Har överföring av Helicobacter pylori från människor orsakar sjukdomsutbrott i en koloni av Stripe-faced Dunnarts (Sminthopsis macroura)?

gjorde överföring av Helicobacter pylori
människor orsakar sjukdomsutbrott i en koloni av Stripe-faced Dunnarts (Sminthopsis macroura
)? Bild Sammanfattning
Sedan upptäckten att Helicobacter pylori
orsakar en rad sjukdomar i magen på infekterade människor, har det blivit uppenbart att Helicobacters
finns i en rad olika djur arter där de ofta förknippas med sjukdomen. Under 2003 och 2004 fanns det två utbrott av ökad dödlighet i samband med magblödning och viktminskning i en företagsintern koloni av den australiensiska pungdjur, den Sminthopsis macroura (Sminthopsis macroura
). Närvaron av gastric patologi ledde till en undersökning av potentiella Helicobacter
patogenes i dessa djur. Histologisk undersökning avslöjade närvaron av gastrit, och PCR-analys bekräftade närvaron av Helicobacter
infektion i magen på dessa pungdjur. Överraskande, sekvensering av 16S rRNA från dessa bakterier identifierat arten som H. pylori Mössor och PCR bekräftade stammen att vara positivt för den viktiga patogenesen faktor, cagA
. Vi har därför beskriver för första gången, en uppenbar omvänd zoonotisk infektion av Stripe-faced Dunnarts med H. pylori
. Redan benägna att patologiska effekterna av stress (som erfarna under avelssäsongen) visas samtidig H. pylori
infektion vara en möjlig nödvändig men inte tillräcklig co-faktor i prototypisk magblödning och viktnedgång hos dessa pungdjur. Den Sminthopsis macroura kan representera en ny modell för att undersöka Helicobacter
driven gastric patologi. Infektioner från sina mänskliga hanterare, särskilt H. pylori
kan vara en potentiell risk för fångenskap kolonier av pungdjur.
Introduktion
Upptäckten av Helicobacter pylori
så småningom ledde till en insikt om att infektion av human mage med denna bakterie är en nyckel etiologisk faktor i utvecklingen av magsår och gastriskt adenokarcinom [1-3]. En annan viktig konsekvens av denna upptäckt har varit den efterföljande identifieringen av en ständigt växande, till synes överallt familj av Helicobacter
arter som infekterar mag-tarmkanalen av praktiskt taget alla djur undersökts. I själva verket är många Helicobacter
infektioner tros vara patogena och möjligen ansvarig för ett brett spektrum av förhållanden i ett stort antal djurarter (översikt i [4, 5]). Till exempel har naturliga Helicobacter
infektioner har kopplats med gastrit i små och stora katter, hundar, grisar och illrar [6-10], abort hos får [11], kolit och hepatit i rhesusapor [12], sår i delfiner och valar [13] och diarré hos katter och papegojor [14, 15].
i denna rapport beskriver vi två utbrott av dödsfall i fångenskap koloni av en australisk pungdjur, den sminthopsis macroura (sminthopsis macroura
), som var förknippade med blödningar i magen möjligen på grund av infektion med humant patogen, H. pylori
.
Material och metoder
Stripe-faced dunnarts sälja The Stripe belagda dunnarts inkvarterades på Zoologiska institutionen, University of Melbourne. Kolonin hölls i burar upprätthålls inom ett specialbyggt temperaturreglerad byggnad, i en fysisk miljö under förhållanden som är typiska för de för bostäder möss, förutom att naturligt ljus bibehölls. Djurstallar i specialdesignade burar, kosten formulerade för köttätande insekts pungdjur och reproduktiv övervakning följde konturerna ges tidigare [16]. Inga andra djurarter inhystes i denna byggnad. De dunnarts lämnades vatten efter behag. Inga dunnarts dödades speciellt för denna studie; Magarna endast samlats in från djur avlivades antingen på grund av sjukdom eller andra experiment som godkänts av University of Melbourne Science, Optometry & Vision Sciences och Land & Miljö djur etik-kommitté. Djuren vägdes med veckointervall under rutin djurhållning
Rapid ureastest (CLO-test) Review Mage biopsier av 1-2 mm placerades i gelén av en snabb ureastest (CLOtest;. Kimberly-Clark, Roswell, Georgia, USA). Tester övervakades under en 24 h period för en färgförändring från gult till rött, som indikerade närvaron av en ureasproducerande organism i magen.
