Введение В целом, это подчеркивает важность взаимосвязи между питанием и различными компонентами желудочно-кишечного тракта. Цель состояла в том, чтобы изучить потенциал CLA в регуляции и экспрессии белка в желудке и кишечнике специфических видов бактерий у тучных мышей под HF диеты. Животные Выделение РНК, retrotranscription и в режиме реального времени КПЦР Общая бактериальная ДНК экстрагировали из приблизительно 50 мг слепокишечного образцов с использованием E.Z.N.A. Табурет ДНК комплект (Omega Биотек, штат Джорджия, США). Концентрацию ДНК определяли с использованием NanoDrop ND-1000 спектрофотометра (NanoDrop Technologies Inc., Уилмингтон, штат Делавэр, США) и его целостность подтверждается агарозном геле. Оценка наличия и относительного количества видов бактерий определяли путем измерения ДНК обилие последовательностей генов 16S рРНК кПЦР с StepOnePlus системы Applied Biosystems ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems), следуя ранее описанным протоколам [39, 40]. Конкретные праймеры для Clostridium coccoides CLA добавки модулирует экспрессию регуляторных белков в желудке слепая кишка микрофлора модулируется CLA для того, чтобы продолжить изучение влияния CLA, слепая кишка содержание мышей анализировали с целью определения видов бактерий, потенциально связанных с ожирением и энергетического метаболизма. Значительное увеличение содержания бактерий ДНК слепой кишки наблюдалась у мышей, получавших диету HF (3-кратное по сравнению с NF, р = 0,032), который не уменьшалась с CLA добавок и показал никаких различий по сравнению с NF животных (рис 2А). Это сопровождалось различиями в составе микрофлоры кишечника. Слепая кишка микробиоты коррелирует с массой тела и тела жира Обсуждение В целом, наши данные показывают, что желудочно-кишечный тракт является первым местом для действия биологически активных изомеров CLA, в состоянии модулировать желудка ответов, а также микрофлора-хозяина метаболизм. Мы не можем исключить потенциальное взаимодействие между желудочной среды и роста бактерий, связанных с продуктами питания киев, сопровождающих потребление CLA. Тем не менее, КЛК индуцирует экспрессию генов, кодирующих желудочные белки, связанные с регулированием энергетического баланса и оказывал пребиотик эффект на отдельных видов бактерий. Рост потенциально полезных видов бактерий, в частности, Bacteroidetes /Prevotella Выражение признательности
<р> Ожирение в настоящее время растет со скоростью эпидемии, считается одним из основных угроз здоровью во всем мире, и что приводит к повышенному риску сахарного диабета типа II, некоторых видов рака, жировой болезни печени, гипертонии, сердечно-сосудистых заболеваний и повышенная смертность. Несмотря на значительные усилия на научно-исследовательских эффектов диеты, физических упражнений, образования, хирургии или лекарственной терапии, до сих пор не долгосрочное решение для эффективного предотвращения или борьбы с ожирением [1].
<Р> Диетические конъюгированная линолевая кислота (CLA) относятся к смеси геометрических и позиционных изомеров линолевой кислоты с сопряженными двойными связями в основном в жвачных мяса и молочных продуктов [2]. Растущий исследования показали, что изомеры цис
-9, транс
-11-CLA и транс
-10, цис
-12-CLA в частности, играют важную роль в регуляции веса тела и жира в организме как на животных [3-9] и человека [10-13] исследований,
<р> настоящее исследование было проведено с целью дальнейшей характеристики последствий CLA по управлению веса тела, путем устранения некоторых аспектов, которые, насколько нам известно, не были изучены ранее. Желудочно-кишечный тракт является самым большим эндокринным тела и отвечает за превращение пищи в энергию, является метаболически высокоактивными и домом для триллионов микробов [14, 15]. Желудок является одним из первых сайтов в желудочно-кишечном тракте, который реагирует на прием пищи. Он синтезирует белки, которые играют важную роль в энергетическом балансе и как было показано, модулировать диетой [16-21]. Другим интересным компонентом является слепая содержание, которое таит в себе большое количество бактерий, которые выполняют ряд функций, участвующих в регулировании энергетики, таких как обработка неперевариваемых полисахаридов, метаболизма белков, синтез витаминов и производства энергии [22- 25]. Возникающие данные свидетельствуют о том, что микрофлора кишечника может быть вовлечен в ожирение [26-28], и что с высоким содержанием жиров, в частности, может способствовать модуляции этого бактериального сообщества [29-33]. Таким образом, роль пищи в модификации кишечную флору в направлении более благоприятного профиля представляет большой интерес [34].
