. Die Gleichheit der Abweichungen zwischen den Gruppen wurde von Levene-Test bewertet. Wenn Homogenität der Varianzen angenommen wurde one-way ANOVA verwendet, um die Bedeutung der verschiedenen Parameter zwischen den Gruppen zu bestimmen. Wenn es einen signifikanten Unterschied war, wurde eine Bonferroni-Test verwendet, um zu bestimmen, wo der Unterschied lag und für mehrere Tests zu korrigieren. Wenn Homogenität der Varianzen nicht angenommen wurde, wurden Daten log transformiert. Lineare Beziehungen zwischen Schlüsselvariablen wurden mit Pearson-Korrelationskoeffizienten getestet. 0,05; Schwelle der Signifikanz wurde bei P <gesetzt. Die Analyse wurde mit der SPSS-Programm für Windows-Version ausgeführt 21,0 (SPSS, Chicago, IL, USA).

Ergebnisse

• PLoS ONE: Der Einfluss von Längerer Acetylsalicylsäure Supplementation-induzierte Gastritis auf der Neurochemie der Sympathische Neurons Versorgung präpylorischen Region des Porcine Stomach
• PLoS ONE: Auf dem Weg in Richtung auf die richtige Richtung-Lösungspaket für Endoskopische Submukosa-Tunneling-Resektion in der Stomach