Histologisk bedömning av patologi
Mage halvor fixerades i 10% neutral buffrad formalin , inbäddades i paraffin, därefter 4 | j, m tjocka sektioner skars och färgades med hematoxylin och eosin.
Detektering av Helicobacter
infektion av genusspecifika PCR
för bedömning av Helicobacter
infektion genom PCR, avföring var samlas in, eller sminthopsis magar öppnades längs den inre krökningen och hela organ homogeniserades (GmbH Polytron homogenisator, Kinematica, Schweiz). Slemhinnor skrapades också in från tarmen (stora och små). DNA extraherades från avföring och tarmskrapningar med hjälp av en QIAamp pall DNA kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), och från den homogeniserade magen med användning av QIAamp vävnads DNA-kit (Qiagen) i enlighet med tillverkarens instruktioner. En Helicobacter
släktet PCR riktar en 374 bp fragment av 16S rRNA-genen utfördes som beskrivits tidigare [17].
Approaches att odla sminthopsis gastric Helicobacter
sminthopsis magar uppsamlades och homogeniserades i Brain Heart infusionsbuljong (BHI, Oxoid, Basingstoke, UK). Homogenat sattes till hästblodagar eller GSSA plattor (såsom beskrivits tidigare [18]), som inkuberades i en anaerob burk med ett mikroaerofil gasalstrande kit (Oxoid, Basingstoke, UK) i upp till 10 dagar vid 37 ° C. För filtrering teknik, var homogenat placerades på 0,65 | im Whatman filterpapper (GE Healthcare, Rydalmere, Australien), placeras på HBA-plattor och inkuberades vid 37 ° C under mikroaerofila betingelser i 2 timmar. Filtren avlägsnades därefter och plattorna inkuberades vid 37 ° C under mikroaerofila betingelser i upp till 10 dagar.
Gene sekvensering av 16S ribosomalt RNA
, cagA
och urea
Nine DNA-prover extraherade från sminthopsis mag- och tarmskrap utsattes för sekvensering. PCR för Helicobacter
gener utfördes såsom tidigare beskrivits för 16S rRNA
[17], cagA
[19] och urea
[20]. DNA-sekvensering av de positiva PCR-produkterna gjordes med hjälp av BigDye terminator kemi (Applied Biosystems, Foster City, USA). Sekvensering av både 5'- och 3'-änden av amplikonema inträffade i en volym av 20 mikroliter bestående av 3,5 mikroliter sekvense buffert, 1 | il BigDye v3.1, 10 pmol /mikroliter av den erforderliga primer, 40-100 ng DNA, och vatten för att ge den slutliga volymen. Sekvensprogrammet bestod av 96 ° C under 1 min, 30 cykler av 96 ° C under 10 sekunder, 50 ° C under 5 min och 60 ° C under 4 min. . Sekvenserna jämfördes med gensekvenser av kända identiteter med hjälp av BLASTN sökprogram tillgänglig genom National Centre for Biotechnology Information (NCBI) webbplats [21]
Resultat
Dödsfall i Sminthopsis macroura koloni - 2003
En koloni av Stripe-faced Dunnarts har funnits i 26 år, först vid La Trobe University (Melbourne, Australien), och sedan vid Zoologiska institutionen, University of Melbourne. Kolonin har normalt mellan 60-100 djur där könsfördelningen är 1/1. Död från sjukdom är sällsynt i dessa djur och under ett normalt år, det totala antalet dödsfall inträffar vid en hastighet av ca 10% eller mindre av antalet djur i kolonin. De flesta dödsfallen inträffar till följd av skador som erhållits under parning (häckningssäsongen sträcker sig från juli till december) eller ålderdom.