Материалы и методы
<р> Мужчина C57BL /6J мышей из Charles River (Барселона, Испания) весом 21 ± 0,1 г (5 недель-старые) содержали в стандартных условиях в клетках в группах по 4-5 человек и выдерживают в течение 12 ч свет: темнота цикла при 22 ° с с пищей и водой вволю
. Клети были макролон типа III (Tecniplast, BIOSIS биологических систем С.Л.) и постельного белья была Ultrasorb еловых стружек (Panlab S.L.U). Постельное белье было изменено еженедельно. После приема, животных оставляли акклиматизироваться в течение недели и разделены на группы, обеспечивающие равный средний вес. Еда была изменена дважды в неделю, а также прием и массу тела регистрировали каждые три дня в течение всего эксперимента [35]. Протокол животных с последующим в этом исследовании был рассмотрен и одобрен Комитетом биоэтики Университета Балеарских островов (утверждение 13 го февраля 2006 года) и руководящими принципами университета для использования и ухода за лабораторными животными строго следуют. Все усилия были предприняты, чтобы минимизировать страдания.
<Р> Мыши были разделены на три группы лечения (п = 8). Все диеты были подготовлены Research Diets (Inc, Нью-Брунсвик) и представлены в виде гранул, к животным. Подробный состав этих диет можно найти в таблице S1. Мыши получали один из следующих диет в течение 54 дней: стандартный нормальный-жиров (NF), содержащий 12% содержание кДж в виде жира, используемого в качестве контроля, или с высоким содержанием жиров (HF), который содержал 43% содержание кДж, как жир. Диеты были основаны на стандартной диете с грызунами AIN-76A. Таким образом, обе диеты содержали равное соотношение белка (20% содержанием килоджоулей) и углеводов был использован для регулирования содержания энергии. Таким образом, НФ пища содержала 40% (вес /вес) сахарозы и HF 35% (вес /вес). Затем суточная доза CLA была дана половина животных, получавших КВ диету. Tonalin (любезно предоставленные Cognis) был использован в качестве добавки CLA, обеспечивая 6 мг CLA /сут (21,4 нмоль /изомер /день), переданной ей как перорально через зонд. Tonalin Т. 80, полученный из сафлорового масла, состоит из триацилглицеринов, содержащих приблизительно 80% CLA с отношением активных изомеров CLA 50:50 <ЕМ> цис
-9, <ЕМ> транс
-11 и транс
-10, цис
-12. В конце эксперимента, вес тела не отличались между HF и CLA группой, в то время как жир тела был статистически ниже у животных CLA. Полный набор данных, включая вес животных, жир тела (день 40) и расчетное потребление пищи были опубликованы ранее [35].
Жертвоприношение и образец коллекции
<р> Жертвоприношение всех животных было проведено в рамках животных объектов, в начале цикла света и после 10h пищи лишения. Животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией, составленной из смеси xilacine (10 мг /кг массы тела) и кетамина (100 мг /кг массы тела). Органы и образцы, представляющие интерес, вырезают и взвешивают (желудок и слепую кишку). Желудок был открыт и внутри соскабливали собрать слизистую оболочку. Слепая кишка также была разрезана и содержание собрано. Все ткани промывали солевым раствором, содержащим 0,1% диэтилпирокарбонат (Sigma, Мадрид, Испания) и быстро замораживают при температуре -80 ° C.