År 2003 fanns dock en dramatisk ökning av dödligheten i dessa djur, med 29% av Dunnarts (30/104, liknande antal hanar och honor) dör i 6 månader från juli till december. Den döende djur var 1-2 år gamla och dödsfall inte relaterade till ålderdom. Dunnarts förlorar vanligtvis kroppsvikt under häckningssäsongen och denna viktminskning också särskilt ökade under 2003. Man Dunnarts typiskt förlorar i genomsnitt 12% av kroppsvikten från juli till december men i 2003 de förlorade ett genomsnitt 27,7%. På samma sätt kvinnliga Dunnarts förlorade ett genomsnitt 30,3% under samma period 2003, jämfört med en typisk genomsnittlig förlust på 16%. Figur 1 visar den relativa viktminskning observerades av dessa Dunnarts 2003, jämfört med viktminskning observerades i 2006, ett typiskt år då det inte fanns någon ökad dödlighet. Figur 1 Ökad förlust i kroppsvikt i Sminthopsis macroura under sjukdomsutbrott. Värden visas närvarande den genomsnittliga förändringen i kroppsvikt ± S.E.M. av Stripe-faced Dunnarts under juli-december (beräknat som vikten av enskilda djur i september och december i procent av sin vikt i juli). Data som visas är från ett år av sjukdomsutbrott (2003; n
= 25) och ett normalår då ingen ökad dödlighet observerades (2006; n
= 35). Både män och kvinnor ingår och data kombineras, eftersom båda könen förlorade liknande kroppsvikter. Det fanns ingen signifikant skillnad i kroppsvikt i september 2003 och 2006. Men djuren förlorade betydligt mer i vikt under perioden fram till december 2003 jämfört med samma period 2006 (* p Hotel < 0,001; ANOVA).
endast uppenbar patologi observerades vid obduktion var att nästan hälften av de djur som dött eller avlivades på grund av att mycket sjuk hade svår magblödning. Bortsett från ökad viktminskning, de flesta djur verkade frisk förrän 1-2 dagar före döden, även om några hade svart avföring (i enlighet med gastrointestinal blödning) och tecken på anemi (bleka nosar och tandkött).
Dödsfall i en Stripe-faced sminthopsis koloni - 2004
magblödning närvarande i dessa djur som uppfötts möjligheten att magsår som en följd av Helicobacter
infektion. Därför, i maj 2004 var magar från två asymtomatiska kvinnliga Dunnarts testas för Helicobacter
infektion med hjälp av CLO-test. Dessa visade sig vara positiv, stödjande av en gastric Helicobacter
infektion. Histologisk analys av dessa magar avslöjade närvaron av en relativt mild inflammatorisk process, präglad av lymfoida aggregat i lamina propria (Figur 2), även om inga koloniserande bakterier i antingen spiral eller kockoida formen kunde observeras i dessa avsnitt. Ingen allvarlig patologi var tydligt i dessa särskilda avsnitt, även om dessa magar samlades utanför häckningssäsongen när ökad dödlighet och magblödning inte förekommer. Figur 2 Inflammation i mag lamina propria av en Helicobacter infekterade sminthopsis. En bild visas från en H & E färgade delen av magsäcken corpus, från en Helicobacter
infekterade sminthopsis (förstoring x 100). Magen samlades i maj 2004.
Mellan juli och december 2004 andra incident av ökad dödlighet inträffade, med 24 av 81 (30%) av sminthopsis kolonin dör, varav 6 hade magblödning.
flera fall under 2003 och 2004, till honor som ansågs vara gravid från reproduktiv övervakning hade avbrutits kullen när de undersöktes för att erhålla embryon.