Количественное желудочного лептина и грелина
<р> Желудок слизистую оболочку гомогенизируют при 4 ° С в соотношении 1: 3 (вес /объем) PBS (мМ: 137 NaCl, 2,7 KCl, 10 фосфатный буфер, рН 7,4) и центрифугировали при 7000 х <ЕМ> г
в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Общее содержание белка определяли после 5-кратного разведения супернатанта с помощью PBS, с использованием метода Бредфорд [36]. Желудочный лептин определяли в исходном гомогенате с твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), комплект мыши лептина (R &Amp; D Systems, Minneapolis, MN). определение грелина в желудке было проведено в соответствии с [37]. Желудок гомогенат смешивают с 10 объемами 1 М уксусной кислоты, содержащей 20 мМ HCl, вареное в течение 20 мин и центрифугировали при 7000 х <ЕМ> г
в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Супернатант лиофилизируют и повторно суспендируют в PBS. концентрация грелина в желудке затем определяли с помощью мыши грелина фермента иммуноферментный анализ (ИФА) Kit (Phoenix Europe, Карлсруэ, Германия).
<р> Общая РНК извлечение из желудка проводили с Tripure Реагент (Roche Diagnostic Gmbh, Mannheim, Германия) в соответствии с инструкциями изготовителя. Изолированные РНК количественно с использованием NanoDrop ND-1000 спектрофотометр (NanoDrop Technologies Inc., Уилмингтон, Делавэр, США) и его целостность была подтверждена с помощью электрофореза в агарозном геле.
<Р> Образцы retrotranscribed и ПЦР в реальном времени проводили в течение анализ белков желудка. В кратком изложении, 0,25 мкг общей РНК (в конечном объеме 5 мкл) денатурировали при 65 ° С в течение 10 мин, а затем обратной транскрипции в кДНК с использованием MuLV обратной транскриптазы (Applied Biosystems, Madrid, Spain) при 20 ° С в течение 15 мин, 42 ° с в течение 30 мин и на конечной стадии 5 мин при 95 ° с в амплификатор (Applied Biosystems 2720 термоциклер, Мадрид, Испания).
<р> Каждый ПЦР проводили с разбавленным матрицы кДНК, прямого и обратного праймеров (5 мкм каждый) и мощности SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA, США). Праймеры были разработаны и получены от Sigma Aldrich Química SA (Мадрид, Испания) и последовательности описаны в таблице 1. ПЦР в реальном времени проводили с использованием Applied Biosystems StepOnePlus ПЦР в реальном времени системы (Applied Biosystems) со следующим шаблоном: 10 мин при 95 ° с с последующим в общей сложности 42 температурных циклов (15 с при 95 ° с и 1 мин при 60 ° C). Для проверки чистоты продуктов с усилителями, кривая плавления была произведена после каждого прогона в соответствии с инструкциями изготовителя. Пороговый цикл (Ct) рассчитывали с помощью программного обеспечения прибора (StepOne программного обеспечения v2.0), и относительное выражение каждого гена рассчитывали как процент от мышей NF, используя -ΔΔCt метод [38] 2-х. Бета-актин был использован в качестве контрольного гена.
Бактериальный профилирование КПЦР
, Clostridium leptum
и Lactobacillus
SPP. (Представители Firmicutes ); Bacteroides /Prevotella
(Bacteroidetes); Bifidobacterium
SPP. (Actinobacteria); Akkermansia muciniphila
(Verrucomicrobia); энтеробактерий
(Proteobacteria); и Всего Бактерии
были получены от Sigma (Мадрид, Испания). Всего бактерий
относится к универсальной грунтовки с широким диапазоном, который распознает консервативную область гена, кодирующего 16S рРНК для широкого спектра видов бактерий, и использовали для нормализации для анализа до полной бактериальной ДНК. Последовательности описаны в таблице 2. пороговый цикл был рассчитан с использованием 2 -ΔΔCt метод [38], и относительное содержание бактерий и сложить изменения (FC) вычисляли (Log <суб> 22 -ΔΔCt). Значения были нормализованы со средней группы NF.
Статистический анализ
<р> Данные представлены в виде среднего ± SEM. Равенство дисперсий между группами оценивали по критерию Levene в. Когда гомогенность дисперсий предполагалось, однофакторного дисперсионного анализа был использован для определения значимости различных параметров между группами. Если существует значительная разница, тест Бонферрони использовался, чтобы определить, где различие между ними заключается и скорректировать для многократного тестирования. Когда гомогенность дисперсий не предполагается, данные были преобразованы журнал. Линейные соотношения между ключевыми переменными были протестированы с использованием коэффициентов корреляции Пирсона. Порог значимости был установлен на уровне P < 0,05. Анализ проводился с помощью программы SPSS для версии Windows, 21,0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США).
Результаты
<р> Экспрессия белков, ассоциированных с энергетического метаболизма и регуляции потребления пищи определяли в желудке мыши. экспрессия мРНК лептина в HF группе не был изменен, однако лептин белок был увеличен у этих животных (в 2 раза по сравнению с НФ, р = 0,003). С другой стороны, добавки с CLA вызвало 6 раз более высокую экспрессию мРНК лептина (по сравнению с NF, р = 0,001), что было в соответствии с более высоким содержанием желудочного лептина (2-кратное, р = 0,014 против NF ) (рис 1А). CLA-кормили животных также показали повышенную экспрессию мРНК грелин (в 3 раза, р = 0,006 vs.NF), но никаких изменений не было замечено среди групп в отношении грелина белка (фиг.1В).
<Р> Кроме того, CLA добавок было связано к повышенной экспрессии всех белков в желудке, проанализированных и статистическая значимость достигалась в случае отталкивать (RETN) (3-кратное, р = 0,026), G-белком рецептор 39 ( Gpr39)
(4-кратный , р = 0,001), глюкагон ( GCG)
(2-кратный, 0,001) и рецептор глюкагона ( Gcgr)
(5-кратное, р = 0,011) (рис 1C).
<Р> Не было обнаружено никаких статистически значимых изменений в отношении содержания Firmicutes под различными диетическими лечения (рис 2В). подача HF в основном связано с уменьшением Bifidobacterium
SPP. (Р = 0,009 по сравнению с NF, с кратным изменением (Log <суб> 2 FC) от -3.07). CLA добавки не противодействовать этому снижению, представляя аналогичные значения (р = 0,034 по сравнению с NF; -2,18 Log <суб> 2 FC) (рис 2С). В отличие от этого, животные, получающие CLA показали значительное увеличение двух видов бактерий, представляющих интерес: Bacteroides /Prevotella
(р = 0,021 против NF; 1,30 Log <суб> 2 FC) (рис 2D) и
. muciniphila
, что резко увеличилось по сравнению с обеих NF (р = 0,014; 4,33 Log <суб> 2 FC) и HF (р = 0,002) (рис 2E). Нет существенных изменений на энтеробактерий
Профиль были замечены (рис 2F).
<р> Затем мы проверили гипотезу о том, что обилие специфических бактериальных видов в содержание слепая кишка мыши могут быть связаны с модуляцией веса тела и жировых отложений. С одной стороны, C
. coccoides
(г = 0,433, р = 0,044) и C
. leptum
(г = 0,488, р = 0,021), как принадлежащие к группе в Firmicutes ', показали положительную корреляцию с массой тела. Bacteroides /Prevotella
также показали положительную корреляцию (г = 0,581, р = 0,006) с массой тела. С другой стороны, жир тела отрицательно коррелировала с Bifidobacterium
SPP. (Г = -.547, р = 0,008). Корреляционная матрица представлена в таблице 3.