Helicobacter
infektion i sminthopsis kolonin 2005-2008
2005 och under de följande åren, återvände dödligheten till normala nivåer (~ 10% per år) och inga ytterligare fall av magblödning observerades. Men sporadiska försök gjordes för att ytterligare undersöka den skenbara gastric Helicobacter
infektion i dessa djur. Dessa försök begränsades av tillgången på djur för sådana studier.
2006, förekomst av Helicobacter
i avföringsprov som samlats in från manliga (n
= 20) och kvinnor (n
= 20) Dunnarts bedömdes av genus specifika PCR. Med hjälp av denna metod, avföring från motsvarande antal manliga (7/20) och kvinnliga (7/20) Stripe belagda Dunnarts visades koloniseras med Helicobacter
arter, vilket ger bevis på förekomst av Helicobacters
i Gl-kanalen av åtminstone några djur i denna koloni. Försök att odla Helicobacter
dessa prover misslyckades.
I juli 2007, magar och tarmskrap samlats in från Dunnarts analyserades genom genus-specifik PCR. Dessa visade att 10/12 av de undersökta djuren hade gastric Helicobacter
infektion. Återigen, försök att odla Helicobacter
mag prover misslyckades.
Arter identifiering av Helicobacter
infektion i sminthopsis magen
att avgöra om en känd eller ny Helicobacter
arter var infektera Stripe -faced sminthopsis koloni, 16S ribosomalt RNA
(rRNA) Helicobacter
genen från dessa mag prover delvis sekvenserats. Detta indikerade att 16S rRNA
gensekvensen av Helicobacter
infecting magarna hos Stripe-faced Dunnarts motsvarade H. pylori
stammar isolerades ursprungligen från olika regioner i mag- och tarmkanalen inkluderande magsäcken och tarmen. Identitets procentsatser som erhölls med de sekvenserna var 100% (tabell 1) .table en BLASTN hämtning av Helicobacter pylori-gensekvenser
BLASTN Hämta
antal GenBank anslutning
Score (bitar)
identitet
E-värden
Helicobacter pylori
klon P13 16S ribosomalt RNA
gen
EF684928.1
699
100%
0,0
Helicobacter pylori
stam CD2 16S ribosom RNA
gen
HM243132.1
699
100%
0,0
Helicobacter pylori
stam HP504 16S ribosomalt RNA
gen
GU449115.1
695
100%
0,0
Helicobacter pylori
v225d 16S ribosomalt RNA
gen
CP001582.1
695
100%
0,0
Helicobacter pylori
stam 407D5 16S ribosom RNA
gen
HM099656.1
695
100%
0,0
Helicobacter pylori
stam 15818 cytotoxin associerat protein III (cagA
) -genen
AF083352.1
1288
96%
0,0
Helicobacter pylori
NCTC 11639 CagA (cagA
) -genen
GQ161099 0,1
1282
96%
0,0
Helicobacter pylori
stam 114C urea ( urea) genen
GQ403154.1
630
96-98%
3e-164 1e-177
Helicobacter
genus-specifika PCR-produkter som härrör från sminthopsis gastric DNA extrakt jämfördes med H.pylori
Genbank-sekvenserna listade i tabellen. De sminthopsis prover uppvisade 100% sekvensidentitet med 16s rRNA från fem humana kliniska isolat av H. pylori
, och 96-98% sekvensidentitet med cagA och urea
från två humana kliniska isolat av H. pylori
.