<р> Настоящее исследование предоставляет доказательства того, что CLA добавки под HF диеты оказывает заметное влияние на отдельных участках желудочно-кишечного тракта у мышей, за счет увеличения желудка экспрессии белка и стимулируя пребиотик эффект на микрофлоры кишечника. Учитывая, что желудочно-кишечный тракт объединяет взаимодействие пищи, микробиоты и метаболических эффектов на хосте, эти результаты могут быть важны для разработки стратегий управления весом, так как CLA являются соединения, используемые для уменьшения жировой массы в организме человека [10-13] .
<р> Gut гормоны выделяются в желудке в ответ на прием пищи и играть ключевую роль в передаче сигналов приема пищи в мозг [41]. Лептин и грелин представляют собой два из наиболее изученных белков, участвующих в энергетическом обмене, причем оба они секретируются в соответствующем количестве по слизистой оболочке желудка [42-47]. В соответствии с уровнями мРНК лептина, также наблюдалось выше желудка содержание белка, который в соответствии с повышением уровня лептина в плазме, описанных в этих животных [35]. Ранее было описано, что с высоким содержанием жиров кормления стимулирует путь желудка сигнализации лептина [44], эффект, который не будет нейтрализована CLA и будет способствовать частично объяснить, почему никаких различий не было замечено в отношении приема пищи в этой экспериментальной установки [35 ]. С другой стороны, ген грелина является кишка orexigenic гормон, который регулирует в основном за счет подачи [48], и хотя экспрессия мРНК увеличилась с CLA, уровни белка грелина не были изменены. Расхождения, наблюдаемые между экспрессии мРНК и уровня белка было бы связано с наличием суточных ритмов, описанных в обоих грелина и лептина в желудочном среде, которые позволяют лучше метаболического контроля [49]. В дополнение к этим основным желудочных белками, мы провели анализ грелина о-ацилтрансферазы ( Mboat4)
, резистин и Gpr39
, а также глюкагон, соматостатин и их рецепторы, белки, которые также занимаются энергетический баланс и описаны в слизистой оболочке желудка [50-56], хотя их потенциал в управлении весом не было тщательно изучено. В этом контексте <ЕМ> Mboat4
представляет особый интерес, поскольку он является ферментом, ответственным за ацилирования грелина [56] и активируется с помощью пищевых липидов, которые действуют в качестве ацилирующих субстратов [57]. Интересно отметить, что все белки, проанализированных показали повышенную экспрессию с CLA добавок, предполагая, что CLA-изомеры конкретно ощущаемый генов, кодирующих белки, желудочный, которые реагируют на пищевые сигналы.
<Р> В дополнение к вышеупомянутым эффектам, КЛК способствовали изменения в диалоговом окне кишечную флору из нижней части желудочно-кишечного тракта. В последние годы было высказано предположение, что в ожирением штатах существует повышенный коэффициент Firmicutes к Bacteroidetes, а также потеря бактериального разнообразия [26-28], хотя в настоящее время больше внимания делается на бактериальных видов, для хозяина метаболизма характеристики, как новый данные появляются, (обсуждается в недавнем обзоре [58]). Ни CLA добавки, ни HF диета в одиночку было связано с изменениями среди видов бактерий в филюма Firmicutes. Тем не менее, HF подача опускают Bifidobacterium
SPP., В соответствии с предыдущими исследованиями на животных [59-62], сокращение которых не противодействует CLA. Учитывая добавок был не в состоянии восстановить нормальный вес тела [35], положительная связь с массой тела были найдены для обоих C
. coccoides
и C
. leptum
, в согласии с потенциально вредном роли этих видов бактерий на ожирение [33, 63, 64], а также отрицательная корреляция с Bifidobacterium
SPP., Ассоциация, которая имеет также были ранее найдены в обеих моделях на животных и человека исследований [60-63].