viktiga H. pylori
virulensfaktor CAG
PAI (CAG
patogenicitet ö) kodar för en typ-IV sekretionssystem som omfattar cagA. Inte alla H. pylori
stammar har denna virulensfaktor, och individer infekterade med cag
PAI positiva stammar utvecklas vanligtvis allvarligare gastrit, och har en kraftigt ökad risk för att fortskrida till sjukdom. Ureas, ett enzym som består av två subenheter UREA
och ureB
, är väsentlig för patogenesen av H. pylori
i den mänskliga magen på grund av dess förmåga att neutralisera magsyra genom produktion av bikarbonat. Analys med hjälp av specifika PCR-primers visade att den infekterande Helicobacter
var cagA och urea
positiv, och gensekvenser visade 96% identitet med cagA Mössor och 96-98% identitet med urea
H . pylori
(tabell 1).
naturlig förlust av H. pylori
infektion i sminthopsis macroura koloni
När prover samlades in från 18 kvinnliga Dunnarts i juli 2008 överraskande, alla dessa djur var Helicobacter
negativa indikerar kolonin hade förlorat infektionen. Det finns ingen uppenbar förklaring till förlusten av H. pylori
infektion i dessa djur, eftersom det inte fanns någon förändring i djurhållning, inte heller var de Dunnarts behandlats med antibiotika under denna period.
För tydlighetens skull en kronologi av över händelser sammanfattas i tabell 2. sminthopsis kolonin i Zoologiska institutionen vid University of Melbourne stängdes 2009, utgör hinder för ytterligare study.Table två händelse~~POS=TRUNC
Datum
händelse
juli-dec 2003
Ökad dödlighet observerades i sminthopsis koloni med magblödning.
maj 2004
Två sminthopsis magar testades och visade sig vara Helicobacter
positivt av CLO-test. Histologi visade mild gastrit.
Juli-december 2004
Ökad dödlighet observerades i sminthopsis koloni med magblödning.
2006
sminthopsis avföring visat sig vara Helicobacter
positiva med PCR.
2007
sminthopsis magar visat sig vara Helicobacter
positiva med PCR. Infektionen visades vara H. pylori
genom partiell sekvensering av 16S rRNA
, cagA
och urea
.
2008
sminthopsis koloni visades vara Helicobacter
negativa med PCR av gastric vävnader.
Diskussion
Två utbrott av ökad dödlighet i en koloni av den australiensiska pungdjur, den sminthopsis macroura 2003 och 2004 var associerade med gastrisk blödning och inträffade sammanfaller med en övergående infektion av magar djur i denna koloni med human patogen, H. pylori
. Noterbart är här infekterande stam besatt virulensfaktor cagA
, vilket tyder på förekomsten av CAG
PAI typ-IV sekretionssystem, i samband med en ökad risk att utveckla magcancer eller magsår hos människor. Medan endast fem av de nio sminthopsis analyserade proverna var cagA och urea
positiva
kan detta förklaras av den låga mängden av Helicobacter
DNA i dessa prover, även om möjligheten av heterogenitet i de infekterande stammar inte kan vara uteslutas.
det var olyckligt att vi inte kunde odla Helicobacter
från sminthopsis magar, eftersom det kan ha gett oss möjlighet att studera nivån av heterogenitet, om några, av dessa bakterier i kolonin. De första försöken att odla Helicobacter
utfördes i Perth, Western Australia, på prover som skickas från Melbourne. Förseningen orsakas av insamling och överföring av dessa prover kan ha begränsat vår förmåga att isolera de infekterande bakterierna. Men i senare studier vi försöka odla dem från färska gastric vävnad. Försök på färsk vävnad med hjälp av HBA plattor misslyckats, inte alltför överraskande, på grund av svamp överväxt. När selektiva GSSA plattor användes, gjorde vi lyckas initialt kulturen en rörlig bakterie, men det var senare övervuxen av en kockoida organism. Vi försökte nästa en filtrerings tillvägagångssätt som framgångsrikt begränsad förorening av kockoida organismen, men tyvärr också inte tillåter oss att isolera Helicobacter
. Detta kan tyda på Helicobacter
närvarande i de Dunnarts antingen hade dålig motilitet (en viktig egenskap som krävs för migrering av bakterier genom filtret papper) eller endast var närvarande i låga halter.