<р> в отличие от CLA индуцированного пребиотик эффект в дополненной животных. Bacteroides /Prevotella
является виды бактерий, как известно, используют пищевые полисахариды в пребиотической моды [65]. Замечательным увеличение было найдено под CLA добавок предполагая, что CLA был способен придать пребиотик эффект. Это подтверждается очень высокой индукции A
. muciniphila
рост на CLA. Наличие этого муцин-разрушающей видов бактерий, который находится в слизистого слоя, связан со здоровой слизистой и, как правило, уменьшается с ожирением состояний [66-68]. Эверард и др. [69] недавно показали, что олигофруктозой реставраторов а
. muciniphila
содержание у тучных животных, и это связано с улучшением их метаболического профиля. Таким образом, увеличение слепой кишки содержание а
. muciniphila
найти в CLA добавок позволяет предположить, что это соединение оказывает пребиотиками действия по этому видов бактерий тоже. Насколько нам известно, это первое свидетельство о CLA-пребиотик эффект, благоприятствующие специфический рост потенциально полезных видов бактерий в кишечнике. Тем не менее, это увеличение и Bacteroides /Prevotella
и A
. muciniphila
не было достаточно, чтобы позволить полное выздоровление, так как эти животные остаются ожирением [35]. Мы не можем исключить, что более высокая доза CLA и /или более длительное лечение, которое обычно ассоциируется с более экономной фенотипа [70], приведет к еще большему увеличению A
. muciniphila
содержание и имеют более существенное влияние на метаболические показатели. Это согласуется с нижней индукции A
. muciniphila
найдено в настоящем исследовании, по сравнению с другими [69, 71].
и A
. muciniphila
, предлагает CLA дает пребиотик эффект, который мог бы способствовать более здоровой метаболического профиля. Кроме того, и тщательное исследование, каким образом конкретные диетические методы лечения влияют определенные физиологические компоненты, такие как желудочно-кишечного тракта, поможет выяснить их влияние на определенных условиях, таких как ожирение, а также разработать эффективные стратегии управления веса тела.
Поддержка информации <бр> S1 Таблица. Подробный состав диет
Состав нормальных и высоким содержанием жиров диеты, используемых на протяжении всего эксперимента
DOI:.. 10.1371 /journal.pone.0125091.s001
(DOCX)
<р> Мы благодарим Сару Laraichi (Лаборатория калориметрии и материалов, факультет наук, Абдельмалек Essaâdi университет, 93030 Тетуан, Марокко) за ее помощь в уходе за животными и сбор образцов во время ее пребывания в нашей лаборатории.
Исследования смотрят на аэробиомы,
Западная диета может увеличить риск «смертельного сепсиса»,
Электронная таблетка для обнаружения газов для диагностики желудочно-кишечных заболеваний
Микробиом человека сокращает гликаны слизистых оболочек,
Пробиотики могут иметь терапевтические преимущества для пациентов с биополярным расстройством.
Математическая модель выявляет риск заражения SARS-CoV-2 после трансплантации фекальной микробиоты
Бактерии кишечника могут предсказать риск легочной гипертензии
Группа исследователей обнаружила, что микрофлора бактерий в кишечнике человека может способствовать развитию легочной артериальной гипертензии (ЛАГ). Исследование под названием, «Измененный профиль ки
Дисбиоз микробиоты кишечника может вызвать тяжелую вторичную инфекцию у пациентов с COVID-19
Интересное исследование, проведенное учеными из США, недавно показало, что микробное сообщество в кишечнике напрямую поражено тяжелым острым респираторным синдромом, коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), и чт
Распространение супербактерии E. coli из-за плохой гигиены туалета,
не через еду Новое исследование опубликовано в Ланцетные инфекционные болезни 22 октября, 2019, говорит, что одна распространенная супербактерия вызывает более 5, 000 случаев пищевого отравления в А