Som H. pylori
infektion gör inte vara en del av den normala floran av dessa djur (som det spontant rensas mellan 2007 och 2008) vi teoretiserar att H. pylori
kan ha angett denna koloni som en infektion från sina mänskliga hanterare. Samtidig förekomst av magen infektion med H. pylori-delar på tiden för magblödning incidenter antyder starkt denna bakterie kan ha bidragit till sjukdomsutbrottet. Tydligt, H. pylori
infektion enbart var otillräcklig för att orsaka utbrott som infektionen var närvarande under 2005-2007 utan någon ökning av dödligheten. Det kan dock mycket väl ha varit en viktig co-faktor i denna process.
Förlusten av H. pylori
infektion mellan 2007 och 2008 är spännande, med anledningen till den återstående okänd händelse. Med tanke på Helicobacter
var närvarande vid åtminstone tre år, var det inte ett kortsiktigt fenomen men var närvarande under många fortplantningscykler. Det förefaller därför osannolikt att förlusten av denna infektion berodde på Helicobacter
att konkurreras ut av inhemska floran, även om man inte kan utesluta denna möjlighet. Det är också möjligt att djuren inte överföra smittan mellan sig, men kanske var ständigt infekteras av en mänsklig hanterare. Om så vore fallet, kan förlusten av infektion ha berott på en förändring i hanterare mellan 2007 och 2008 bryter infektionen överföring. Påfrestning verkar ha varit en viktig co-faktor i sjukdoms etiologi, som utbrotten inträffade under häckningssäsongen i dessa djur. Häckningssäsongen är extremt påfrestande för både manliga och kvinnliga Dunnarts, och ett genomsnittligt år, åtföljs av en avsevärd förlust i kroppsvikt. Pungdjur kan vara anmärkningsvärt känsliga för stress, och det har visat sig att stresshändelser kan ha en stor inverkan på deras immunsystem [22].
Trots detta, måste det finnas en annan sam- eller orsakande faktor involverad i 2003-2004 utbrott, som Dunnarts uppfödda medan infekterade med H. pylori
under 2005-2007 utan någon ökning av dödligheten. Detta co-faktor förblir oidentifierade, men verkar inte vara något med anknytning till djurhållning som det fanns inga förändringar i bostadsförhållanden kolonin som var förknippade med antingen sjukdomsutbrott eller förlust av H. pylori
infektion.
Sammanfattningsvis föreslår vi att infektion med humant patogen H. pylori
kan ha varit en viktig, men inte tillräcklig co-faktor i ett utbrott av magblödning leder till döden i en koloni av Stripe-faced Dunnarts. Den skenbara oavsiktlig infektion av dessa pungdjur av sina mänskliga hanterare, och föreningen med tillfällighet gastric patologi, tyder på att dessa djur kan ge en intressant ny djurmodell för studier av H. pylori
patogenes. Vidare föreslår denna observation en potentiell riskfaktor för fångenskap pungdjur till infektioner av sina mänskliga hanterare.
Förklaringar
Tack
Författarna har inga konkurrerande intressen. Vi erkänner stöd av Kamani Nanayakkara, Phil Au, Angela Nation och Ellen Menkhorst för djurhållning och hjälp med insamling av prover. Kolonin stöddes genom finansiering från Nya Zeeland Stiftelsen för vetenskap och teknik.
Författarnas ursprungliga inlämnade handlingarna Images of Nedan finns länkar till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 13567_2010_22_MOESM1_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 1 13567_2010_22_MOESM2_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 2 Konkurrerande intressen
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

• Karakterisering av humant gastric carcinoma relaterade metylering av 9 miR CpG-öar och förtryck av deras uttryck in vitro och in vivo
• Effekter av glukosberoende insulinotropisk polypeptid på magsäckstömning, glykemi och insulinaemia under kritisk sjukdom: en prospektiv, dubbelblind, randomiserad crossover-studie